MMFSCNG嬰幼兒配方食品和乳粉肌醇的測(cè)定

1、MMFSCNG02嬰幼兒食品乳粉肌醇微生物法氣相色譜法MM_FS_CNG_0207嬰幼兒配方食品和乳粉肌醇的測(cè)定1.適用范圍方法一適用于嬰幼兒配方食品和乳粉中肌醇的測(cè)定，方法二適于乳粉中肌醇的測(cè)定.方法一：微生物法2,原理概要：通過Saccharomycesuvarum的生長(zhǎng)情況來評(píng)價(jià)肌醇的含量。3 .主要試劑和儀器.主要試劑、菌種和培養(yǎng)基鹽酸（體積比為1:1）、氫氧化鈉（1mol/L）、肌醇標(biāo)樣（無水晶體）。菌不中:Saccharomycesuvarum。培養(yǎng)基：鏈抱霉菌瓊脂培養(yǎng)基：3號(hào)蛋白陳5g,酵母浸膏5g,麥芽糖40g,瓊脂15g。肌醇測(cè)定用培養(yǎng)基：葡萄糖100g，檸檬酸鉀10g，檸檬

2、酸2g,磷酸二氫鉀，氯化鉀,硫酸鎂,氯化鈣,硫酸鎰50mg氯化亞鐵50mgDL色氨酸80mgL-胱氨酸，L異亮氨酸，匚賴氨酸，L.蛋氨酸，DL-苯基丙氨酸，匚酪氨酸，匚天門冬酰胺，DL.天門冬氨酸，DL-絲氨酸，甘氨酸,DL.蘇氨酸，.繳氨酸組氨酸，L-脯氨酸,DL.丙氨酸JL.谷氨酸，精氨酸，鹽酸硫胺素500pg,生物素16pg,泛酸鈣5mg,鹽酸毗哆醇1mg加蒸儲(chǔ)水至1000mL,土（250。,儀器pH計(jì)；比色儀；250mL圓底燒瓶，與冷凝器連接的錐形玻璃接頭。4 .樣品制備.貯備菌種的制備從純菌種中轉(zhuǎn)接2個(gè)以上已制備好的麥芽浸出汁瓊脂斜面。30C培養(yǎng)1624h。貯于冰箱中，保存期不要超過

3、2周，然后再轉(zhuǎn)接到新的瓊脂斜面上。接種的準(zhǔn)備：最好在使用的當(dāng)天從貯備菌種中轉(zhuǎn)接到新配制的麥芽浸出汁瓊脂斜面上，30（培養(yǎng)1624h。用接種環(huán)無菌地轉(zhuǎn)接該菌種到一個(gè)滅菌生理鹽水中，直到得到一定濃度菌體細(xì)胞的懸浮液。為了測(cè)定，制備一個(gè)酵母菌懸浮水溶液，這個(gè)懸浮液中酵母菌的濃度在mL分光光度計(jì)事先用水調(diào)到100%透光率，然后測(cè)定這個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)”酵母菌的透光率。將新接種斜面中的菌體細(xì)胞移入到無菌生理鹽水中，其濃度直到達(dá)到與上述標(biāo)準(zhǔn)溶液具有相同的透光率為止。標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)貯備液（肌醇的濃度為mL：稱取100mg肌醇（該肌醇標(biāo)樣已放在干燥器中干燥24h），于容量瓶中用水稀釋至500mL貯于冰箱。標(biāo)準(zhǔn)工作液（肌醇

4、的濃度為2pg/mL）:吸取5mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用水稀至500mL定容。當(dāng)天制備。5 .過程簡(jiǎn)述,樣品的處理底燒瓶中5加干粉樣品：精確稱取一定量樣品，這些樣品中約含肌醇，移入250mL100mL鹽酸（1:1），繼續(xù)步驟。液體樣品：吸一定量樣品，這些樣品中約含肌醇，加100mL鹽酸，繼續(xù)步驟。將裝樣品的圓底燒杯與冷凝器聯(lián)結(jié)，經(jīng)過6%通過蒸儲(chǔ)將鹽酸除去。將剩余物用蒸儲(chǔ)水沖到燒杯中，用1mol/L氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)至±。稀釋至250mL過濾，棄去前部幾毫升。這個(gè)溶液肌醇的濃度均為23g/mL。.標(biāo)準(zhǔn)曲線按表1順序加入蒸鐳水、標(biāo)準(zhǔn)溶液于培養(yǎng)管中，一式三份表1試管號(hào)No.1234567蒸儲(chǔ)

5、水，mLr5r54321:0:標(biāo)準(zhǔn)溶液,mL0012345,測(cè)定液按表2順序加入蒸儲(chǔ)水、樣品溶液于培養(yǎng)管中，一式三份表2試管號(hào)No.1234蒸鏘水，mL4321樣品溶液，mL1234,熱處理用棉塞或不銹鋼帽蓋住所有試管，100蒸汽蒸10min。,接種冷卻試管至30C以下。無菌添加接種物于基礎(chǔ)貯備培養(yǎng)基中，以每100mL添加2mL的比例添加，混合，將上述已接種的培養(yǎng)基無菌加入到和的每個(gè)測(cè)定管中，每管加5mL（其中標(biāo)準(zhǔn)曲線中號(hào)試管只加5mL未接種的培養(yǎng)基）。J立蘭J口喬將試管固定在機(jī)械振蕩器上,以每分鐘振蕩100200次的往復(fù)運(yùn)動(dòng)中，2830C之間選擇一個(gè)恒定溫度（土C）培養(yǎng)2224h。,測(cè)定從振

6、蕩器上取下試管，于100C蒸5min或每管加1滴殺菌劑（Thoral），以使其停止生長(zhǎng)。試管被任何外來微生物污染則測(cè)定無效。通過對(duì)每個(gè)試管的視覺檢查進(jìn)行反應(yīng)的預(yù)測(cè)，未接種管是清的，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中應(yīng)無其他微生物生長(zhǎng)。充分混合每一個(gè)試管（也可以加一滴消泡劑），將反應(yīng)液加到比色皿內(nèi)，攪拌內(nèi)容物，將比色皿放入到分光光度計(jì)的比色池內(nèi)，波長(zhǎng)為540660nm讀出透光率或吸光度，穩(wěn)定30s，每個(gè)試管穩(wěn)定時(shí)間要相同。對(duì)于未接種管，將其透光率調(diào)到100%或吸光度為0），讀出其他接種空白管的讀數(shù)。將接種空白管的透光率調(diào)到100%或吸光度為0），依次讀出其他每個(gè)管。對(duì)每個(gè)水平的測(cè)試溶液，計(jì)算每毫升中維生素的含量，

7、計(jì)算所得值的平均數(shù)，每個(gè)管測(cè)得值不得超過該平均值的土15%。如果所得到的管數(shù)，少于所測(cè)定的四種水平的稀釋液的管數(shù)的2/3，用于計(jì)算樣品濃度的數(shù)據(jù)是不充分的。如果剩余管數(shù)是原來管數(shù)的2/3或更多，則可根據(jù)平均值計(jì)算其樣品的含量。注：不可使用金屬帽（除了不銹鋼蓋），這是由于試管在培養(yǎng)振蕩過程中有金屬污染的可能性。6 .結(jié)果計(jì)算X250樣品中肌醇的含量（mg/100g或mg/100mL）=-xHx100（1）m1000式中：x測(cè)定管中每毫升測(cè)試溶液中肌醇含量的平均值，Pg：m樣品的質(zhì)量或體積，g或mL7,允許差同一樣品兩次測(cè)定值之差不得超過兩次測(cè)定平均值的10%。方法二.氣相色譜法8 .原理概要樣品

8、中的肌醇與衍生劑反應(yīng)后，經(jīng)氣相色譜時(shí)行分離定量。9 .主要試劑和儀器,主要試劑N.三甲基硅基咪口坐、三甲基氯硅烷。,儀器氣相色譜儀：FID檢測(cè)器。色譜柱：50%Phenylmethylcloxane,Db-17（J&w）。idm。10 .過程簡(jiǎn)述,準(zhǔn)確稱取1g樣品于燒杯中，用溫水溶解，轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中，定容。取該溶液放入小試管中作為測(cè)定液。,準(zhǔn)確稱取50mg肌醇標(biāo)樣于小燒杯中，用水溶解，轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中，定容。用吸量管取該溶液5mL于一100mL容量瓶中，用水定容。取此溶液2mL于小試管中。.將上述分別含有樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管冷凍干燥。于每個(gè)試管中加1mL內(nèi)標(biāo)溶液（每毫升毗口定中含的慈），蓋緊塞子，放置15mino于每個(gè)試管中加的N-三甲基硅基咪口坐和L，混合，靜置15min后進(jìn)樣。,氣相色譜條件：a）柱溫：140260E（5C/min）;b）檢測(cè)器：FID;c）檢測(cè)器溫度：280C；d）進(jìn)樣器：split（1:40）;e）進(jìn)樣器溫度：280C；f）進(jìn)樣體積：1口L;g）流速：min。11 .結(jié)果計(jì)算A/Ab200xcx200樣品中肌醇含量(mg