第四章 原生質(zhì)體融合

1、第四章第四章 動(dòng)植物細(xì)胞融合動(dòng)植物細(xì)胞融合一、動(dòng)物動(dòng)物二、植物融合一、動(dòng)物動(dòng)物（一）概念 細(xì)胞融合又稱體細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)離體細(xì)胞通過(guò)一定誘導(dǎo)技術(shù)使質(zhì)膜接觸而融合在一起，隨后導(dǎo)致兩個(gè)細(xì)胞核物質(zhì)融合的技術(shù)。 細(xì)胞融合圖 （二）細(xì)胞融合的常用方法（二）細(xì)胞融合的常用方法生物法：仙臺(tái)病毒（HVJ）誘導(dǎo)融合物理法：電脈沖刺激誘導(dǎo)融合化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 仙臺(tái)病毒（HVJ）誘導(dǎo)融合聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程）法細(xì)胞融合過(guò)程電融合誘導(dǎo)法原理示意圖電融合誘導(dǎo)法原理示意圖（三）單克隆抗體（三）單克隆抗

2、體1.何謂單克隆抗體？何謂單克隆抗體？進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細(xì)菌、各種細(xì)胞等?？贵w：動(dòng)物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的糖蛋白，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白人體內(nèi)的五種抗體人體內(nèi)的五種抗體動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)個(gè)動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)個(gè)B淋巴淋巴 細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)克隆，它針對(duì)抗原上的一個(gè)抗原決就是一個(gè)克隆，它針對(duì)抗原上的一個(gè)抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族，因此能刺激多個(gè)因此能刺激多個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆淋巴細(xì)

3、胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對(duì)不同抗原決抗體，因此血清中的抗體是針對(duì)不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體多克隆抗體。單克隆抗體單克隆抗體: 只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體單克隆抗體。2 2、單克隆抗體技術(shù)（雜交瘤技術(shù)）的基本原理、單克隆抗體技術(shù)（雜交瘤技術(shù)）的基本原理3、單克隆抗體單克隆抗體(雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞)的制備的制備（1）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（選擇次黃嘌呤

4、鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）淋巴細(xì)胞：經(jīng)過(guò)免疫處理的淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。 免疫方法：體內(nèi)法或體外法。 體內(nèi)法：對(duì)細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動(dòng)物體內(nèi)。34天后，在無(wú)菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95以上的可以用于融合。 體外法：直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，調(diào)整為107個(gè)/ml，加適當(dāng)濃度抗原，34天后，收集被刺激的淋巴細(xì)胞。（2）免疫小鼠）免疫小鼠（3）脾細(xì)胞的制備）脾細(xì)胞的制備1)1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；引頸處死小鼠，用酒精消毒體表

5、；2)2)無(wú)菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用無(wú)菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml5ml無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗一次；無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗一次；3)3)把脾臟置于已消毒的把脾臟置于已消毒的9090一一100100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；4)4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗，在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗， 令細(xì)胞通過(guò)紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入令細(xì)胞通過(guò)紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml3ml無(wú)血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng) 液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；

6、液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；5)5)把細(xì)胞懸液注入把細(xì)胞懸液注入50ml50ml離心管中，加離心管中，加l0l0一一20ml20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中 置置5 5分鐘；分鐘；6)6)離心離心(800(800一一10001000轉(zhuǎn)分轉(zhuǎn)分) )計(jì)數(shù)、備用。計(jì)數(shù)、備用。（4）細(xì)胞準(zhǔn)備）細(xì)胞準(zhǔn)備1 1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3 3次次(37)(37)，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞( (不少于不少于9090) )；2 2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗）收集小鼠脾細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3 3次次(37

7、)(37)，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞；，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞；3 3）按）按1 1：5 5或或1 1：1010混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾 紙吸紙吸 凈多余上清。凈多余上清。（5）細(xì)胞融合）細(xì)胞融合(1)將1ml 40的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微 轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1ml無(wú)血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無(wú)血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻

8、；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50u1；(7)送入5CO2，溫箱中37培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。（6）融合后細(xì)胞培養(yǎng)）融合后細(xì)胞培養(yǎng)(1)融合后710天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的) 后每隔23天 半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)23周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明；(4)待集落增殖生長(zhǎng)至13孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)。（7）抗體檢測(cè)）抗體檢測(cè)免疫熒光試驗(yàn)(FACS)放射免疫試驗(yàn)(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)1）誘生腹水 將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，接

9、種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。 方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種35106 雜交瘤細(xì)胞。1020天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含110mg單抗。 2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。 3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗（8）單克隆抗體的大量制備）單克隆抗體的大量制備4、單克隆抗體的應(yīng)用、單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病 診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)

10、確性。診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成 本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛 在技術(shù)。在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不 斷發(fā)展。斷發(fā)展。 二、植物二、植物融合融合 意義 理論上說(shuō)，任何細(xì)胞都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生

11、物資源，這對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。本質(zhì)A.融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制,為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供有效途徑; B.體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種,細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng),在雜種的分裂和增殖過(guò)程中，雙親的葉綠體、線粒體、DNA、亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。原理原理 纖維素酶.半纖維素酶消化細(xì)胞壁的主要成分纖維素，果膠酶消化使細(xì)胞連接在一齊的細(xì)胞間質(zhì)，從而原生質(zhì)體游離成球狀的單細(xì)胞。 酶消化前，細(xì)胞先培養(yǎng)在較高滲透壓的環(huán)境下，細(xì)胞適度質(zhì)壁分離 ，這樣細(xì)胞壁更容易被消化。細(xì)胞壁或細(xì)胞碎片通過(guò)過(guò)濾或離心而被分離。（二（二) )植物植物材料的來(lái)源無(wú)菌試管

12、苗溫室或生長(zhǎng)室栽種的植物 培養(yǎng)細(xì)胞方法： 1.撕去葉片的下表皮，然后以無(wú)表皮的一面向下，使葉片漂浮在酶溶液中； 2.把葉片或組織切成小塊，投入到酶溶液中，可與真空滲入相結(jié)合。2.植物原生質(zhì)體的純化植物原生質(zhì)體的純化 酶解后的混合物包括：解離酶液中，有原生質(zhì)體，有破碎細(xì)胞的細(xì)胞器等，也有未解離的組織或細(xì)胞。而培養(yǎng)只要干凈的原生質(zhì)體，所以要進(jìn)行純化。 純化的方法： A、清除較大碎屑：酶解后的混合物穿過(guò)一個(gè)鎳絲網(wǎng)（50-70um） B、清除較小的物質(zhì)： 13%甘露醇溶液25%蔗糖溶液Purified protoplasts3.原生質(zhì)體活力測(cè)定原生質(zhì)體活力測(cè)定目測(cè)法目測(cè)法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)

13、、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。 如形態(tài)上完整，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體即為存活的。FDAFDA法：法：醋酸酯熒光醋酸酯熒光素素伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過(guò)質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使，細(xì)胞才能被染色，因而可以通過(guò)細(xì)胞被染色與否確定活性。Regeneration of fertile shoots from A. thaliana cotyledon protoplasts. Cotyledons prepared for digestion in a 3 cm diameter petri dish (a). Protoplast divisions after 4 days o

14、f culture (b) with subsequent microcolony formation (arrowheads) after 3 additional days (c) within the identical area of an alginate gel. Protoplast-derived colonies after two weeks of culture (d). Shoot formation from a protoplast-derived colony 19 days after protoplast isolation (e). Shoot regene

15、ration (arrowheads) from protoplast-derived colonies after 5 weeks (f). Regenerates formed roots after 7 weeks (g) and seeds after 9 weeks (h)(三)植物原生質(zhì)體的融合（一）誘導(dǎo)融合的方法生物法：仙臺(tái)病毒（HVJ）誘導(dǎo)融合物理法：電脈沖刺激誘導(dǎo)融合化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合P 1 融合液 P 2 混合靜止1min. 選 擇 P 1 P2 加入PEG 培 養(yǎng) 融 合 加入稀釋液 加入培養(yǎng)基 稀 釋 洗 滌甜菜原生質(zhì)體電融合過(guò)程1、遺傳互補(bǔ)篩選法：利用

16、每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。 如親本1：葉綠體缺陷型 親本2：光致死型 兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白 色，融合細(xì)胞長(zhǎng)成植株呈綠色，并能成長(zhǎng)2、抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。如：親本1：對(duì)放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過(guò)50個(gè)世代親本2：對(duì)放線菌素D很敏感，但能在MS上生長(zhǎng)雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而親本和其它細(xì)胞死亡3、利用物理特性篩選法：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。 親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體 親本2：葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體 在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分4、利用生長(zhǎng)特性篩選法：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。 例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長(zhǎng)，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)