血紅蛋白的提取與分離

1、課題課題3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離思考思考: 蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識：一、基礎(chǔ)知識： 凝膠色譜法（分配色譜法）：凝膠色譜法（分配色譜法）：分離蛋白分離蛋白質(zhì)的方法質(zhì)的方法 1、凝膠：、凝膠：一些微小多孔的球體一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的（內(nèi)含許多貫穿

2、的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）具多孔的凝膠就叫分子篩） 2、概念：、概念：根據(jù)被根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行分離。子篩作用，來進行分離。3、原理：、原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對（對（ ）的蛋白質(zhì)容易進入）的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程（凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動速），移動速度（度（ ），而（），而（ ）的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的

3、通道，只能在（在（ ）移動，路程（）移動，路程（ ），），移動速度（移動速度（ ），相對分子質(zhì)量不同），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。的蛋白質(zhì)因此得以分離。4、具體過程、具體過程相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較小較長較長較慢較慢相對分子質(zhì)量較大相對分子質(zhì)量較大凝膠外部凝膠外部較短較短較快較快凝膠色譜法凝膠色譜法1、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是蛋白質(zhì)的敘述，正確的是( )A 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相

4、對相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C 相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D 二者根本無法比較二者根本無法比較 2、原理、原理：在電場的作用下，這些帶電分子：在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其（會向著與其（ ） 移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身）以及分子本身（ ）、（）、（ ）的不同使帶電分子的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（產(chǎn)生不同的（ ），從而實現(xiàn)樣品），從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。中各種分子的分離。所帶電荷相反的

5、電極所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異帶電性質(zhì)的差異大小大小形狀形狀遷移速度遷移速度二二.電泳電泳(各種分子分離方法各種分子分離方法)1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生 遷移的過程。遷移的過程。瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。3.分類：分類：分子小遷移速度快分子小遷移速度快使用使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量電泳檢測結(jié)果電泳檢測結(jié)果2、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于( )A 電

6、荷的多少電荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽鏈的多少肽鏈的多少 D 分子形狀的差異分子形狀的差異三三.實驗操作實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：1.樣品處理樣品處理樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定(1)紅細胞的洗滌紅細胞的洗滌a.低速短時間離心低速短時間離心b.加入生理鹽水加入生理鹽水直至上清液中已沒直至上清液中已沒有（有（ ），表明），表明洗滌干凈洗滌干凈黃色黃色(2)血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放(3)分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液2000r/min的速度離的速度離心心10 min2.2.粗分離粗分離: :透析過程透析過程( (透析除去分子較小的雜質(zhì)透析除去分子較小的雜質(zhì))3.3.純化：通過凝膠色譜法純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去4.4.純度鑒定：通過純度鑒定：通過SDSSDS- -聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定鑒定使用使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量假設(shè)白化病基因與相對應(yīng)的正常基因相比，白化基因缺假設(shè)白化病基因與相對應(yīng)的正常基因相比，白化基因缺失了一失了一個限制酶的切點。圖二表示甲、乙、丙個限制酶的切點。圖二表示甲、乙、丙3人白化基