流式細(xì)胞儀構(gòu)造工作基本原理與數(shù)據(jù)分析

1、流式細(xì)胞儀構(gòu)造工作基本原理與數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometery, FCM）是）是20世紀(jì)世紀(jì)70年代發(fā)展起來的年代發(fā)展起來的一種一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，可同可以快速、準(zhǔn)確、客觀，可同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，并多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，并且可以對(duì)特定群體加以分選。且可以對(duì)特定群體加以分選。=研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等=研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量。流式細(xì)胞儀是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、流式細(xì)胞儀是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算

2、機(jī)以及細(xì)胞熒光化學(xué)光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)為一體的新型高科技儀器。技術(shù)為一體的新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)=單個(gè)細(xì)胞或微粒分析=同時(shí)多參數(shù)分析=速度快：10000個(gè)細(xì)胞(微粒)/秒=統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況=分選感興趣的細(xì)胞或微粒其結(jié)構(gòu)一般分為其結(jié)構(gòu)一般分為5部分：流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系部分：流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；激光光源及光束形成系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信統(tǒng)；激光光源及光束形成系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號(hào)檢測(cè)、存儲(chǔ)、顯示分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)。號(hào)檢測(cè)、存儲(chǔ)、顯示分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)。（一）流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（一）流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 流動(dòng)室是儀器核心部

3、件，被測(cè)樣品在此與激流動(dòng)室是儀器核心部件，被測(cè)樣品在此與激光相交。流動(dòng)室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻光相交。流動(dòng)室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個(gè)孔徑為璃中央開一個(gè)孔徑為430m180m的長方形的長方形孔，供細(xì)胞單個(gè)流過，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，這孔，供細(xì)胞單個(gè)流過，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，這種流動(dòng)室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細(xì)胞種流動(dòng)室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細(xì)胞受照時(shí)間長，可收集的細(xì)胞信號(hào)光通量大，配上受照時(shí)間長，可收集的細(xì)胞信號(hào)光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測(cè)靈敏度和測(cè)量廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測(cè)靈敏度和測(cè)量精度。精度。 流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液，鞘液的作用是將樣品流

4、動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液，鞘液的作用是將樣品流環(huán)包，鞘液流是一種穩(wěn)定的液體流動(dòng)，鞘液流環(huán)包，鞘液流是一種穩(wěn)定的液體流動(dòng)，鞘液以勻速運(yùn)動(dòng)流過流動(dòng)室，在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行中流以勻速運(yùn)動(dòng)流過流動(dòng)室，在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行中流速是不變的，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體速是不變的，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學(xué)聚焦，使樣品流不會(huì)脫離液流的軸線方向，力學(xué)聚焦，使樣品流不會(huì)脫離液流的軸線方向，并且保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，并且保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)( (二二) )激光光源與光束形成系

5、激光光源與光束形成系統(tǒng)統(tǒng)目前臺(tái)式機(jī)目前臺(tái)式機(jī)FCM，大多采用氬離子氣體激光，大多采用氬離子氣體激光器。激光器。激光(laser)是是種相干光源，它能提供種相干光源，它能提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細(xì)胞快速流弱熒光快速分析的理想光源。由于細(xì)胞快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1s左右，左右，每個(gè)細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)每個(gè)細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞需要足夠的光照強(qiáng)度。

6、因此細(xì)胞需要足夠的光照強(qiáng)度。 激光光束在達(dá)到流動(dòng)室前，先經(jīng)過透鏡將其聚焦，形成幾何尺寸約為22m66m，即短軸稍大于細(xì)胞直徑的光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布，為保證樣品中細(xì)胞受到的光照強(qiáng)度一致，須將樣本流與激光束正交，且相交于激光能量分布峰值處。( (三三) ) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng) FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成， 主要光學(xué)原件是濾光片，主要分成3類：長通濾片(long-pass filter，LP)、短通濾片(short-pass filtr，SP)及帶通濾片(band-pass filter，BP)。它們分別將不同波長的熒

7、光信號(hào)送到不同的電子探測(cè)器 LONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)Pass Through Filters600/100 Band Pass (600/100)Transmitted 550 nm550 - 650 nm (60050)Wavelengths Blocked650 nm550 nm650 nmShort PassLong PassBand PassLONG (700nm)550 Long Pass (650LP)650 Short Pass (600SP)SHORT (500nm)

8、Dichroic FiltersTransmitted 550 nmDiflected 90650 nm550 nm( (四四) ) 信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)與分析系統(tǒng)1散射光信號(hào)：散射光分為前向角散射(forward scatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向角散射(side scatter,SSC)，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。以上兩種信號(hào)都是來自激光的原光束，其波長與激光的波長相同。 前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射（側(cè)向角散射（SSC, Side

9、 Scatter）細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性(1)前向角散射：前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)，確切地說，它與細(xì)胞直徑的平方值密切相關(guān)。通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾。(2)側(cè)向角散射：側(cè)向角散射是指與激光束正交90方向的散射光信號(hào)，側(cè)向散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。 2熒光信號(hào) 激光的作用原理激光的作用原理 (1)(1)熒光信號(hào)的線性測(cè)量與對(duì)數(shù)測(cè)量熒光信號(hào)的線性測(cè)量與對(duì)數(shù)測(cè)量 當(dāng)攜帶熒光素的細(xì)胞與激光正交時(shí)，受激發(fā)發(fā)出熒光，經(jīng)過濾光片分離不同波

10、長的光信號(hào)分別到達(dá)不同的光電倍增管(PMT)，PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。電信號(hào)輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對(duì)數(shù)放大。 細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。 在細(xì)胞膜表面抗原等的檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時(shí)要相差幾十倍，甚至幾萬倍。如用線性放大器，將無法在一張圖上清晰地將細(xì)胞陽性群、陰性群同時(shí)顯示出來通常使用對(duì)數(shù)放大器，如果原來輸出是1，當(dāng)輸入增大到原來的10倍時(shí)，輸出為2；當(dāng)輸入增大到原來的100倍時(shí)，輸出為3等。 (2)熒光信號(hào)的面積和寬度 所謂熒光信號(hào)的面積是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行所謂熒光信號(hào)的面積是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量，一般對(duì)積

11、分測(cè)量，一般對(duì)DNA含量測(cè)量時(shí)，均采用含量測(cè)量時(shí)，均采用面積面積(FL2A)來計(jì)算。這是因?yàn)闊晒饷}沖的來計(jì)算。這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的的含量。含量。 熒光信號(hào)的寬度熒光信號(hào)的寬度(如如FL2W)常用來區(qū)分雙聯(lián)常用來區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞體細(xì)胞 (3)光譜重疊的校正光譜重疊的校正 使用熒光補(bǔ)償電路 合理設(shè)置熒光信號(hào)的補(bǔ)償值。 ( (五五) FCM) FCM測(cè)量數(shù)據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)的的存儲(chǔ)、顯示和分的的存儲(chǔ)、顯示和分析析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析=數(shù)據(jù)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)存儲(chǔ): LIST : LIST MODEMODE=數(shù)據(jù)顯示數(shù)據(jù)顯示: : 直方圖

12、直方圖 ( Histogram )( Histogram )二維點(diǎn)圖二維點(diǎn)圖(Dot Plot)(Dot Plot)等高線圖等高線圖(Contour Plot)(Contour Plot)密度圖密度圖 (Density)(Density)三維圖（三維圖（3D Plot3D Plot）等）等FSC SSC FL1 FL2Eventvent 210016024585Event 3300650160720單參數(shù)直方圖 每一個(gè)細(xì)胞單參數(shù)的測(cè)量數(shù)據(jù)可整理成分布統(tǒng)計(jì)，以分布直方圖(distribution histogram)來顯示。在圖中，橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度

13、的值，其單位是道數(shù)，橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的，縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù) DNA含量直方圖和抗原表達(dá)直方圖含量直方圖和抗原表達(dá)直方圖 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示是用于表達(dá)來自同一細(xì)胞兩個(gè)參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，常用的表達(dá)方法有二維點(diǎn)圖(dot plot)、等高線圖(contour plot)、二維密度圖(density plot)。在二維圖中，x坐標(biāo)為某細(xì)胞一個(gè)參數(shù)的數(shù)值，而Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的數(shù)值。從雙參數(shù)圖形中可以將各細(xì)胞亞群區(qū)分開，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息。 外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）（紅細(xì)胞溶解后）雙色熒光標(biāo)記細(xì)胞散點(diǎn)圖雙色熒光標(biāo)記細(xì)胞散點(diǎn)圖=等高圖和密度圖分析等高圖和密度圖分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析=三維圖分析三維圖分析流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用=樹突細(xì)胞研究樹突細(xì)胞研究=干細(xì)胞研究干細(xì)胞研究=癌癥病人的多藥耐藥性癌癥病人的多藥耐藥性=細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究=環(huán)境微生物分析環(huán)境微生物分析=流式細(xì)胞術(shù)與分