分離工程第六章

1、第六章第六章 色色 譜譜又稱層析或色層分離。屬高度純化技術(shù)。又稱層析或色層分離。屬高度純化技術(shù)。初步純化技術(shù)：初步純化技術(shù)：超濾，離心，沉淀，溶劑萃取，膜分離，吸附等。高度純化技術(shù)：高度純化技術(shù)：選擇性沉淀或結(jié)晶，電泳，絡(luò)合，層析等。對藥品，特別是注射用藥品和基因工程菌生成的產(chǎn)品，都需要高度純化。氣相色譜氣相色譜 液相色譜液相色譜 特點(diǎn)特點(diǎn)n分離精度高、設(shè)備簡單、操作方便。應(yīng)用應(yīng)用n物質(zhì)成分的定量分析與檢測；n生物物質(zhì)的制備、分離和純化。第一節(jié)第一節(jié) 色譜原理與分類色譜原理與分類一、原理一、原理根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度

2、的之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進(jìn)行分離的方法。不同而進(jìn)行分離的方法?；ゲ幌嗳艿膬上喾謩e稱為：固定相和流互不相溶的兩相分別稱為：固定相和流動相。動相。生物分離主要用柱層析，柱層析處理量生物分離主要用柱層析，柱層析處理量大。大。固定相分配系數(shù)大的后被洗脫。固定相分配系數(shù)大的后被洗脫。二、分類二、分類流動相與固定相流動相與固定相超臨界流體固定相層以固體為載體的液體薄液體固體液相氣相流動相固定相的形狀固定相的形狀柱層析薄層層析紙層析用于大量制備分離多用于分析壓力壓力n以固體為固定相的液相柱層析中，根據(jù)操作壓力的不同分為： 流動相流動方向流動相流動方向 軸向流層析 徑向流層析w優(yōu)點(diǎn)：規(guī)模放大

3、容易；柱效率高。w缺點(diǎn)：柱設(shè)備造價(jià)較高。MPaMPaMPa400 . 40 . 45 . 05 . 0高壓中壓低壓主要用于成分分析常用于大量制備分離分離操作方式分離操作方式根據(jù)分離操作方式不同分為:頂替展開迎頭分析洗脫展開洗脫展開（洗脫層析）洗脫展開（洗脫層析）料液中的溶質(zhì)根據(jù)其在固定相和流動相間分配行為的不同，在層析柱出口處被展開形成相互分離的層析峰。迎頭分析（前流分析法）迎頭分析（前流分析法）將混合物溶液（料液）連續(xù)通過色譜柱，只有吸附力最弱的組分以純品狀態(tài)最先自柱中流出，其它各組分都不能達(dá)到分離。色譜峰呈階梯式頂替展開頂替展開利用一種吸附力比各被吸附組分都強(qiáng)的物質(zhì)來洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替

4、劑。頂替劑將料液中所含溶質(zhì)按其與固定相親和力的大小不同從柱中次序頂替出來。頂替展開頂替展開可以選用不同的洗脫方案最簡單的是無梯度洗脫：即在整個(gè)色層分離中，使用一種恒定組分的洗脫液（恒定的洗脫能力）。如果溶質(zhì)的特性非常相似或非常不同這種形式的洗脫很少用，這種情況，有一些組分會快速洗脫而另一些會強(qiáng)烈地阻滯。采用梯度洗脫（階梯式洗脫）：采用梯度洗脫（階梯式洗脫）：洗脫劑的洗脫能力可以連續(xù)或分段的提高。三種操作方法中，洗脫展開最常用。分配機(jī)理分配機(jī)理根據(jù)溶質(zhì)與固定相之間的相同作用機(jī)理，液相層析法可分為：HICRPCIECGFC疏水性相互作用層析反相層析離子交換層析凝膠過濾層析第二節(jié)第二節(jié) 凝膠過濾層析

5、凝膠過濾層析一、原理與操作一、原理與操作原理原理n利用凝膠粒子（凝膠過濾介質(zhì)）為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相層析法。操作操作n一般采用恒定洗脫法，即采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫展開。分子篩凝膠色譜原理二、凝膠過濾介質(zhì)二、凝膠過濾介質(zhì)對凝膠過濾介質(zhì)的要求對凝膠過濾介質(zhì)的要求n親水性高，表面惰性，即與溶質(zhì)不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；n穩(wěn)定性高，對pH、離子強(qiáng)度及化學(xué)試劑穩(wěn)定，使用壽命長；n具有一定的孔徑分布范圍；n機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力。常用商品化凝膠過濾介質(zhì)常用商品化凝膠過濾介質(zhì)n葡聚糖凝膠wSephadex G，傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)，目前仍廣泛使用，但機(jī)械強(qiáng)

6、度低。n瓊脂糖凝膠wSepharose，常用，但機(jī)械強(qiáng)度較低；wSepharose CL，用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備，機(jī)械強(qiáng)度較高；w此類凝膠經(jīng)化學(xué)修飾后用于IEC、HIC和AC。n其他wTSK凝膠，利用親水性高分子合成制備，機(jī)械強(qiáng)度較高，經(jīng)化學(xué)修飾后也常用于IEC和AC；wSuperdex凝膠，將葡聚糖共價(jià)交聯(lián)到高度交聯(lián)的瓊脂糖珠體上制備的剛性凝膠，分離精度高，用于高效液相層析；wSuperose凝膠，瓊脂糖經(jīng)二次交聯(lián)制備的剛性凝膠，常用于高效IEC和AC。凝膠特性參數(shù)凝膠特性參數(shù)n排阻極限：不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量。n分級范圍：可分離的溶質(zhì)的相對分子量范圍。n溶脹率：溶脹后

7、每克干凝膠吸收水分的百分?jǐn)?shù)。n凝膠粒徑：多用篩目或微米表示。粒徑越小，分離效率越高。軟凝膠粒徑較大，硬凝膠粒徑較小。n床體積：1g干凝膠溶脹后所占有的體積。n空隙體積：層析柱中凝膠之間空隙的體積。一般用水溶性藍(lán)色葡聚糖（2000KD）測定。三、應(yīng)用及特點(diǎn)三、應(yīng)用及特點(diǎn)應(yīng)用應(yīng)用n分離純化w用于分離的相對分子質(zhì)量范圍：幾百到106。w用于蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、抗生素、糖類、核酸及病毒等生物物質(zhì)的分離純化。w還可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中無熱原水的制備及低分子生物制劑中抗原性雜質(zhì)的除去。n脫鹽w生物分離中主要用于生物大分子溶液的脫鹽及除去小分子物質(zhì)。w還用于溶解目標(biāo)產(chǎn)物的緩沖液的交換。w凝膠主體還可以加入其它交換

8、基團(tuán)，如磺酸基，羧甲基，二乙基氨基乙基等，這些物質(zhì)既有分子篩效應(yīng)又具有一定的交換性能Desalting proteinsproteinssaltsn相對分子質(zhì)量的測定w在分級范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)（或洗脫體積）與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成正比.wm(v)=a-blgMr.w故GFC可用于未知蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定。特點(diǎn)特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)w采用恒定洗脫法，操作條件溫和，收率接近100；w介質(zhì)不需清洗或再生，易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；w脫鹽比透析速度快，精度高；比超濾剪應(yīng)力小，活性收率高；w分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，規(guī)模放大容易。n缺點(diǎn)w選擇性低，處理量??；w洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。第三節(jié)第三節(jié) 吸附與離子

9、交換吸附與離子交換1、吸附吸附：溶質(zhì)從液相或氣相轉(zhuǎn)移到固相的現(xiàn)象。活性炭：脫色，除臭等?；钚蕴糠Q吸附劑。吸附劑：多孔微粒。吸附劑對溶質(zhì)的吸附作用按吸附作用力區(qū)分主要有三類：物理吸附：吸附劑、吸附質(zhì)之間范德華力?；瘜W(xué)吸附：吸附劑、吸附質(zhì)之間化學(xué)鍵力。離子交換吸附（簡稱離子交換）：吸附劑為離子交換劑，離子交換劑表面含有離子基團(tuán)或可離子化的基團(tuán)，通過靜電引力吸附帶相反電荷的離子，吸附過程中發(fā)生電荷的轉(zhuǎn)移。離子交換的吸附可通過調(diào)節(jié)pH或提高離子強(qiáng)度的方法洗脫。有機(jī)高分子吸附劑：多孔性聚乙烯、多孔有機(jī)高分子吸附劑：多孔性聚乙烯、多孔性聚酯等樹脂具有大網(wǎng)絡(luò)細(xì)孔結(jié)構(gòu)，用于性聚酯等樹脂具有大網(wǎng)絡(luò)細(xì)孔結(jié)構(gòu)，用于

10、抗生素，維生素抗生素，維生素B12分離濃縮。分離濃縮。還有多孔性纖維素，瓊脂糖凝膠，葡聚還有多孔性纖維素，瓊脂糖凝膠，葡聚 糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，羥基磷灰石糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，羥基磷灰石(層析、電泳層析、電泳)。2、離子交換劑、離子交換劑分為陽離子交換劑分為陽離子交換劑 和和 陰離子交換劑陰離子交換劑陽離子有交換能力陽離子有交換能力 陰離子有交換能力陰離子有交換能力活性基團(tuán)為酸性活性基團(tuán)為酸性 活性基團(tuán)為堿性活性基團(tuán)為堿性根據(jù)有離子交換能力的根據(jù)有離子交換能力的pH范圍不同分為：范圍不同分為：強(qiáng)酸性、弱酸性陽離子交換劑強(qiáng)酸性、弱酸性陽離子交換劑強(qiáng)堿性、弱堿性陰離子交換劑強(qiáng)堿性、弱堿性陰離

11、子交換劑強(qiáng)離子交換劑的離子化率基本不受強(qiáng)離子交換劑的離子化率基本不受 pH值值影響，離子交換作用的影響，離子交換作用的pH范圍寬，弱離范圍寬，弱離子交換劑的離子化率受子交換劑的離子化率受pH值影響很大，值影響很大，離子交換作用的離子交換作用的pH范圍小。弱酸性陽離范圍小。弱酸性陽離子交換劑在子交換劑在pH值減低時(shí)，離子化率逐漸值減低時(shí)，離子化率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱，弱堿性降低，離子交換能力逐漸減弱，弱堿性離子交換劑在離子交換劑在pH升高時(shí)，離子化率逐漸升高時(shí)，離子化率逐漸降低，離子交換能力逐漸喪失。降低，離子交換能力逐漸喪失。離子化率與離子交換能力成正比。離子化率與離子交換能力成正比

12、。P184表表6、2列出了生物分離中常用的列出了生物分離中常用的離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán)常用于蛋白質(zhì)交換的離子交換基團(tuán)常用于蛋白質(zhì)交換的離子交換基團(tuán)陰離子交換基：二乙胺乙基（陰離子交換基：二乙胺乙基（DEAE)季季銨乙基（銨乙基（QAE)。陽離子交換基：羧甲基（陽離子交換基：羧甲基（CM),膦酸基膦酸基(P),磺丙基（磺丙基（SP)。所用的基質(zhì)材料主要有纖維素，葡聚糖所用的基質(zhì)材料主要有纖維素，葡聚糖凝膠和瓊脂凝膠。凝膠和瓊脂凝膠。DEAE anion exchangerCMC Cation Exchanger交換容量：單位質(zhì)量的干燥離子交換劑交換容量：單位質(zhì)量的干燥離子交換劑或單位體積的濕離

13、子交換劑所能吸附的或單位體積的濕離子交換劑所能吸附的一價(jià)離子的毫摩爾數(shù)。是表征離子交換一價(jià)離子的毫摩爾數(shù)。是表征離子交換能力的主要參數(shù)。能力的主要參數(shù)。陽離子交換劑：陽離子交換劑：R-H+ + NaOH = R-Na+ + H2O陰離子交換劑：陰離子交換劑：2R + Cl- + Na2SO4 = R2+SO42- + 2NaCl 蛋白質(zhì)等生物大分子與小分子化合物離蛋白質(zhì)等生物大分子與小分子化合物離子交換特性有很大差別：子交換特性有很大差別：A、蛋白質(zhì)分子量大，樹脂孔道對其空間、蛋白質(zhì)分子量大，樹脂孔道對其空間排阻作用大，不能與所有的離子交換活排阻作用大，不能與所有的離子交換活性中心接觸。性中心

14、接觸。B、離子交換吸附蛋白質(zhì)分子會妨礙其他、離子交換吸附蛋白質(zhì)分子會妨礙其他蛋白質(zhì)與未吸附蛋白質(zhì)離子交換基團(tuán)發(fā)蛋白質(zhì)與未吸附蛋白質(zhì)離子交換基團(tuán)發(fā)生作用。生作用。C、蛋白質(zhì)是多價(jià)電荷，離子交換中可與、蛋白質(zhì)是多價(jià)電荷，離子交換中可與多個(gè)離子交換基發(fā)生作用。因此蛋白質(zhì)多個(gè)離子交換基發(fā)生作用。因此蛋白質(zhì)的交換容量遠(yuǎn)低于無機(jī)離子的交換容量。的交換容量遠(yuǎn)低于無機(jī)離子的交換容量。 第四節(jié) 離子交換層析一、原理與操作一、原理與操作原理原理n利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫層析法。

15、進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫層析法。n荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)為：荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)為：mIAmB其中：其中：I為流動相的離子強(qiáng)度；為流動相的離子強(qiáng)度；A和和B為常數(shù)；為常數(shù)； m為離子強(qiáng)度無限大時(shí)溶質(zhì)的分配系數(shù)。為離子強(qiáng)度無限大時(shí)溶質(zhì)的分配系數(shù)。對于不同的溶質(zhì)，對于不同的溶質(zhì)，A與與B不同，即在離子交換劑上不同，即在離子交換劑上的分配行為不同，在洗脫過程中彼此得到分離。的分配行為不同，在洗脫過程中彼此得到分離。n蛋白質(zhì)是多價(jià)的兩性高分子電解質(zhì)，具有蛋白質(zhì)是多價(jià)的兩性高分子電解質(zhì)，具有等點(diǎn)等點(diǎn)pI，當(dāng)溶液，當(dāng)溶液pH偏離等電點(diǎn)，偏離等電點(diǎn)，pH大于大于pI時(shí)，帶負(fù)電荷，可被陰離子吸

16、附劑所吸時(shí)，帶負(fù)電荷，可被陰離子吸附劑所吸附，附，pH小于小于pI時(shí)，帶正電荷，可被陽離子時(shí)，帶正電荷，可被陽離子交換劑吸附。交換劑吸附。nB值為蛋白質(zhì)的凈電荷數(shù)與反離子價(jià)數(shù)（離值為蛋白質(zhì)的凈電荷數(shù)與反離子價(jià)數(shù)（離子交換基的離子價(jià)數(shù)）之比。由于蛋白質(zhì)子交換基的離子價(jià)數(shù)）之比。由于蛋白質(zhì)凈電荷數(shù)常為兩位數(shù)以上，凈電荷數(shù)常為兩位數(shù)以上，B值很大。因此值很大。因此離子強(qiáng)度的微小改變會引起分配系數(shù)很大離子強(qiáng)度的微小改變會引起分配系數(shù)很大改變。改變。反離子價(jià)數(shù)蛋白質(zhì)的靜電荷數(shù)Bn由于離子交換過程中溶質(zhì)的分配系數(shù)由于離子交換過程中溶質(zhì)的分配系數(shù)隨離子強(qiáng)度增大而急劇降低，故離子隨離子強(qiáng)度增大而急劇降低，故離

17、子交換操作需在低離子強(qiáng)度下進(jìn)行。交換操作需在低離子強(qiáng)度下進(jìn)行。IEC操作（離子交換層析操作）操作（離子交換層析操作）n很少采用恒定洗脫。因?yàn)椋汉苌俨捎煤愣ㄏ疵?。因?yàn)椋簑蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強(qiáng)度非常敏感，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強(qiáng)度非常敏感，即離子強(qiáng)度的微小改變，引起分配系數(shù)即離子強(qiáng)度的微小改變，引起分配系數(shù)的很大變化；的很大變化；w不同蛋白質(zhì)的不同蛋白質(zhì)的B值可能相差很大，即在值可能相差很大，即在同一離子強(qiáng)度下不同蛋白質(zhì)分配系數(shù)可同一離子強(qiáng)度下不同蛋白質(zhì)分配系數(shù)可能相差非常大。能相差非常大。mIAmBw若采用離子強(qiáng)度不變的流動相進(jìn)行恒定若采用離子強(qiáng)度不變的流動相進(jìn)行恒定洗脫，不同蛋白質(zhì)的洗脫體

18、積相差很大，洗脫，不同蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難洗脫，造甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難洗脫，造成洗脫劑的大量消耗和洗脫時(shí)間的大幅成洗脫劑的大量消耗和洗脫時(shí)間的大幅度增加。度增加。n多采用梯度洗脫法多采用梯度洗脫法w線性梯度洗脫法線性梯度洗脫法n流動相離子強(qiáng)度線性增大，溶質(zhì)的分配系流動相離子強(qiáng)度線性增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)數(shù)m連續(xù)降低，移動速度逐漸增大，使恒連續(xù)降低，移動速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì)在較小的流定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì)在較小的流動相體積下洗脫。通過改變流動相離子強(qiáng)動相體積下洗脫。通過改變流動相離子強(qiáng)度的增大速度，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，度的增大速度

19、，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，在改善分離度的同時(shí)縮短洗脫時(shí)間。在改善分離度的同時(shí)縮短洗脫時(shí)間。n特點(diǎn)特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)：流動相離子強(qiáng)度連續(xù)增大，優(yōu)點(diǎn)：流動相離子強(qiáng)度連續(xù)增大，不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣；不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣；n缺點(diǎn)：需要特殊的調(diào)配濃度梯度缺點(diǎn)：需要特殊的調(diào)配濃度梯度的設(shè)備。的設(shè)備。w逐次洗脫法逐次洗脫法n流動相離子強(qiáng)度階躍增大，溶質(zhì)的流動相離子強(qiáng)度階躍增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動速度的增大分配系數(shù)的降低和移動速度的增大也是階段式的。是介于恒定洗脫和也是階段式的。是介于恒定洗脫和線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。n特點(diǎn)特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)：不需特殊的調(diào)配濃度梯度優(yōu)點(diǎn)：不需

20、特殊的調(diào)配濃度梯度設(shè)備，操作簡便；設(shè)備，操作簡便；n缺點(diǎn)：容易出現(xiàn)干擾峰；此外，缺點(diǎn)：容易出現(xiàn)干擾峰；此外，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象。洗脫操作參數(shù)的設(shè)計(jì)較困難。象。洗脫操作參數(shù)的設(shè)計(jì)較困難。w梯度洗脫的濃縮作用梯度洗脫的濃縮作用nIEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此后部的移動速度高于前于前部，因此后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。+-anion exchange beadEquilibrationSample applicationand wash-+-Elution-+-Re

21、generation-+Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+anionexchangerbead-二、應(yīng)用及特點(diǎn)二、應(yīng)用及特點(diǎn)應(yīng)用應(yīng)用n由于由于IEC基于離子交換的原理分離純化生基于離子交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，通用性和選擇性均遠(yuǎn)高于物產(chǎn)物，通用性和選擇性均遠(yuǎn)高于GFC，所以是蛋白質(zhì)、多肽和核酸等生物產(chǎn)物所以是蛋白質(zhì)、多肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。的主要純化手段。n思考題：為什么離子交換層析操作中很思考題：為什么離子交換層析操作中很少采用恒定洗脫法？少采用恒定洗脫法？ IEC特點(diǎn)特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)w處理量大，

22、具濃縮作用，可在較高流速處理量大，具濃縮作用，可在較高流速下操作；下操作；w應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長較短；提高分離的選擇性，所需柱長較短；w產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品回收率高；w商品化的離子交換劑種類多，選擇余地商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價(jià)格也較低。大，價(jià)格也較低。n缺點(diǎn)缺點(diǎn)w操作參數(shù)多，影響分離特性的因素非操作參數(shù)多，影響分離特性的因素非常復(fù)雜，過程設(shè)計(jì)和規(guī)模放大困難。常復(fù)雜，過程設(shè)計(jì)和規(guī)模放大困難。 例題用用SephadexG-100柱（排阻層析柱）柱（排阻層析柱）及強(qiáng)酸性陽離子交換柱（離子交換柱）及強(qiáng)酸性陽離子交換

23、柱（離子交換柱）來分離核糖核酸酶來分離核糖核酸酶（分子量（分子量 14000，pI 7.8）胃蛋白酶）胃蛋白酶 （分子量（分子量 36000，pI 1.5）及胰島素）及胰島素 （分子量（分子量 5700，pI 5.3）指出以上物質(zhì)通過兩個(gè)柱洗脫）指出以上物質(zhì)通過兩個(gè)柱洗脫順序，并簡要說明分離原理。順序，并簡要說明分離原理。答：答：SephadexG-100 pH-pI 大，帶電荷多。大，帶電荷多。陽離子交換柱。陽離子交換柱。pH 吸附性強(qiáng)，吸附性強(qiáng)，m大大 洗脫順序洗脫順序 ： 答：SephadexG-100 凝膠過濾中，分子量大的物質(zhì)先被洗脫下來，凝膠過濾中的洗脫順序?yàn)椋何傅鞍酌?、核糖核酸?/p>

24、、胰島素。（5分）離子交換拄中， pH與pI差值大的物質(zhì)帶電荷多。帶電荷多的吸附性強(qiáng)。陽離子交換柱中，pHpI帶正電荷，帶正電荷多少的順序?yàn)椋汉颂呛怂崦?、胰島素、胃蛋白酶。 所以洗脫順序?yàn)椋何傅鞍酌?、胰島素、核糖核酸酶。（5分） 例題簡述離子交換層析的分離原理。為什么離子交換層析常用梯度洗脫法？該法有何優(yōu)點(diǎn)。用增加鹽離子強(qiáng)度的方法，從指定的離子交換柱上洗脫下列蛋白質(zhì)，指出它們被洗脫下來的先后順序，并說明理由。已知細(xì)胞色素C的pI=10.6，溶菌酶pI=11.0，卵清蛋白pI=4.6，肌紅蛋白pI=7.0，胃蛋白酶pI=1.0，脲酶pI=5.0，血紅蛋白pI=6.8。（1）細(xì)胞色素C，溶菌酶，卵

25、清蛋白，肌紅蛋白（陰離子交換柱）；（2）細(xì)胞色素C，胃蛋白酶，脲酶，血紅蛋白（陽離子交換柱）。（15分）第五節(jié)第五節(jié) 疏水性相互作用層析疏水性相互作用層析一、原理與操作一、原理與操作原理：原理：nHIC利用表面偶聯(lián)弱疏水性基因的疏水性吸利用表面偶聯(lián)弱疏水性基因的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。類生物大分子分離純化的洗脫層析法。n親水性蛋白質(zhì)表面均含有一定量的疏水性基親水性蛋白質(zhì)表面均含有一定量的疏水性基團(tuán)，可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短

26、鏈烷基、團(tuán)，可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短鏈烷基、苯基等弱疏水基發(fā)生疏水性相互作用，被固苯基等弱疏水基發(fā)生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附劑）所吸附。定相（疏水性吸附劑）所吸附。 疏水作用層析(Hydrophobic Interaction Chromatography）Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity操作：操作：n與與IEC不同，蛋白質(zhì)的吸附在高濃度鹽

27、溶不同，蛋白質(zhì)的吸附在高濃度鹽溶液中進(jìn)行，洗脫則主要采用降低流動相液中進(jìn)行，洗脫則主要采用降低流動相離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。法。n原因：根據(jù)蛋白質(zhì)鹽析沉淀原理，在離原因：根據(jù)蛋白質(zhì)鹽析沉淀原理，在離子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，疏水性相互作子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，疏水性相互作用增大。所以，蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑用增大。所以，蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑上的分配系數(shù)隨流動相鹽濃度（離子強(qiáng)上的分配系數(shù)隨流動相鹽濃度（離子強(qiáng)度）的提高而增大。度）的提高而增大。二、疏水性吸附劑二、疏水性吸附劑各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏

28、水性吸附劑。用作疏水性吸附劑。常用的疏水性配基主要有：苯基、短鏈烷基常用的疏水性配基主要有：苯基、短鏈烷基（C3C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。因疏水性吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈因疏水性吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，一般為應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，一般為1040 mol/cm3，過小則疏水性吸附作用，過小則疏水性吸附作用不足，過大則洗脫困難。不足，過大則洗脫困難。 強(qiáng)烈的洗脫條件，會使被洗脫的蛋白質(zhì)變強(qiáng)烈的洗脫條件，會使被洗脫的蛋白質(zhì)變性?？筛鶕?jù)系列柱實(shí)驗(yàn)來判斷

29、蛋白質(zhì)表面性?？筛鶕?jù)系列柱實(shí)驗(yàn)來判斷蛋白質(zhì)表面的疏水性質(zhì)。從而決定分辨和純化蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)。從而決定分辨和純化蛋白質(zhì)的方案。的方案。Mechanism of HIC疏水性配基與親水性固定相粒子之間的疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基的結(jié)合或醚鍵結(jié)合。偶聯(lián)主要利用氨基的結(jié)合或醚鍵結(jié)合。NHRNH2NHR OCH2CHCH2OR OH其中：R(CH2)nCH3，n=27；或R R表示疏水性配基。三、應(yīng)用及特點(diǎn)三、應(yīng)用及特點(diǎn)應(yīng)用應(yīng)用nHIC基于疏水性吸附分離純化蛋白質(zhì)類基于疏水性吸附分離純化蛋白質(zhì)類生物大分子，與生物大分子，與IEC的離子交換作用完全的離子交換作用完全不同，可與不同

30、，可與IEC互補(bǔ)短長，分離純化利用互補(bǔ)短長，分離純化利用IEC難于分離的蛋白質(zhì)。難于分離的蛋白質(zhì)。特點(diǎn)特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)w由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此用較大，因此HIC可直接分離鹽析后可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液；的蛋白質(zhì)溶液；w通過改變疏水配基鏈長和密度可調(diào)節(jié)通過改變疏水配基鏈長和密度可調(diào)節(jié)吸附力，因此可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)吸附力，因此可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑；選擇適宜的吸附劑；w疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價(jià)格與離子交換劑相當(dāng)。價(jià)格與離子交換劑相當(dāng)。n缺點(diǎn)缺點(diǎn)n由于疏水性相互作用機(jī)理比較復(fù)雜，由于疏水性相互作用機(jī)理比較復(fù)雜，吸附劑的選擇和洗脫分離條件不易掌吸附劑的選擇和洗脫分離條件不易掌握。握。n較高鹽濃度下，疏水作用色層分離法較高鹽濃度下，疏水作用色層分離法難以得到很好的分辨率。難以得到很好的分辨率。n水中溶解度較差蛋白如球蛋白、膜結(jié)水中溶解度較差蛋白如球蛋白、膜結(jié)合蛋白低