第四章補(bǔ)充—沉淀分離與結(jié)晶

1、 通過改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)的溶解度降通過改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)的溶解度降低而以固體形式從溶液中分離出的一種低而以固體形式從溶液中分離出的一種操作技術(shù)。操作技術(shù)。 鹽析法鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法 結(jié)晶法結(jié)晶法2定義：鹽析法是利用各種生物定義：鹽析法是利用各種生物分子分子在濃鹽溶液中溶解度的在濃鹽溶液中溶解度的差異差異，通過向溶液中引入一，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使定數(shù)量的中性鹽，使目的物目的物或或雜蛋白雜蛋白以沉淀以沉淀析出析出，達(dá)到，達(dá)到純化目的的方法。純化目的的方法。優(yōu)點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性優(yōu)點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：分辨率不高，要除鹽缺點(diǎn)

2、：分辨率不高，要除鹽3兩種現(xiàn)象：兩種現(xiàn)象：鹽溶鹽溶：低鹽情況，鹽離：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大質(zhì)溶解度增大鹽析鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)度增加，蛋白質(zhì)溶解溶解度減小度減小42.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0蛋白質(zhì)鹽析 向蛋白質(zhì)溶液中加入一定濃度的無機(jī)鹽(NH4)2SO4或Na2SO4溶液后，可以使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出，這種作用就叫做鹽析。這樣析出的蛋白質(zhì)仍可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質(zhì)的性質(zhì)。因此，鹽析是一個(gè)可逆的過程。利用這個(gè)性質(zhì)，可以采用多次鹽析的方法來分離、提純蛋白

3、質(zhì)。 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周圍的水分子數(shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。 蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。 由于各種蛋白質(zhì)在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的蛋白質(zhì)不同，從而使之從其他蛋白中分離出來。簡單的說就是將硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞

4、，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀。 鹽析法簡單方便，可用于蛋白質(zhì)抗原的粗提、丙種球蛋白的提取、蛋白質(zhì)的濃縮等。鹽析法提純的抗原濃度不高，只用于抗原的初步純化。81.形成形成離子對(duì)離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來。2.中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了去了水化膜水化膜，使其沉淀。，使其沉淀。9loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度，g/Lg/L； 鹽離子強(qiáng)度鹽離子強(qiáng)度, , C Ci ii i離子濃度，離子濃度，

5、mol/Lmol/L；Z Zi ii i離子化合價(jià)；離子化合價(jià)； 常數(shù)常數(shù), ,為縱坐標(biāo)上的截距為縱坐標(biāo)上的截距; ;K Ks s鹽析常數(shù)鹽析常數(shù)。102.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0 、 K KS S 是外推截距是外推截距 KSKS是鹽析常數(shù)是鹽析常數(shù)KsKs鹽析法鹽析法鹽析法鹽析法11（一）、無機(jī)鹽的種類（一）、無機(jī)鹽的種類 鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽離子好，尤其以高價(jià)陰離子高價(jià)陰離子更為明顯。更為明顯。 PO4

6、3-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+ 鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨12血 纖 維蛋 白 原碳 氧 血紅 蛋 白血 清 白蛋 白擬 球 蛋 白碳 氧 肌紅 蛋 白0.500-0.50-1.000 2 4 6 8 10log S1314-d dSP10987654321040 50 60 70 80P30g/L 3g/L 溫度的變化會(huì)影響溫度的變化會(huì)影響 值。值。 在無鹽或稀鹽溶液中，在無鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，隨溫度升高而增大的，但在但在高鹽溶液中常相反高鹽溶液中常相反15210

7、log S2 3 4 250pH6.616卵清蛋白碳氧血紅蛋白765432103 4 5 6 7 8pH(六六) 鹽的飽和度鹽的飽和度 不同蛋白質(zhì)的鹽析要求的鹽的飽和度不一樣； 分段鹽析法。18192021 222324一、基本原理一、基本原理2526（一）有機(jī)溶劑種類及用量（一）有機(jī)溶劑種類及用量 常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。 （二）（二）pHpH的影響的影響 許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)溶解度最低，溶液許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)溶解度最低，溶液pHpH應(yīng)在應(yīng)在等電點(diǎn)附近等電點(diǎn)附近，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。27（三）溫度（三）溫度（低溫

8、沉淀低溫沉淀） 有機(jī)溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解有機(jī)溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。度隨溫度降低而顯著地減小。（四）無機(jī)鹽的含量（四）無機(jī)鹽的含量 低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。防止變性。 高鹽高鹽：增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑：增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑水溶液水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。2829（五）某些金屬離子的助沉淀作用（五）某些金屬離子的助沉淀作用（六）樣品濃度（六）樣品濃度303132蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀 在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等)，此時(shí)

9、蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等電點(diǎn)時(shí)的許多物理性質(zhì)如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利于懸浮液的過濾。34二、成鹽沉淀法二、成鹽沉淀法353637吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析383940酸性酸性多糖多糖414243 結(jié)晶的方法一般有2種：一種是蒸發(fā)溶劑法，它適用于溫度對(duì)溶解度影響不大的物質(zhì)。沿海地區(qū)“曬鹽”就是利用的這種方法。另一種是冷卻熱飽和溶液法。此法適用于溫度升高，溶解度也增加的物質(zhì)。如北方地區(qū)的鹽湖，夏天溫度高，湖面上無晶體出現(xiàn)；每到冬

10、季，氣溫降低，石堿(Na2CO310H2O)、芒硝(Na2SO4 10H2O)等物質(zhì)就從鹽湖里析出來。在實(shí)驗(yàn)室里為獲得較大的完整晶體，常使用緩慢降低溫度，減慢結(jié)晶速率的方法。 晶體在一定條件下所形成的特定晶形，稱為晶習(xí)。向溶液添加或自溶液中除去某種物質(zhì)(稱為晶習(xí)改變劑)可以改變晶習(xí)，使所得晶體具有另一種形狀。這對(duì)工業(yè)結(jié)晶有一定的意義。晶習(xí)改變劑通常是一些表面活性物質(zhì)以及金屬或非金屬離子。指溶質(zhì)自動(dòng)從指溶質(zhì)自動(dòng)從過飽和溶液過飽和溶液中析出形成新相的過程中析出形成新相的過程。 C C2 2 小晶體的溶解度小晶體的溶解度；C C1 1 普通晶體的溶解度；普通晶體的溶解度； 晶體密度；晶體密度；M M

11、 晶體質(zhì)量；晶體質(zhì)量； 晶體與溶液間的界面張力；晶體與溶液間的界面張力； 2 2 小晶體的半徑小晶體的半徑； 1 1 普通晶體的半徑；普通晶體的半徑；46)11(2ln1212rrRTMCC47 晶核生成（成核）和晶體生長兩個(gè)階段，兩個(gè)階段的推動(dòng)力都是溶液的過飽和度（溶液中溶質(zhì)的濃度超過其飽和溶解度之值）。晶核的生成有三種形式：即初級(jí)均相成核、初級(jí)非均相成核及二次成核。在高過飽和度下，溶液自發(fā)地生成晶核的過程，稱為初級(jí)均相成核；溶液在外來物（如大氣中的微塵）的誘導(dǎo)下生成晶核的過程，稱為初級(jí)非均相成核；而在含有溶質(zhì)晶體的溶液中的成核過程，稱為二次成核。二次成核也屬于非均相成核過程，它是在晶體之間或晶體與其他固體（器壁、攪拌器等）碰撞時(shí)所產(chǎn)生的微小晶粒的誘導(dǎo)下發(fā)生的。4950515253545556575859（二）、晶體形狀（二）、晶體形狀 改變晶體外形，可用改變晶體外形，可用: :選擇不同的溶劑、選擇不同的溶劑、控控制過飽和度、制過飽和度、結(jié)晶溫度結(jié)晶溫度、調(diào)節(jié)溶液的、調(diào)節(jié)溶液的pHpH和有和有目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。 （三）、晶體純度（三）、晶體純度 由于由于晶體表面具有一定的物理吸附能力晶體表面具有一定的物理吸附能力，因此表面上有很多母液和雜質(zhì)黏附在晶體上。因此表面上有很