肖成茂碩士答辯ppt

1、一種可生成穩(wěn)定生化梯度一種可生成穩(wěn)定生化梯度的新型十字微通道的新型十字微通道的制作及評價的制作及評價 答辯人：肖成茂答辯人：肖成茂 導導 師：蔡紹皙師：蔡紹皙 教授教授 專專 業(yè)：生物力學工程業(yè)：生物力學工程 學學 號：號：200819020712008190207112354n細胞趨化、遷移在眾多生理、病理過程細胞趨化、遷移在眾多生理、病理過程(胚胚胎形成、免疫反應、惡性腫瘤形成胎形成、免疫反應、惡性腫瘤形成)中扮演中扮演著至關重要的角色。著至關重要的角色。n在在這些生命過程中，物理、化學及生物梯這些生命過程中，物理、化學及生物梯度的大小，方向?qū)ιM程有著非常重要度的大小，方向?qū)ιM程有

2、著非常重要的意義。的意義。n在相關的生化梯度誘導細胞遷移研究中，在相關的生化梯度誘導細胞遷移研究中，所采用的細胞培養(yǎng)、遷移實驗裝置大體分所采用的細胞培養(yǎng)、遷移實驗裝置大體分為以下兩類：為以下兩類：5050多年發(fā)多年發(fā)展歷程的展歷程的傳統(tǒng)微流傳統(tǒng)微流控小室?？匦∈摇Ｑb置分類裝置分類近年來興近年來興起的基于起的基于光刻法的光刻法的新型微流新型微流控芯片控芯片n1）傳統(tǒng)遷移小室）傳統(tǒng)遷移小室 Boyden小室小室Transwell小室小室（1962） 瓊脂糖平板瓊脂糖平板（1952）趨化因子細胞培養(yǎng)基微孔濾膜趨化因子 細胞 培養(yǎng)基n2）現(xiàn)代光刻微芯片現(xiàn)代光刻微芯片Thomas M. Keena200

3、6Microfluidic “jets” for generating steady-state gradients of soluble molecules on open surfacesTim Scharnweber2011Rapid prototyping of microstructures in polydimethylsiloxane (PDMS) by direct UV-lithographyShing-Yi Cheng 2007A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migr

4、ation光刻是將所需要的微通道圖形制成光掩模，微通道的基底材料采用透光性高的玻璃或硅制成，旋涂光刻膠，曝光，之后用濕法或干法蝕刻。在這些材料表面上形成微通道，然后再采用鍵合機使微通道與載玻片等實現(xiàn)閉合，起到封閉通道和防止漏液的作用。n以上兩種方法的不足以上兩種方法的不足不能不能產(chǎn)產(chǎn)生生穩(wěn)穩(wěn)定、定、長長期持期持續(xù)續(xù)的多生化梯度的多生化梯度細細胞多是二胞多是二維維培培養(yǎng)養(yǎng)，構構型型設計單設計單一一繁瑣的制作流程和昂貴的光刻儀器繁瑣的制作流程和昂貴的光刻儀器多多要鍵合才能閉合所加工的通道要鍵合才能閉合所加工的通道. . 模板制作依靠專業(yè)人員，不便于推廣到普通實驗模板制作依靠專業(yè)人員，不便于推廣到普

5、通實驗室室nMohan K. S 2006和和蔣稼歡蔣稼歡2008等人等人提出提出運用抽絲運用抽絲的手段簡化的微流控芯片的制作工藝。的手段簡化的微流控芯片的制作工藝。n此此法利用在液態(tài)法利用在液態(tài)PDMS或凝膠中嵌入尼龍絲或其或凝膠中嵌入尼龍絲或其它細絲，固化后將細絲抽出的方法來制作裝置。它細絲，固化后將細絲抽出的方法來制作裝置。n其其因制作簡單、成本低廉而適用于普通實驗室因制作簡單、成本低廉而適用于普通實驗室。n本研究基于此法，力圖設計一種能兼顧傳統(tǒng)和光本研究基于此法，力圖設計一種能兼顧傳統(tǒng)和光刻優(yōu)點的新型微流控通道芯片?？虄?yōu)點的新型微流控通道芯片。nMohan K. S,Verma.Emb

6、edded Template-Assisted Fabrication of Complex Microchannels in PDMS and Design of a Microfluidic Adhesive.Langmuir,2006,22,10291-10295.n賈月飛賈月飛,蔣稼歡蔣稼歡.基于微絲的基于微絲的PDMS微流動通道制作技術微流動通道制作技術.科學通報科學通報J,2008,53(17):2116-2124.1規(guī)避光刻工藝不足快速制作、成本較低、非專業(yè)者容易操作2尺寸相當、多生化參數(shù)可生成可調(diào)控、三維培養(yǎng)等梯度生成前期模擬濃度梯度壓力梯度生物學實驗在微芯片中生成VEGF濃度

7、梯度，考察血管內(nèi)皮細胞在此梯度下的遷移。從而證實微芯片的實用性通道設計能在較短時間內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定梯度采用常見材料制作，工藝簡單可行。并且能快速制作，大量復制。研究內(nèi)容包括以下方面：研究內(nèi)容包括以下方面：微芯片通道設計壓力梯度構建濃度梯度構建壓力梯度模擬有機玻璃模具制作濃度梯度模擬抽絲法制作PDMS芯片血管內(nèi)皮細胞在芯片中的遷移檢測n1）通道設計通道設計n根據(jù)對流與擴散的經(jīng)典公式：根據(jù)對流與擴散的經(jīng)典公式：n在擴散作用下，通道中濃度的分布由上式?jīng)Q定在擴散作用下，通道中濃度的分布由上式?jīng)Q定在壓力作用下，能夠在中間通道介質(zhì)中產(chǎn)生間隙滲流，在壓力作用下，能夠在中間通道介質(zhì)中產(chǎn)生間隙滲流，從而對細胞施加力學

8、刺激。從而對細胞施加力學刺激。壓力梯度的計算公式是壓力梯度的計算公式是:nCrank J.The Mathematics of Diffusion.2nd edM.New York:Oxford University Press,1980,4241 1）通道制作通道制作PDMS Dow Corning Corporation,Sylgard 184 微方絲 TP Orthodontics,lnc2.0mm1.5mm1.0mm5.0mm10mm1.0mm7mmn1）通道制作通道制作n微通道的微通道的制作制作包含模板和微絲清洗、澆注固化、包含模板和微絲清洗、澆注固化、抽絲、親水處理、凝膠灌注和封裝

9、等抽絲、親水處理、凝膠灌注和封裝等6個主要步個主要步驟驟101通道通道實實物物圖圖n2）梯度的）梯度的COMSOL模擬模擬-濃度濃度nCOMSOL Multiphysics 3.5a是一款大是一款大型的高級數(shù)值仿真軟件，廣泛應用于型的高級數(shù)值仿真軟件，廣泛應用于各個領域的科學研究以及工程計算，各個領域的科學研究以及工程計算，被理工科科學家尤其是理論科學家公被理工科科學家尤其是理論科學家公認稱為認稱為“第一款真正的任意多物理場第一款真正的任意多物理場直接耦合分析軟件直接耦合分析軟件”。它能模擬科學。它能模擬科學和工程領域的各種物理過程。和工程領域的各種物理過程。n2）梯度的）梯度的COMSOL模

10、擬模擬-壓力壓力n3）密封性檢測）密封性檢測n在前期在前期PDMS涂覆工作做好的情況下，對抽微涂覆工作做好的情況下，對抽微流動腔的液體回收率進行計算。流動腔的液體回收率進行計算。n實驗證實，液體回收率較高。除了滯留在瓊脂實驗證實，液體回收率較高。除了滯留在瓊脂糖凝膠中的少許液體外，幾乎全部回收。糖凝膠中的少許液體外，幾乎全部回收。n即用一次性抽絲法制作的裝置密封性好，無漏即用一次性抽絲法制作的裝置密封性好，無漏液現(xiàn)象。液現(xiàn)象。n小結：小結：n在制作上，參照經(jīng)典流體理論決定了通道的尺在制作上，參照經(jīng)典流體理論決定了通道的尺寸和構型。寸和構型。n采用采用PDMS灌注、抽絲的方法生成了十字微通灌注、

11、抽絲的方法生成了十字微通道。道。n進行微通道芯片的密封性檢測，結果表明在連進行微通道芯片的密封性檢測，結果表明在連上外圍設備后，微芯片具有良好的密封性。上外圍設備后，微芯片具有良好的密封性。n在在COMSOL中進行了濃度梯度和壓力梯度的模中進行了濃度梯度和壓力梯度的模擬，理論上證明是可行的。擬，理論上證明是可行的。n1）濃度梯度生成與表征）濃度梯度生成與表征水FITC采用吸取而不是灌注熒光素的方式，可很好的避免通道內(nèi)氣泡，以及可能的漏液現(xiàn)象。取吸取速率260 nL/minn1）濃度梯度生成與表征）濃度梯度生成與表征n1）濃度梯度生成與表征）濃度梯度生成與表征結結果果顯顯示，示，SourceSo

12、urce通道的灰通道的灰度度值值最高，最高，SinkSink通道通道內(nèi)內(nèi)的灰的灰度度值值最低，中最低，中間間通道通道內(nèi)內(nèi)的灰的灰度度值值呈呈遞減趨勢遞減趨勢。在在10min10min內(nèi)內(nèi)通道通道內(nèi)內(nèi)的的濃濃度梯度梯度度達達到平衡；平衡前，到平衡；平衡前，chachambermber通道通道內(nèi)內(nèi)的的熒熒光強度光強度隨隨著著時間時間的延的延長長迅速上升；在迅速上升；在10min10min時時，三，三處處通道通道內(nèi)內(nèi)的的熒熒光強度均光強度均達達到各自峰到各自峰值值，隨隨著著時間時間的延的延長濃長濃度保持不度保持不變變。n1）濃度梯度生成與表征）濃度梯度生成與表征不同不同長長度度chambercham

13、ber中的濃度分布中的濃度分布n2）壓力梯度生成與表征（使用紅藍墨水進行表征）壓力梯度生成與表征（使用紅藍墨水進行表征）n2）壓力梯度生成與表征）壓力梯度生成與表征n2）壓力梯度生成與表征）壓力梯度生成與表征n2）壓力梯度生成與表征）壓力梯度生成與表征在長達120小時的時間里，45組只從45Pa下降到37Pa；70組只從70Pa下降到50Pa我們通過續(xù)加液體，可維持通道壓力梯度7天左右的時間，足夠進行相關的壓力梯度下細胞趨化、遷移實驗n3）細胞實驗）細胞實驗n為了進一步驗證微流控芯片的實用性，為了進一步驗證微流控芯片的實用性，選用目選用目前研究得較多的前研究得較多的VEGF生長因子，在通道中形

14、生長因子，在通道中形成成VEGF濃度梯度，濃度梯度，采用倒置相差顯微鏡觀察采用倒置相差顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞接種在通道中的形態(tài)、趨化及遷移等內(nèi)皮細胞接種在通道中的形態(tài)、趨化及遷移等生長情況。生長情況。n3）細胞實驗）細胞實驗-VEGF誘導細胞遷移誘導細胞遷移n3）細胞實驗）細胞實驗-VEGF誘導細胞遷移誘導細胞遷移10ng/ml0ng/mln本研究在十字微通道芯片中，本研究在十字微通道芯片中，分別生成了分別生成了可可長期長期持續(xù)的濃度梯度和壓力梯度。持續(xù)的濃度梯度和壓力梯度。n在在微通道微通道中，細胞成功存活，生長狀態(tài)良中，細胞成功存活，生長狀態(tài)良好。好。n細胞細胞實驗初步完成了實驗初步完成了VE

15、Cs在在不同不同VEGF濃濃度梯度度梯度下的下的遷移過程遷移過程。驗證了微通道的實驗證了微通道的實用性。用性。 本研究本研究通過設計、制作、模擬和試驗等工作通過設計、制作、模擬和試驗等工作，對微芯片的加工工藝提出了新架構、，對微芯片的加工工藝提出了新架構、并并有有實踐意義的實踐意義的探索探索。n本本研究研究所提出的所提出的十字十字微方絲通道加工改良方微方絲通道加工改良方法，一定程度上可彌補傳統(tǒng)方法所得通道的法，一定程度上可彌補傳統(tǒng)方法所得通道的不足。顯然不同截面乃至不同幾何拓撲結構不足。顯然不同截面乃至不同幾何拓撲結構，可，可讓讓研究人員研究人員在開展相關實驗時在開展相關實驗時更多選擇更多選擇

16、。n后續(xù)工作建議后續(xù)工作建議n第一：后續(xù)工作應該繼續(xù)開展構型的設計，第一：后續(xù)工作應該繼續(xù)開展構型的設計，逐步探索適合于普通實驗室的構型方案。逐步探索適合于普通實驗室的構型方案。n從而走上既能節(jié)約科研經(jīng)費，又不降低科研從而走上既能節(jié)約科研經(jīng)費，又不降低科研水平的良性循環(huán)之路。水平的良性循環(huán)之路。n后續(xù)工作建議后續(xù)工作建議n十字通道的二次變換十字通道的二次變換n后續(xù)工作建議后續(xù)工作建議n第二：在生化因子的加載上，由于研究時間的限第二：在生化因子的加載上，由于研究時間的限制，沒有進行壓力梯度相關的細胞試驗探索。制，沒有進行壓力梯度相關的細胞試驗探索。n在后續(xù)工作中，可繼續(xù)進行濃度和壓力梯度綜合在后

17、續(xù)工作中，可繼續(xù)進行濃度和壓力梯度綜合加載的嘗試。加載的嘗試。n考慮到本實驗室的生物力學學科優(yōu)勢，在前述兩考慮到本實驗室的生物力學學科優(yōu)勢，在前述兩種參數(shù)加載的同時，把流動剪切力也加入進來，種參數(shù)加載的同時，把流動剪切力也加入進來，從而在微通道中更好的模擬出從而在微通道中更好的模擬出細胞細胞在在體內(nèi)體內(nèi)的生長的生長微環(huán)境。微環(huán)境。n衷心感謝我的導師蔡紹皙教授對我論文工作的指導以及這三年來對我在學業(yè)上的教誨，工作和生活中的關懷和鼓勵。 n在本文的研究和撰寫工作中，還得到了重慶大學的蔣稼歡老師的熱情關心、指導和幫助，在此向老師表示由衷的感謝。n感謝晏小清師兄和戴小珍師姐在實驗中給予我的幫助。 n感謝實驗室的其他兄弟姐妹們對我的支持和幫助。n衷心地感謝在百忙之中評閱論文和參加答辯的各位專家、教授！n附錄附錄A：作者在攻讀碩士學位期間撰寫和發(fā)表的論：作者在攻讀碩士學位期間撰寫和發(fā)表的論文目錄文目錄n1肖成茂肖成茂, 蔡紹皙蔡紹皙, 蔣稼歡蔣稼歡, 晏小清晏小清. 一種新