多藥耐藥基因的臨床意義與檢測(cè)方法

1、多藥耐藥基因的臨床意義與檢測(cè)方法1MDR 概念腫瘤細(xì)胞耐藥性可分為內(nèi)在性耐藥(intrin sic drug resista nee 和獲得性 耐藥(acquired drug resista nee 兩類(lèi)，既原發(fā)地存在于某些腫瘤中， 稱(chēng)內(nèi)在性 耐藥；繼發(fā)于化療后，稱(chēng)獲得性耐藥。根據(jù)耐藥譜可分為原藥耐藥(primary drug resistance,PDR 和多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)。PDR 只對(duì)誘導(dǎo)原藥產(chǎn)生耐藥，而對(duì)其它藥物不 產(chǎn)生交叉耐藥。 而 MDR 是一種藥物誘發(fā)， 而同時(shí)對(duì)其它多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī) 制完全不同抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥。內(nèi)在性耐藥原因仍不清

2、楚，而獲得性 耐藥是由于變異耐藥腫瘤細(xì)胞亞群過(guò)渡生長(zhǎng)所致。內(nèi)在性耐藥與獲得性耐 藥作為一種獨(dú)特耐藥現(xiàn)象是成功地治療腫瘤關(guān)鍵性難題，因而成為近幾年 國(guó)內(nèi)外研究和探索熱點(diǎn)。2MDR 耐藥機(jī)制1970 年 Biedler 和 Riehm 首先描述了 MDR 表型：一種藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生耐 藥細(xì)胞株可用對(duì)其它多種化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能完全不同化療藥物產(chǎn)生耐藥。他 們發(fā)現(xiàn)對(duì)放線菌 D 耐藥細(xì)胞，同時(shí)也對(duì)多種抗腫瘤抗生素如柔紅霉素等， 以及結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制迥異植物堿類(lèi)抗腫瘤藥如長(zhǎng)春新堿等交叉耐藥。 1976 年，Julia no 等最先在耐藥中國(guó)蒼鼠卵巢細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種新與耐藥程度呈數(shù) 量關(guān)系高分子量細(xì)胞膜糖蛋白，命名為

3、P 糖蛋白(p-glycopratain,p-gp)。因其 分子量為 170kda,又名 pgp170，認(rèn)為此蛋白可降低細(xì)胞膜對(duì)藥物通透性而 引起耐藥。后來(lái)又陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在不同來(lái)源多藥耐藥細(xì)胞中這種P 糖蛋白分子量范圍在 130180kda,主要集中在 150180kda,它由多藥耐藥基因 MDR編碼。近十幾年，國(guó)外已從耐藥腫瘤細(xì)胞株中分離出耐藥基因 MDR1 和它表達(dá) P糖蛋白。1986 年 chen 等克隆了編碼 P 糖蛋白 cDNA :2。2.1MDR 基因家族在哺乳動(dòng)物， MDR 基因是一較小相對(duì)保守基因家族。 在人類(lèi)基因組中， 它含有兩個(gè)基因 MDR1 和 MDR2，在嚙齒類(lèi)由三個(gè)基

4、因組成： MDR1 , MD R2，MDR3。2.2MDR 基因基因圖譜研究表明人類(lèi) MDR 兩種基因定位于第 7 號(hào)染色體 q21.1 帶 3 30kb中。含有 28 個(gè)外顯子，28 個(gè)外顯子序列與 cDNA 完全一致，cDNA 全長(zhǎng) 4.5kb。在不同細(xì)胞系中 MDR1 啟動(dòng)子顯示活性不同，其增加子活性亦 不同，因此 MDR1表達(dá)呈組織特異性。2.3MDR 基因表型MDR 基因表型是與其基因產(chǎn)物 P 糖蛋白有關(guān)。許多研究表明，MDR 表型表現(xiàn)為 MDR 基因過(guò)度表達(dá)伴有或不伴有基因擴(kuò)增。 研究發(fā)現(xiàn)， 在耐藥 程度低耐藥細(xì)胞系，可無(wú) MDR 基因擴(kuò)增，只有 MDR 基因表達(dá)增加 （即 mR

5、NA 表達(dá)增加，P 糖蛋白功能增強(qiáng)）。此時(shí)低度耐藥細(xì)胞 P 糖蛋白功能增加是 由于 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平增高，而非基因拷貝增加所致。MDR 表型最突出特點(diǎn)是其編碼 P 糖蛋白功能增加而導(dǎo)致產(chǎn)生了多藥耐 藥性。因此 P 糖蛋白是 MDR 基因表型標(biāo)志。2.4P 糖蛋白MDR 基因編碼 P 糖蛋白是分子量約為 170Kda 胞膜蛋白，由 1280 個(gè)氨 基酸組成，同源雙鏈，每條鏈有 6 個(gè)跨膜疏水區(qū)，其構(gòu)成三個(gè)跨膜孔有一 個(gè)細(xì)胞內(nèi)核苷糖連接點(diǎn)可能與 ATP 連接并發(fā)生水解作用。通常認(rèn)為，P 糖 蛋白具有一種能量依耐跨膜藥物外輸泵功能，當(dāng)腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物接觸 時(shí)，脂溶性藥物濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，而 P

6、糖蛋白則結(jié)合藥物分子，同時(shí)其 A TP 結(jié)合位點(diǎn)連上 ATP, ATP水解后釋放能量將藥物從胞內(nèi)泵出胞外，藥物 在胞內(nèi)濃度不斷下降，其細(xì)胞毒作用因而減弱甚至喪失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。人類(lèi) MDR1 和 MDR2 兩種基因分別編碼了兩種結(jié)構(gòu)相似,功能不同 P 糖蛋白，MDR1 和 MDR2 兩種基因及其所編碼兩種 P 糖蛋白具有高度同源 性,其同源性達(dá) 80%,然而這兩種基因產(chǎn)物表達(dá)卻呈組織特異性而且有不 同生理功能。 MDR1表達(dá)產(chǎn)物可將親脂類(lèi)化療藥泵出細(xì)胞外,因而有耐藥 特性； MDR2 表達(dá)產(chǎn)物則主要分布在骨骼肌纖維上,可將肌纖維代謝產(chǎn)物, 如激素等轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外,無(wú)轉(zhuǎn)運(yùn)親脂類(lèi)藥物功能,故不具多藥耐

7、藥性作用。然而在最近研究報(bào)告中這種基因仍然作為一個(gè)重要提示,即治療前髓性白 血病 B 細(xì)胞出現(xiàn)高表達(dá) 1。3在正常組織及腫瘤組織中 MDR1 基因表達(dá)3.1在正常組織中 MDR1 基因表達(dá)認(rèn)識(shí) P 糖蛋白在體內(nèi)正常表達(dá)進(jìn)行和功能是重要。P 糖蛋白在正常人體 細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)，表明 MDR 基因并非異常基因，P 糖蛋白并非是一種異常 蛋白，而且具有一定生理功能。了解 MDR1 基因在正常組織中表達(dá)，具有 三個(gè)作用。（1）為了建立一個(gè)腫瘤中 MDR1 表達(dá)增加基線。 （2）增加我們關(guān)于 正常 P-gp 生理功能知識(shí)。 （3）更好了解在緩解人類(lèi)腫瘤耐藥方面潛在作用。 正常組織中分為高、中、低三個(gè)表達(dá)水

8、平。腎上腺、腎臟高水平表達(dá)；肺、 肝、結(jié)腸、空腸、直腸中等表達(dá)；而皮膚、骨骼肌、心肌、脾、食道、胃、 卵巢、骨髓等則低表達(dá)或不表達(dá)。可以發(fā)現(xiàn) MDR1 表達(dá)主要是在具有分泌 和排泄功能器官組織特殊上皮細(xì)胞中，其功能為降低有害外源性物質(zhì)對(duì)細(xì) 胞損害，具有正常生理保護(hù)功能。維持血腦、血睪丸及血胎盤(pán)屏障（腦組織及睪丸組織血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤(pán)滋養(yǎng)葉細(xì)胞 MDR1 基因表達(dá)水平高 ）。已有 報(bào)道 MDR 基因及其產(chǎn)物在正常細(xì)胞防御中起著不可忽略作用， 尤其是對(duì)化 學(xué)致癌物及化學(xué)毒素防御 1， 7， 4。3.2在實(shí)體腫瘤中 MDR1 基因表達(dá)如前所述，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性分為內(nèi)在性耐藥與獲得性耐藥兩類(lèi)。 在腫

9、瘤細(xì)胞中，MDR1 表達(dá)與腫瘤細(xì)胞組織起源有關(guān)。 臨床研究發(fā)現(xiàn)， 實(shí) 體腫瘤中 MDR1基因表達(dá)分四組：第一組癌癥通常表達(dá)高水平 MDR1mRN A。大多數(shù)本組腫瘤正常組織中存在中間至高水平 P-gp 170 表達(dá)，如腎細(xì) 胞癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、嗜絡(luò)細(xì)胞瘤等。臨床發(fā)現(xiàn)這些 腫瘤顯示出對(duì)治療不敏感性 （那就是說(shuō)存在內(nèi)在性耐藥 ）。第二組所包括癌癥 偶然表達(dá)高水平 MDR1mRNA（ 中間 MDR1 表達(dá)水平 ）、如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、 軟 組織肉瘤、乳腺癌，本組腫瘤趨向比第一組治療效果好，不幸是本組經(jīng)過(guò) 化療后常常得到獲得性耐藥。第三組所包括腫瘤罕見(jiàn) MDR1mRNA 表達(dá)（幾 乎所有

10、都沒(méi)檢測(cè)到或低 MDR1 表達(dá)）如卵巢癌、食道癌、wilms 瘤、膀胱癌、 肺癌等。本組腫瘤通?；熤委熓怯行?，但許多腫瘤通過(guò)藥物刺激將發(fā)展 為獲得性耐藥。第四組包括腫瘤經(jīng)過(guò)化療后 MDR1基因表達(dá)水平提高。3.3在惡性血液學(xué)方面檢測(cè) MDR1 基因表達(dá)許多血液失調(diào)病人在治療過(guò)程中發(fā)展成為耐藥。由此 MDR 概念產(chǎn)生 研究白血病病人耐藥最大優(yōu)勢(shì)是不論治療前與治療后都很容易獲得腫瘤標(biāo) 本，且不受腫瘤大小、存在部位和血管血流等非耐藥因素影響。因此與實(shí) 體腫瘤相比惡性血液病人 MDR1 表達(dá)數(shù)據(jù)是回歸性且經(jīng)過(guò)了化療治療。在正常血液細(xì)胞內(nèi) (全骨髓、 脾、純凈淋巴細(xì)胞 )發(fā)現(xiàn)低和非常低 MDR1 水平

11、表達(dá)。在幾乎所有類(lèi)型白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤不 論治療或未經(jīng)治療病人都有 MDR1 水平增高報(bào)道， MDR1 水平可以在一個(gè) 由低到高范圍甚至在未治療病人中出現(xiàn)高水平表達(dá)。我們用非同位素原位 雜交方法檢測(cè)正常人骨髓 MDR1mRNA 表達(dá)陽(yáng)性率低于 10%，強(qiáng)度為弱陽(yáng) 性。惡性血液病在 MDR1 表達(dá)方面可以分為三個(gè)不同組。 第一組 MDR1 水 平通常在未治療前增高即內(nèi)在性耐藥腫瘤， 如 CML 在其復(fù)發(fā)期。 第二組為 未經(jīng)治療癌癥病人 MDR1 水平偶爾提高，如成人急性淋巴性白血病 (ALL) 、 成人急性非淋巴細(xì)胞白血病 (ANLL) 、何杰金氏淋巴瘤。第三組，在有些癌 癥

12、中經(jīng)治療復(fù)發(fā)時(shí)， MDR1 水平提高，包括 ALL 、ANLL 。在臨床急性白血病研究中發(fā)現(xiàn)， MDRImRNA 陽(yáng)性組緩解率(CR)，明 顯低于 MDRImRNA 陰性組 CR,并且 MDRImRNA 陽(yáng)性患者達(dá)到緩解而 需療程較MDR1 陰性患者長(zhǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道 MDR1 基因表達(dá)陽(yáng)性初治患者 C R 率為 27%60% :7,而 MDR1 基因表達(dá)陰性者 CR 率為 72%90%,說(shuō) 明 MDR1 基因表達(dá)是導(dǎo)致誘導(dǎo)緩解失敗主要原因。4MDR1 基因表達(dá)研究臨床意義研究 MDR1 基因表達(dá)與臨床化療關(guān)系,是從分子水平而非細(xì)胞水平來(lái) 探討腫瘤對(duì)化療藥物敏感性與耐受性,可用來(lái)預(yù)測(cè)病人對(duì)化療反應(yīng)

13、以及化 療過(guò)程中療效判斷和監(jiān)測(cè)預(yù)后,可望使腫瘤在更高水平上進(jìn)行治療和觀察, 使化療個(gè)體化,臨床醫(yī)生可根據(jù)每個(gè)病人 MDR1 表達(dá)水平判斷耐藥程度, 合理地制定化療方案,具體來(lái)講 2：(1)預(yù)測(cè)病人對(duì)化療藥物敏感性與耐 受性,有針對(duì)性地選擇最有效藥物,避免盲目用藥,減少不必要毒副作用。(2) 化療過(guò)程中,若 MDR1 表達(dá)逐漸增高,要注意獲得性多藥耐藥性發(fā)生, 及時(shí)調(diào)整化療方案。 (3)在未進(jìn)行化療前, MDR1 即顯高表達(dá),表示存在內(nèi) 在性多藥耐藥性，可考慮使用 MDR 逆轉(zhuǎn)劑配合抗癌藥物化療。 (4)預(yù)測(cè)腫 瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。 (5)在研究中評(píng)價(jià) MDR 逆轉(zhuǎn)藥物療效。與 MDR1 基因相

14、關(guān)化療藥物包括 (1) 烷化劑類(lèi)。 (2)植物堿類(lèi)抗腫瘤藥。(3) 抗腫瘤抗生素類(lèi)。 (4)激素類(lèi)等。通常為分子量大親脂類(lèi)化合物。與 MD R1基因無(wú)關(guān)化療藥物包括(1)抗代謝類(lèi)藥物，如 5-氟脲嘧啶等。(2)鉑類(lèi)化合 物如順鉑等 2， 5。由于 MDR 相關(guān)化療藥物包括了常用抗癌藥絕大部分，可供 MDR1 高 表達(dá)病人選擇使用抗癌藥所剩無(wú)幾。如何克服 ?目前研究方向之一是選擇逆 轉(zhuǎn)劑。所謂逆轉(zhuǎn)劑機(jī)理是，逆轉(zhuǎn)劑能與耐藥細(xì)胞表面P 糖蛋白結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制 P 糖蛋白與化療藥物結(jié)合，阻止化療藥物從細(xì)胞內(nèi)流出，從而提高 細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，增強(qiáng)化療效果。(圖 1B)目前發(fā)現(xiàn)可逆轉(zhuǎn) MDR 藥物包 括

15、(1)鈣通道阻滯劑；如異博定。 (2)鈣調(diào)蛋白拮抗劑：如環(huán)胞菌素 A 等。 (3) 抗心律失常藥：如潘生丁，心得安等。目前主要用于臨床是異博定 (VRP) 和環(huán)胞霉素 A(CSA) ，但都存在一定毒副作用。如果還存在其它耐藥機(jī)制則 影響逆轉(zhuǎn)效果。5MDR 檢測(cè)方法 隨著分子生物學(xué)發(fā)展，檢測(cè)手段不斷增加。目前主要從分子水平、蛋 白水平、細(xì)胞水平多途徑展開(kāi)了研究。5.1 分子水平 由于人腫瘤細(xì)胞幾乎不存在 MDR1DNA 擴(kuò)增，因此，無(wú)法 檢測(cè) DNA變化，主要是檢測(cè) MDR1mRNA 表達(dá)水平。常用方法包括： RT- PCR、原位雜交(ISH)、Slot-blot(SB)、Northern bl

16、ot(NB)、RNase 保護(hù)實(shí)驗(yàn) 等12。5.2 蛋白水平 免疫組織化學(xué)法(IHC)，免疫熒光等。常用 P-gp 特異性單 克隆抗體有 JSB-1、 MRK1 、 C219、 U12、 HYB-612 等，不同單抗識(shí)別不同 抗原決定簇，每種單抗特異性和親合力不完全相同。5.3細(xì)胞水平 檢測(cè)細(xì)胞藥物輸出功能，采用熒光染料如若丹明 -123 或具 有天然熒光柔紅霉素與細(xì)胞共同培養(yǎng)后，用熒光分光度計(jì)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞內(nèi) 藥物濃度，與對(duì)照組比較判定細(xì)胞耐藥程度。最近國(guó)外使用流式細(xì)胞儀， 高分析技術(shù)(掃描激光和聚焦顯微鏡)等先進(jìn)設(shè)備對(duì) P-gp 進(jìn)行功能檢測(cè)。Pi wneca-Worns 等描述一個(gè)人造 r

17、 散射锝洛合物 hexakis 99MTC SESTAMI BI 對(duì) P-gp170 進(jìn)行功能圖象分析。99MTC SESTAMIBI 是一脂性具有放 射性藥物性陽(yáng)離子其可被多藥轉(zhuǎn)移機(jī)制主動(dòng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這項(xiàng)技術(shù)通過(guò)有價(jià)值 r 散射性99MTC 進(jìn)行 P-gp170 功能測(cè)試，是一個(gè)新穎快速測(cè)定人體內(nèi)腫 瘤細(xì)胞 P-gp170 表達(dá)方法。以上各種方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)。綜合評(píng)價(jià)： (1)敏感性， PCRISHPGP SB、NB 及細(xì)胞功能測(cè)定。(2)特異性，PCR、ISHPGPSB、NB 及細(xì)胞功 能測(cè)定2，12。目前 MDR1 基因檢測(cè)強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)重要性。要求標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)為：既要有 足夠靈敏性以檢測(cè)小體積樣本

18、中 MDR1 基因表達(dá)，并且能定量且能區(qū)別出 正常組織表達(dá)還是腫瘤組織表達(dá)。要想達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)，幾種實(shí)驗(yàn)組合會(huì)給臨 床提供更確切信息。且參與實(shí)驗(yàn)室須規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告及進(jìn)行質(zhì)量控制 1， 7。由于上面介紹這些檢測(cè)技術(shù)不論是在靈敏性方面還是特異性方面都不 可避免地受到一因素限制。這些因素導(dǎo)致我們不論是對(duì)正常組織還是惡性 腫瘤組織 MDR方面檢測(cè)都出現(xiàn)相互矛盾結(jié)果。 當(dāng)然抗腫瘤藥物耐藥過(guò)程復(fù) 雜性，及一些外在其它因素如腫瘤組織變異，其它耐藥機(jī)制存在和低水平 MDR 標(biāo)志表達(dá)等因素都會(huì)導(dǎo)致一些相互矛盾結(jié)果。 還有以前治療因素影響 MDR 表型及實(shí)驗(yàn)時(shí)間不適當(dāng)?shù)纫蛩囟紩?huì)導(dǎo)致 MDR 表達(dá)與引起化療困難結(jié) 果不

19、一致。要解決這些問(wèn)題我們還有大量工作要做。作者單位：張真路 (430050 武漢市漢陽(yáng)鐵路中心醫(yī)院病理科 ) 吳人亮 (同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)病理教研室 )參考文獻(xiàn)：1sglke van der Heyden.P-Glycoprotein:clinical significance and Met hodsof Analysis.CIinical Laboratory Scienee, 1995, 32(3): 221 2642柏珊，多藥耐藥基因與腫瘤化療、白血病現(xiàn)代分型 .中國(guó)抗癌協(xié)會(huì) 腫瘤標(biāo)志委員會(huì), 1995, 89 923蘇慧慈,原位雜交 .北京:中國(guó)技術(shù)出版社, 1994, 592294Cor

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