免疫沉淀類實(shí)驗(yàn)

1、免疫沉淀類實(shí)驗(yàn)?zāi)先A大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與放射衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心南華大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)與放射衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 教學(xué)對象：高等醫(yī)學(xué)院校衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生教學(xué)對象：高等醫(yī)學(xué)院校衛(wèi)生檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生 實(shí)驗(yàn)課時：實(shí)驗(yàn)課時：6 6學(xué)時學(xué)時 課程類型：專業(yè)實(shí)驗(yàn)課課程類型：專業(yè)實(shí)驗(yàn)課 課程要求：必修課程要求：必修 每組人數(shù)：每組人數(shù)：2 2人人實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求掌握單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、對流免疫電泳的原理、結(jié)果分析及應(yīng)用； 熟悉火箭免疫電泳、免疫電泳的原理及應(yīng)用。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對流免疫電泳對流免疫電泳示教：示教：火箭免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳免疫電泳一

2、、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理： 將適量的抗體均勻混入瓊脂內(nèi)制成瓊脂板，打孔，在孔中加入一定量的待測抗原，抗原向四周呈輻射狀擴(kuò)散，與抗體相遇，在比例合適時形成白色沉淀環(huán)沉淀環(huán)直徑的大小與抗原含量成正比，可從用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線上，查出待檢樣品中抗原的含量。 一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 試劑與器材試劑與器材 商品IgG、IgM、IgA單向瓊脂擴(kuò)散板； 37恒溫箱、濕盒、可調(diào)微量加樣器等； 待檢血清。 方法方法 分別取商品IgG、IgM、IgA單向瓊脂擴(kuò)散板1塊，按說明書操作。 用微量加樣器分別準(zhǔn)確吸取不同稀釋度待測血清10mL加于孔內(nèi)。 將瓊脂板放入濕盒中，置于3

3、7恒溫箱擴(kuò)散24小時。一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：加樣量一定要精確，并且不同逸出孔外，否則結(jié)果不好觀察；實(shí)際檢測過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線必須與樣品測定同時制備。一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)n 結(jié)果觀察結(jié)果觀察分別量取各孔樣品沉淀環(huán)的直徑，從相應(yīng)說明書提供的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢血清中各種免疫球蛋白的含量。二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)n 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理：在含有電解質(zhì)的瓊脂中，抗原抗體分子互相彌漫擴(kuò)散，當(dāng)比例合適時可出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀線。沉淀線的形狀、位置，與抗原的濃度、擴(kuò)散速度相關(guān)。 二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 試劑與器材 含

4、15g/L生理鹽水的瓊脂糖 待檢血清、抗人血清 載玻片、濕盒、吸管、打孔器、37恒溫箱、可調(diào)微量加樣器等n方法制板制板：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理鹽水的瓊脂糖，于一潔凈的載 玻片；打孔：打孔：待瓊脂板凝固后，用直徑3mm的打孔器打孔，每孔之間的距離約4 5mm，根據(jù)需要，可打成呈梅花狀、三角狀的孔；加樣：加樣：用可調(diào)微量加樣器根據(jù)需要在不同孔內(nèi)加入待檢血清和抗人血清10mL；擴(kuò)散：擴(kuò)散：將瓊脂糖凝膠板放濕盒中，置37溫箱中24h后，取出觀察結(jié)果。二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：加樣量一定要精確，并且不同逸出孔外，否則結(jié)果不好觀察；制板時，玻片要清潔

5、，邊緣要整齊，加瓊脂糖時要避免產(chǎn)生氣泡；打孔時注意避免產(chǎn)生裂縫或?qū)傊c玻片脫離。二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果觀察：結(jié)果觀察：沉淀線的位置、數(shù)目與形狀等。圖4 抗原特異性與沉淀線形狀的關(guān)系a、b：抗體 A、A、B：抗原A、B完全不同 A、A部分相同三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳建立在雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過電流，使建立在雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過電流，使蛋白質(zhì)抗原、抗體在電場中作定向加速度雙擴(kuò)散，蛋白質(zhì)抗原、抗體在電場中作定向加速度雙擴(kuò)散，從而加速沉淀的形成。從而加速沉淀的形成。 n 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理：在一定的離子強(qiáng)度、pH8.4以上的緩沖液中，大多數(shù)抗原解離帶負(fù)電

6、，在電場中向陽極移動，而抗體大部分是IgG，其等電點(diǎn)與環(huán)境中的pH接近，很少解離。另外，由于分子量大，加上電滲作用緩慢向陰極移動，在短時間內(nèi)，在兩孔之間或抗體另一側(cè)形成沉淀線。 三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳 試劑與器材試劑與器材1.5%巴比妥緩沖液瓊脂糖 待檢血清、抗人血清 0.05mol/L pH8.6巴比妥緩沖液 載玻片、吸管、打孔器、可調(diào)微量加樣器、電泳儀、電泳槽等n方法方法制板制板：用510mL吸管吸取溶化的含15g/L生理鹽水的瓊脂糖，于一潔凈 的載玻片；打孔：打孔：待瓊脂板凝固后，用直徑3mm的打孔器打孔，每孔之間的距離約 45mm，根據(jù)需要，可打成呈梅花狀、三角狀的孔；加樣：

7、加樣：在孔中相向加入10mL抗原和抗體 ；電泳：電泳：將抗原置于陰極側(cè)，抗體置于陰極側(cè)， 以4V/cm電壓電泳30min1h。 三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳結(jié)果觀察：結(jié)果觀察：關(guān)閉電源，打開電泳槽，觀察沉淀線的位置、數(shù)目與形狀等。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：加樣量一定要精確，并且不同逸出孔外，否則結(jié)果不好觀察；制板時，玻片要清潔，邊緣要整齊，加瓊脂糖時要避免產(chǎn)生氣泡；孔距約0.5cm左右，太遠(yuǎn)看不到實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。三、對流免疫電泳三、對流免疫電泳示示 教教火箭免疫電泳火箭免疫電泳 將適量的抗體均勻混入瓊脂內(nèi)制成瓊脂板，冷凝后，在瓊脂板的一端打一排小孔，分別加入一定量的待測樣品進(jìn)行電泳。抗原在電泳過程中，與抗體相遇，在比例合適時可形成錐形沉淀峰，其形狀如火箭，故名火箭電泳?；鸺宓母叨扰c抗原含量成正比，以峰高為縱坐標(biāo)，已知的抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，就可知待檢樣品中抗原的含量。示示 教教免疫電泳：免疫電泳： 免疫電泳技術(shù)是利用蛋白質(zhì)分子