第7章 高效液相色譜法

1、1第7章 高效液相色譜法 7.1 高效液相色譜法高效液相色譜法 7.1.1 特點(diǎn)：特點(diǎn)： （1）高壓 最高輸送壓力可達(dá)4.9107 Pa，為了使流動(dòng)相能迅速地通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓； （2）高速 例如，分離苯的羥基化合物七個(gè)組分，只需要1 min就可完成。載液流速一般可達(dá)110 mLmin-1；2 （3）高效 色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜，每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)； （4）高靈敏度 HPLC廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。如紫外檢測(cè)器的最小檢測(cè)量可達(dá)納克數(shù)量級(jí)（10-9 g）；熒光檢測(cè)器的靈敏度可達(dá)10-11 g。37.

2、1.2 液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜與氣相色譜的比較 1 基本概念 液相色譜所用基本概念：液相色譜所用基本概念： 保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。 液相色譜所用基本理論：液相色譜所用基本理論： 塔板理論與速率方程式也與氣相色譜基本一致。 4 2 主要區(qū)別 (1) 應(yīng)用范圍不同 液相色譜不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合于分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析; (2) 液相色譜能完成難度較高的分離工作 ; 5 (3) 由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色

3、譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。 (4) 液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。 (5) 液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。67.2 高效液相色譜分類及分離原理高效液相色譜分類及分離原理 7.2.1 高效液相色譜分類高效液相色譜分類 分離機(jī)制不同，液相色譜可分為： 液固色譜（又稱吸附色譜） 液液色譜（又稱液液分配色譜） 化學(xué)鍵合相色譜 離子交換色譜 離子對(duì)色譜 離子色譜 分子排阻色譜（空間排阻色譜，凝膠滲透色譜） 77.2.2 各類高效液相色譜工作原理高效液相色譜工作原理 1 1 液液-液分配色譜液分配色譜 液液色譜又稱液液分配色譜。液

4、液色譜又稱液液分配色譜。 流動(dòng)相流動(dòng)相：液體：液體 固定相：固定相：將另一種液體涂漬在很細(xì)的惰性將另一種液體涂漬在很細(xì)的惰性 載體或硅膠上。載體或硅膠上。 當(dāng)被分離樣品進(jìn)入色譜柱后，組分分子在當(dāng)被分離樣品進(jìn)入色譜柱后，組分分子在兩相間呈下列平衡：兩相間呈下列平衡：式中式中X Xm m和和X Xs s分別表示流動(dòng)相中和固定相中的組分分子。分別表示流動(dòng)相中和固定相中的組分分子。 XmXs(7.1)8正相分配色譜和反相分配色譜正相分配色譜和反相分配色譜 正相分配色譜：正相分配色譜： 以極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑作流動(dòng)相。它適合于分離極性化合物； 反相分配色譜：反相分配色譜： 用非極性物質(zhì)作固定相，

5、極性溶劑為流動(dòng)相。它適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。92 2 液液-固色譜法固色譜法 液固色譜法又稱吸附色譜法。 （1）流動(dòng)相和固定相 流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑。 （2）作用機(jī)制 式中Xm和Xa分別表示在流動(dòng)相中和被吸附的溶質(zhì)分子，Sm代表被吸附在表面上的溶劑分子，Sm表示在流動(dòng)相中的溶劑分子。n是被吸附的溶劑分子數(shù)。 amnSXmanSX(7.2)103離子交換色譜法離子交換色譜法 離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography, IEC）以離子交換樹(shù)脂作為固定相，樹(shù)脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)。當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)，組分

6、離子與樹(shù)脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換。根據(jù)組分離子對(duì)樹(shù)脂親合力的不同而得到分離。11 陽(yáng)離子交換： 陰離子交換： 式中“”表示在固定相上，Kxy和KZM是交換反應(yīng)的平衡常數(shù)，Z+和X-代表被分析的組分離子。M+和Y表示樹(shù)脂上可交換的離子團(tuán)。KZMA-M+ + Z+A-Z+ + M+B+Y- + X-KxyB+X- +Y-124 離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法 將一種（或多種）與溶質(zhì)分子電荷相反的離子（稱為對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合生成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。 (1） 分離原理 流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子X(jué)+(或X-)與固定相或流動(dòng)相中帶相反電荷

7、的對(duì)離子Y-結(jié)合，形成離子對(duì)化合物X+Y-,而后在兩相中進(jìn)行分配： 13（2）正相離子對(duì)色譜法和反相離子對(duì)色譜法：正相離子對(duì)色譜法和反相離子對(duì)色譜法： 正相離子對(duì)色譜法：正相離子對(duì)色譜法： 用極性物質(zhì)作固定相，極性非溶劑為流動(dòng)相。 反相離子對(duì)色譜法反相離子對(duì)色譜法： 采用非極性疏水固定相，含有對(duì)離子Y-的極性溶劑如甲醇-水，或乙睛-水作流動(dòng)相。最常用。145 離子色譜法離子色譜法 通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。 以分離陰離子Br-為例 OHNaBrRBrNaOHR洗脫交換R為

8、離子交換樹(shù)脂。 15 雙柱離子色譜 在分離柱與電導(dǎo)檢測(cè)器之間增加一根抑制柱，柱中的離子交換樹(shù)脂與分離柱相反。 當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑分離后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)： RH+ Na+OH- RNa+十H2O R H+ + Na+Br- R Na+ + H+Br- 166 6 排阻色譜法排阻色譜法 排阻色譜法（SEC）亦稱空間排阻色譜法或凝膠滲透色譜法。是一種根據(jù)試樣分子的尺寸進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。 排阻色譜的機(jī)理是立體排阻，樣品組分與固定相之間不存在相互作用的現(xiàn)象。色譜柱的填料是凝膠，它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網(wǎng)狀物質(zhì)。凝膠的孔穴大小與被分離的試樣大小相當(dāng)

9、。 分離原理17 這些孔對(duì)于流動(dòng)相來(lái)說(shuō)是相當(dāng)大的，故流動(dòng)相可以自由地?cái)U(kuò)散出入。對(duì)于不同大小的組分分子，可分別滲入到凝膠孔內(nèi)的不同深度，大個(gè)的組分分子可滲入到凝膠的大孔內(nèi)，但進(jìn)不了小孔；而小個(gè)的組分分子，大孔小孔都可以滲進(jìn)去，甚至進(jìn)入很深，一時(shí)不易洗脫出來(lái)。故大的組分分子在色譜柱中停留的時(shí)間較短，很快被洗出，它的洗脫體積（即保留時(shí)間）很小，先出峰。小的組分分子在色譜柱中停留的時(shí)間較長(zhǎng)，洗脫體積（即保留時(shí)間）較大，后出峰。18試樣相對(duì)分子質(zhì)量與洗脫體積的關(guān)系 V0 Ve Vi C D E F 洗脫體積 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 106 105 104 103 B A 排斥 全滲透 Vi V0 選擇滲

10、透 197.3 液相色譜流動(dòng)相及固定相液相色譜流動(dòng)相及固定相 7.3.1 液相色譜固定相液相色譜固定相 1 液液-液分配色譜及離子對(duì)色譜法固定相液分配色譜及離子對(duì)色譜法固定相 液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：（1）全多孔型載體，它是由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑為3050 m的多孔型顆粒。205m 淺孔 12m 30m 實(shí)心球 深孔 表面多孔型顆粒 A 全多孔微粒 B 全多孔型顆粒 C 這種載體不規(guī)則，粒度大小不一，因此填充不均勻；另外，由于孔徑分布不一，且存在“裂縫”，在顆粒深孔中形成滯留液體（液坑），溶質(zhì)分子在深孔中擴(kuò)散和傳質(zhì)緩慢，這樣就進(jìn)一步促使色譜峰變寬。21

11、 （2）全多孔型微粒載體 它是由nm級(jí)的硅膠堆積而成，又稱堆積硅珠。于70年代初出現(xiàn)的。這種載體粒度為510 m。由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體（上圖B）。 （3）化學(xué)鍵合固定相 即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面。 22 根據(jù)在硅膠表面（具有SiOH基團(tuán)）的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為四種類型： A 硅氧碳鍵型（SiOC）； B 硅氧硅碳型（SiOSiC）； C 硅碳鍵型（SiC）; D 硅氮鍵型（SiN）。 23+ C18H37SiCl3 硅膠表面 SiOH SiOH SiOH O O O O 硅膠表面 SiO SiO SiO O O O O SiC

12、18H37 24 化學(xué)鍵合固定相具有如下一些特點(diǎn)： 表面沒(méi)有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多； 無(wú)固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命； 由于可以鍵合不同的官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性； 有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測(cè)器和餾分的收集。 252 液液-固色譜法固定相固色譜法固定相液固吸附色譜法所采用的固體吸附劑的類型： 目前最常使用的是硅膠（510 m，全多孔型），其次是氧化鋁。 硅膠 硅酸鎂 氧化鋁 氧化鎂 聚酰胺 酸性吸附劑 堿性吸附劑 分子篩 固體吸附劑 適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺 適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧和吡咯衍生物 263 離子交換色譜固定相離子交換色譜固定相 離子交換色譜

13、常用的固定相為離子交換樹(shù)脂。目前常用的離子交換樹(shù)脂分為三種形式： 27a. 純離子交換樹(shù)脂； b. 玻璃珠等硬芯子表面涂一層樹(shù)脂薄層構(gòu)成的表面層離子交換樹(shù)脂； c. 大孔徑網(wǎng)絡(luò)型樹(shù)脂。 CH=CH2 CH=CH2 CHCH2CHCH2CHCH2CH CH=CH2 CHCH2CHCH2CHCH2CH + 苯乙烯 二乙烯基苯 基體 典型的離子交換樹(shù)脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交聯(lián)共聚而成： 28按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹(shù)脂可分為 ：（樹(shù)脂上具有與樣品中陽(yáng)離子交換的基團(tuán)） 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 強(qiáng)酸性樹(shù)脂： 弱酸性樹(shù)脂 所帶基團(tuán)為磺酸基 （SO3-H+） ， 其中SO3和有機(jī)聚合物牢固結(jié)合形成固定部分，H+

14、是可流動(dòng)的能為其它陽(yáng)離子所交換的離子 （樹(shù)脂上具有與樣品中陰離子交換的基團(tuán)） 陰離子交換樹(shù)脂 強(qiáng)堿性樹(shù)脂 弱堿性樹(shù)脂 29樹(shù) 脂 分 類 樹(shù) 脂 本 質(zhì) 有效 pH 范圍 色譜分析應(yīng)用 1強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 磺化聚苯乙烯 114 陽(yáng)離子分族； 無(wú)機(jī)分離；鑭系化合物； 維生素 B；肽；氨基酸 2弱酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 羧酸聚甲醛，丙烯酸酯 514 陽(yáng)離子分族；生物化學(xué)分離；過(guò)渡性元素；氨基酸；有機(jī)堿；抗菌素 3強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂 季胺聚苯乙烯 012 陰離子分族；鹵素；生物堿；維生素 B；絡(luò)合物；脂肪酸 4弱堿型陰離子交換樹(shù)脂 聚胺聚苯乙烯或酚甲醛 09 各種金屬絡(luò)陰離子的分族；不同價(jià)的陰離子

15、氨基酸；維生素 表表 離子交換樹(shù)脂的類型及應(yīng)用離子交換樹(shù)脂的類型及應(yīng)用 304 排阻色譜法固定相排阻色譜法固定相 類 型 特 點(diǎn) 舉 例 無(wú)機(jī)填料 耐高溫、機(jī)械性能穩(wěn)定，但其表面有活性中心，具吸附性 多孔硅膠、多孔玻璃 有機(jī)填料 滲透性好，柱效高，但不宜長(zhǎng)期在高溫條件下使用 交聯(lián)聚苯乙烯凝膠 318.3.2 液相色譜流動(dòng)相液相色譜流動(dòng)相 1 選選擇流動(dòng)相要考慮的因素：擇流動(dòng)相要考慮的因素： （1）能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)； （2）與固定相不互溶（否則固定相流失），也不發(fā)生不可逆反應(yīng)； （3）粘度盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效； （4）應(yīng)與所用檢測(cè)器匹配。例如利用紫外檢測(cè)器時(shí)，溶

16、劑要不吸收紫外光； （5）容易精制、純化、毒性小、不易著火、價(jià)格盡量便宜 32 選擇流動(dòng)相的基本原則： 極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。 2 常用溶劑的極性常用溶劑的極性 長(zhǎng)保留時(shí)間 短保留時(shí)間 低極性 高極性 （甲醇） （乙醇） 氟代烷 石油醚 四氯化碳 環(huán)己烷 甲苯 苯 酯 氯仿 乙醚 二氯甲烷 甲乙酮 乙腈 醇 水 吡啶 有機(jī)酸 337.4 高效液相色譜儀簡(jiǎn)介高效液相色譜儀簡(jiǎn)介壓力表 色譜柱 貯液瓶 高壓泵 餾分 收集器 檢測(cè)器 記錄儀 進(jìn)樣系統(tǒng) 梯度洗提裝置 347.4.1 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器、高壓泵、梯高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器

17、、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。度洗脫裝置和壓力表等組成。 1溶劑貯存器溶劑貯存器 一般由玻璃、不銹鋼或氟一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為塑料制成，容量為1至至2 L，用來(lái)貯存足夠數(shù)量、，用來(lái)貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動(dòng)相。符合要求的流動(dòng)相。 2高壓輸液泵高壓輸液泵 對(duì)泵的要求是：輸出壓力高（對(duì)泵的要求是：輸出壓力高（150150500 500 kgcmkgcm-2-2左右的壓力）、流量范圍廣（一般在左右的壓力）、流量范圍廣（一般在0.10.110 mLmin10 mLmin-1-1范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)）、流量恒范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)）、流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，流量精度和重復(fù)性為定，無(wú)脈動(dòng)，流量精度和

18、重復(fù)性為0.5%0.5%左右。左右。此外，還應(yīng)能耐腐蝕，密封性好。此外，還應(yīng)能耐腐蝕，密封性好。35 高壓輸液泵，按其性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。 恒流泵 ：能給出恒定流量，其流量與流動(dòng)相粘度和柱滲透性無(wú)關(guān)。如往復(fù)式柱塞泵、注射式螺旋泵等 恒壓泵：保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。如氣動(dòng)泵就屬于此類。 36 3梯度洗脫（又稱梯度洗提、梯度梯度洗脫（又稱梯度洗提、梯度淋洗）裝置淋洗）裝置 梯度洗脫： 在分離過(guò)程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，以達(dá)到

19、提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。 37 梯度洗脫裝置的分類： 梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過(guò)不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來(lái)調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過(guò)色譜柱。 外梯度裝置 （又稱低壓梯度） 流動(dòng)相在常溫常壓下按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷V柱，僅需一臺(tái)泵即可。 內(nèi)梯度裝置 （又稱高壓梯度） 將兩種溶劑分別用泵增壓后，按設(shè)定的程序注入梯度室混合，再輸至柱系統(tǒng)。 387.4.2 進(jìn)樣系統(tǒng) (1) 組成和作用 進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。 （2）液相色譜的進(jìn)樣方式 A. 注射器進(jìn)樣裝置 B. 進(jìn)樣閥 常用六通閥，此法可直接向壓力系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)樣而不必停流。 396 5 4 3 2 1 工作 6 排放 泵 柱 針孔 定量管 5 4 3 2 1 準(zhǔn)備 407.4.3 分離系統(tǒng) 分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為26 mm，柱長(zhǎng)為1050 cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。417.4.4 檢測(cè)器 1 對(duì)檢測(cè)器的要求 靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、適用范圍廣、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。 42 2 檢測(cè)器的類型 溶質(zhì)型檢測(cè)器：它對(duì)