技術(shù)與人類基因組

1、高中生物奧林匹克競(jìng)賽輔導(dǎo)專題講座專題九 DNA技術(shù)與人類基因組【競(jìng)賽要求】1 DNA操作的工具2 質(zhì)粒是基因的載體3 內(nèi)切酶與連接酶4 基因克隆5 反轉(zhuǎn)錄6 DNA探針7 PCR技術(shù)8 人類基因組9 DNA技術(shù)的應(yīng)用10DNA技術(shù)帶來(lái)的危害與倫理問(wèn)題【知識(shí)梳理】一、基因工程概述基因工程：是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)綜合發(fā)展基礎(chǔ)上于本世紀(jì)70年代誕生的一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)。一般來(lái)說(shuō)，基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，它是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)-DNA大分子提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖

2、的受體細(xì)胞中，以讓外源遺傳物質(zhì)在其中"安家落戶"，進(jìn)行正常復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)。 這個(gè)定義表明，基因工程具有以下幾個(gè)重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中進(jìn)行繁殖，能夠跨越天然物種屏障，把來(lái)自任何一種生物的基因放置到新的生物中，而這種生物可以與原來(lái)生物毫無(wú)親緣關(guān)系，這種能力是基因工程的第一個(gè)重要特征。第二個(gè)特征是，一種確定的DNA小片段在新的寄主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，這樣實(shí)現(xiàn)很少量DNA樣品"拷貝"出大量的DNA，而且是大量沒(méi)有污染任何其它DNA序列的、絕對(duì)純凈的DNA分子群體。二、細(xì)胞是DNA操作必不可少的工具（一）質(zhì)粒是基

3、因的載體基因載體或稱克隆載體。這是為“攜帶”感興趣的外源DNA、實(shí)現(xiàn)外源DNA的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。其中，為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的克隆載體又稱表達(dá)載體?？沙洚?dāng)克隆載體的DNA分子有質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和病毒DNA。細(xì)菌質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌擬核中DNA分子的自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，是基因工程最常用的運(yùn)載體。最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒。大腸桿菌的質(zhì)粒中常含有抗藥基因，如抗四環(huán)素的標(biāo)記基因。細(xì)菌質(zhì)粒的大小只有普通細(xì)菌擬核DNA的百分之一左右。質(zhì)粒能夠“友好”地“借居”在宿主細(xì)胞中。一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒(méi)有決定性

4、的作用。但是，質(zhì)粒的復(fù)制則只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒常用于培育轉(zhuǎn)基因植物。（二）工具酶1限制性內(nèi)切酶：識(shí)別特異序列，切割DNA2DNA連接酶：催化DNA中相鄰的5磷酸基與3羥基間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合，連接DNA片段3DNA聚合酶：（1）合成雙鏈cDNA中第二條鏈（2）缺口平移制做探針（3）DNA序列分析（4）填補(bǔ)3末端4Taq酶 : 催化PCR反應(yīng)，聚合DNA5反轉(zhuǎn)錄酶: a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析6多聚核苷酸激酶:催化DNA 5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針7堿性磷酸酶: 切除DNA5末端磷酸基8末端轉(zhuǎn)移酶: 在3羥基末端進(jìn)行同系

5、多聚核苷酸加尾9DNA酶: 切割DNA10RNA酶: 切割RNA在所有工具酶中，限制性核酸內(nèi)切酶具有特別重要的意義。所謂限制性核酸內(nèi)切酶就是識(shí)別 DNA的特異序列，并在識(shí)別點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。根據(jù)酶的組成，所需因子及裂解DNA方式的不同，可將限制性核酸內(nèi)切酶分為三類。重組DNA技術(shù)中常用的限制性核酸內(nèi)切酶為類酶，大部分類酶識(shí)別DNA位點(diǎn)的核苷酸序列呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，通常稱這種特殊的結(jié)構(gòu)順序?yàn)榛匚慕Y(jié)構(gòu)。下面小結(jié)限制性內(nèi)切酶類需 Mg 2+、SAM及ATP識(shí)別位點(diǎn)復(fù)雜，特異性差，切割位點(diǎn)距識(shí)別點(diǎn)遠(yuǎn)。類僅需 Mg 2+識(shí)別切割特異性強(qiáng)，切割發(fā)生在識(shí)別位點(diǎn)。類需 Mg 2+及ATP切割

6、位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)周圍，酶活性不單一。（三）基因克隆1概念：DNA克隆就是應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆又稱重組DNA。2重組 DNA的基本原理一個(gè)完整的DNA克隆過(guò)程應(yīng)包括：目的基因的獲取，基因載體的選擇與構(gòu)建，目的基因與載體的拼接，重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選并無(wú)性繁殖含重組分子的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）。（1）目的基因的獲取目前獲取目的基因大致有如下幾種途徑或來(lái)源。a化學(xué)合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根據(jù)某種基

7、因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出該多肽編碼基因的核苷酸序列，再利用DNA合成儀通過(guò)化學(xué)合成原理合成目的基因。b基因組DNA：采用物理方法(剪切或超聲波)或限制性內(nèi)切酶將染色體DNA切割成許多片段，然后將它們與適當(dāng)克隆載體結(jié)合，將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌中擴(kuò)增，每個(gè)細(xì)菌內(nèi)都攜帶一種重組DNA分子的多個(gè)拷貝。全部細(xì)菌所攜帶的各種染色體DNA片段就涵蓋了基因組全部信息，即基因文庫(kù)。建立基因文庫(kù)后，結(jié)合適當(dāng)篩選方法從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含某一基因的菌株，擴(kuò)增分離得到目的基因。c cDNA：以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，擴(kuò)增為cDN

8、A文庫(kù)。用適當(dāng)方法cDNA文庫(kù)中就可以篩選分離到目的基因。 d聚合酶鏈反應(yīng)：在有模板DNA、引物及dNTP存在時(shí)，向DNA合成體系中引入熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶。反應(yīng)體系經(jīng)變性、退火及擴(kuò)增循環(huán)自動(dòng)。反復(fù)進(jìn)行感興趣DNA片段的酶促合成，使目的基因按指數(shù)增長(zhǎng)。（2）克隆載體的選擇與改建 a.質(zhì)粒：存在于細(xì)菌染色體外，小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，可獨(dú)立自主進(jìn)行復(fù)制，含篩選標(biāo)記，含多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，可插入目的基因。b.噬菌體：eg 噬菌體、MB載體c.柯斯質(zhì)粒與酵母人工染色體載體：用于插入大DNA片段。d.病毒載體。（3）外源基因與載體的連接即DNA的體外重組。這種DNA重組是靠DN

9、A酶將外源DNA與載體共價(jià)連接的。a粘性末端連接.同一限制酶切割位點(diǎn)連接 由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。那么，當(dāng)這樣的兩個(gè)DNA片段一起退火時(shí)，粘性末端單鏈間進(jìn)行堿基配對(duì)，然后在DNA連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組DNA分子。.不同限制酶切割位點(diǎn)連接 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段，具有相同類型的粘性末端，即配對(duì)末端，也可以進(jìn)行粘性不同末端連接。b平端連接c同聚物加尾連接同聚物加連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在DNA片段制造出粘性末端，而后進(jìn)行粘性末端連接。d人工接頭連接（4）重組 DNA導(dǎo)入

10、受體細(xì)胞根據(jù)重組DNA時(shí)所采用的載體性質(zhì)不同，導(dǎo)入重組DNA分子有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染等不同手段。a.感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)一定方法處理(如CaCl 2處理)后具備接受外界DNA能力的大腸桿菌。受體菌應(yīng)為安全無(wú)毒菌株，且為限制酶缺陷型及重組缺陷型。b.轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染及感染。本定義不涉及真核細(xì)胞，只針對(duì)大腸桿菌。轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因的載體 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)染：以噬菌體為載體，用 DNA連接酶使噬菌體DNA環(huán)化，再通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入受體菌。感染：以噬菌體為載體，在體外將噬菌體 DNA包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌。（5）重組體的篩選a直接選擇法直接法是針對(duì)載體攜帶某種或某些標(biāo)志基因和目的基因

11、而設(shè)計(jì)的篩選方法，其特點(diǎn)是直接測(cè)定基因表型。.抗藥性標(biāo)志選擇：如果克隆載體攜帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，則只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌藥物的培養(yǎng)板上幸存并形成菌落。.標(biāo)志補(bǔ)救：若克隆的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，那么就可以利用營(yíng)養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選，這就是標(biāo)志補(bǔ)救篩選。.分子雜交法b免疫學(xué)方法應(yīng)用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選，屬非直接選擇法。特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于選擇不為宿主菌提供任何標(biāo)志的基因。（6）克隆基因的表達(dá)a原核表達(dá)體系大腸桿菌是當(dāng)前采用最多的原核表達(dá)體系，運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)載體符合下述標(biāo)準(zhǔn)：含大腸桿菌適宜的選擇標(biāo)志具有能調(diào)控轉(zhuǎn)錄

12、、產(chǎn)生大量mRNA的強(qiáng)啟動(dòng)子含適當(dāng)?shù)姆g控制序列和翻譯起始點(diǎn)等含有合理設(shè)計(jì)的多接頭克隆位點(diǎn)，以確保目的基因按一定方向與載體正確銜接表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化。大腸桿菌表達(dá)體系中尚有一些不足之處：由于缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)克隆的cDNA，不宜表達(dá)真核基因組DNA；由于缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機(jī)制，表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或進(jìn)行糖基化修飾；表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體，欲使其具有活性尚需進(jìn)行復(fù)雜的復(fù)性處理；很難表達(dá)大量的可溶性蛋白。b真核表達(dá)體系與原核表達(dá)體系比較，真核表達(dá)體系如酵母、昆蟲、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系顯示了較大優(yōu)勢(shì)性。尤其是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞，不僅可表達(dá)真核的cDNA，而且還可

13、表達(dá)真核基因組DNA；將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程稱轉(zhuǎn)染，常用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及顯微注射。三DNA操作技術(shù)的其他工具（一）反轉(zhuǎn)錄1970年Temin等在致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為核板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNA的核苷酸順序(其中V與A配對(duì))合成DNA。這一過(guò)程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過(guò)程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶。后來(lái)發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，哺乳動(dòng)物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主

14、要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3桹H末端上，按53方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA(complementary DNA, cDNA)，它與RNA模板形成RNA桪NA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過(guò)程(如下圖)。 攜帶反轉(zhuǎn)錄酶的病毒又稱為反轉(zhuǎn)錄病毒，它侵入宿主細(xì)胞后先以病毒RNA為模板靠反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，隨后這種DNA環(huán)化并整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中去，以原病毒的形式在宿主細(xì)胞中一代代傳遞下去。以后又發(fā)現(xiàn)許多反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中都含有癌基因，如果由于

15、某種因素激活了癌基因就可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性： DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過(guò)程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3末端以53方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有35外切酶活性，因此沒(méi)有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。 RNase H活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNase H從RNA5端水解掉RNA分子。 DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有

16、些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動(dòng)作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細(xì)胞提取mRNA并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補(bǔ)的DNA(cDNA)，由此可構(gòu)建出cDNA文庫(kù)(cDNA library)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的方法。（二）DNA探針DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度精確性，對(duì)某一特異性DNA序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。DNA探針是利用同位素、生物素等標(biāo)記的特定DNA片斷，該片斷可大至寄生蟲基因組

17、DNA，小至20個(gè)堿基。當(dāng)DNA探針與待測(cè)的非標(biāo)記單鏈DNA（或RNA）按堿基順序互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，以氫健將2條單鏈連接而形成標(biāo)記DNA-DNA（或標(biāo)記DNA-RNA）的雙鏈雜交分子。將未配對(duì)結(jié)合的核苷酸溶解后用檢測(cè)系統(tǒng)（放射自顯影或酶檢測(cè)等）檢測(cè)雜交反應(yīng)結(jié)果。由于DNA分子堿基互補(bǔ)的精確性，單連DNA探針僅與樣品中變性處理的DNA單鏈出現(xiàn)配對(duì)雜交，由此決定了探針的特異性；用放射性同位素（如32P）或生物素標(biāo)記探針，使雜交試驗(yàn)同時(shí)具有高度的敏感性。 相關(guān)內(nèi)容：所謂雜交指兩個(gè)以上的分子因具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體，雜交體中的分子不是來(lái)自一個(gè)二聚體分子。同一個(gè)二聚體中的兩個(gè)分子在

18、變性解離后重組合稱為復(fù)性。利用兩條不同來(lái)源的多核苷酸鏈之間的互補(bǔ)性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術(shù)相對(duì)應(yīng)的另一項(xiàng)技術(shù)被稱為探針技術(shù)，它是指利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)，我們把標(biāo)記的分子叫探針。將探針技術(shù)與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，從而使分子雜交技術(shù)得以廣泛推廣應(yīng)用。目前所用的核酸雜交技術(shù)均應(yīng)用了標(biāo)記技術(shù)。DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲的DNA探針?lè)N類很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的

19、毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向，加之分子雜交技術(shù)的高度敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。 DNA探針（包括cDNA探針）有三大優(yōu)點(diǎn)：第一，這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。其次，DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。（三）PCR技術(shù)

20、類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)

21、程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。四人類基因組計(jì)劃HGP(Human Genome Project)是了解人類自身奧秘的計(jì)劃，1985年，美國(guó)能源部（DOE）率先提出，旨在闡明人類基因組DNA長(zhǎng)達(dá)3×109堿基對(duì)（ base pair，bp）的序列。發(fā)現(xiàn)所有人類基因并闡明其在染色體上的位置，從而在整體上破譯人類遺傳信息。1986年美國(guó)宣布啟動(dòng)"人類基因組啟動(dòng)計(jì)劃"；1989年，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）建立國(guó)家人類基因組研究中心（NCHGR）；1990年

22、，NIH和DOE聯(lián)合提出美國(guó)人類基因組計(jì)劃，正式啟動(dòng)HGP，計(jì)劃于15年內(nèi)提供30億美元的資助。人類基因組計(jì)劃主要內(nèi)容包括繪制人類基因組的4張圖，即遺傳(連鎖)圖、物理圖、DNA序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。(1)遺傳圖  遺傳圖是指基因或DNA標(biāo)記(如多肽性遺傳標(biāo)記)在染色體上以遺傳距離表示相對(duì)位置的圖，又稱為連鎖圖。遺傳距離通常以基因或DNA片段在染色體交換過(guò)程中分離的頻率厘摩(cM)來(lái)表示。cM值越高，表明兩點(diǎn)之間距離越遠(yuǎn)；cM值越低，表明兩點(diǎn)間距離越近。通過(guò)遺傳圖可以大致了解各個(gè)基因或DNA片段之間的相對(duì)距離與方向。遺傳距離是通過(guò)遺傳連鎖分析獲得的，使用的DNA標(biāo)記越多，越密集，所得到的遺

23、傳連鎖圖的分辨率就越高。目前人類基因組遺傳圖的分辨率為6cM。遺傳圖不僅是現(xiàn)階段定位基因的重要手段，即使在人類基因組物理圖建立起來(lái)之后，它依然是研究人類基因組遺傳與變異的重要手段。這方面研究的下一個(gè)目標(biāo)就是建立分辨率更高的遺傳圖。(2)物理圖  物理圖指表示DNA序列上DNA標(biāo)記之間實(shí)際距離的圖。通常由DNA的限制酶片段或克隆的DNA片段有序排列而成。標(biāo)記之間的物理距離以DNA上核苷酸數(shù)目的多少(kb，表示千堿基對(duì)，或Mb， 1 Mb=1 000 kb)來(lái)表示。物理圖是進(jìn)行DNA序列分析和基因組織結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。限制酶物理圖是基因組結(jié)構(gòu)的重要特征，例如，每一個(gè)基因都有其特定的限制酶，

24、每一條染色體，每一個(gè)個(gè)體的基因組，甚至每一個(gè)物種的基因組，都有其特異的限制酶物理圖。物理圖反映了DNA標(biāo)記之間的實(shí)際距離，而遺傳圖則反映DNA標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系。在DNA交換頻繁的區(qū)域，兩個(gè)物理距離位置相距較近的基因或DNA片段，可能具有較大的遺傳距離，而兩個(gè)物理距離位置相距較遠(yuǎn)的基因或DNA片段，則可能因該部位在遺傳過(guò)程中很少發(fā)生交換而具有很近的遺傳距離。(3)序列圖  序列圖是指整個(gè)人類基因組的核苷酸序列圖，也是最詳盡的物理圖。測(cè)定的總長(zhǎng)度約為1 m。由30億個(gè)核苷酸對(duì)組成的序列圖就是人類基因組計(jì)劃原定2005年要完成的任務(wù)。2000年6月，6國(guó)科學(xué)家已向全世界宣布“人類基因組草

25、圖”的繪制工作已經(jīng)完成。(4)轉(zhuǎn)錄圖  在整個(gè)人類基因組中，只有1%5%的DNA序列為編碼序列。在人體某一特定組織的細(xì)胞中，一般只有10%的基因是表達(dá)的。如果能把某段DNA序列相應(yīng)的mRNA確定下來(lái)，就抓住了基因的主要部分，即可轉(zhuǎn)錄部分。所以，一張人類基因組的轉(zhuǎn)錄圖(也稱cDNA圖或表達(dá)序列圖)才是人類基因圖的雛形1999年，作為惟一的發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)正式參與了這個(gè)跨世紀(jì)的國(guó)際合作項(xiàng)目，德、日、英、法國(guó)家的科學(xué)家先后正式加入，共有16個(gè)實(shí)驗(yàn)室和1100名生物科學(xué)家、計(jì)算機(jī)專家和技術(shù)人員參與其中。該計(jì)劃已繪制出覆蓋率達(dá)97的人類基因組“工作框架圖”，并在2001年6月前繪制出更高覆蓋率

26、的“完成序列圖”；2003年4月14日，由我國(guó)總理溫家寶和其他五國(guó)政府首腦簽署的人類基因組聯(lián)合宣言發(fā)表；2005年10月26日，六國(guó)“協(xié)作組”宣布這一計(jì)劃圓滿完成。五DNA技術(shù)的其他應(yīng)用（一）親緣鑒定DNA是從幾滴血, 腮細(xì)胞或培養(yǎng)的組織纖內(nèi)提取而來(lái)。用疇素將DNA樣本切成小段, 放進(jìn)喱膠內(nèi), 用電泳槽推動(dòng)DNA小塊使之分離最細(xì)的在最遠(yuǎn), 最大的最近。之后, 分離開(kāi)的基因放在尼龍薄膜上, 使用特別的DNA探針去尋找基因, 相同的基因會(huì)凝聚于一, 然后,利用特別的染料,在X光的環(huán)境下, 便顯示由DNA探針凝聚于一的黑色條碼。小孩這種肉眼可見(jiàn)的條碼很特別，一半與母親的吻合,一半與父親的吻合。這過(guò)程

27、重覆幾次,每一種探針用于尋找DNA的不同部位并影成獨(dú)特的條碼, 用幾組不同的探針, 可得到超過(guò)99.9%的父系或然率或分辨率。（二）醫(yī)療與制藥基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的貢獻(xiàn)體現(xiàn)在三個(gè)方面：利用“工程菌”生產(chǎn)基因工程藥品；基因診斷；基因治療。1工程菌概念及基因工程獲得胰島素的方式工程菌指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類細(xì)胞株系。如：含有人類胰島素的大腸桿菌菌株，含有抗蟲基因的土壤膿桿菌菌株都是“工程菌”?？茖W(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)能夠控制產(chǎn)生胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)成功。從而取代了過(guò)去主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取胰島素的歷史，滿足了社會(huì)中

28、糖尿病對(duì)胰島素的需求。2干擾素概念及產(chǎn)生機(jī)理干擾素是病毒侵入細(xì)胞后產(chǎn)生的一種糖蛋白。由于干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，因此，它是一種抗病毒的特效藥。傳統(tǒng)的干擾素生產(chǎn)方法是從人的血液中白細(xì)胞內(nèi)提取的，每300wL能提取出1mg干擾素?？茖W(xué)家用基因工程的方法在大腸桿菌及酵母菌細(xì)胞內(nèi)獲得了干擾素，從每1kg細(xì)菌培養(yǎng)物中可以得到2040mg干擾素。3白細(xì)胞介素及其產(chǎn)生機(jī)理白細(xì)胞介素-2是淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種淋巴因子，能促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化和增殖。用基因工程方法生產(chǎn)的白細(xì)胞介素-2在臨床上主要用于治療腫瘤和感染性疾病。20世紀(jì)90年代后期，我國(guó)上海生化研究所的研究人員完成了白細(xì)胞介素-2在大腸桿菌中的高

29、效表達(dá)。4基因診斷概念及應(yīng)用基因診斷是用放射性同位素（如32P）、熒光分子等標(biāo)記的DNA分子做探針，利用DNA分子雜交原理，鑒定被檢測(cè)標(biāo)本上的遺傳信息，達(dá)到檢測(cè)疾病的目的。 DNA探針的制備方法之一：根據(jù)翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列查出相應(yīng)的核苷酸序列（約30個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的90個(gè)左右的核苷酸序列），再?gòu)闹羞x出兩個(gè)片段，用化學(xué)方法合成這兩個(gè)片段并作同位素標(biāo)記，即成探針。方法之二：用所需的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后成為DNA，標(biāo)記后作為探針。用這一探針探查基因文庫(kù)中經(jīng)加熱或提高pH值而使之已經(jīng)變性的DNA片段，如果有一個(gè)片段能和探針片段互補(bǔ)結(jié)合而成雙鏈（分子雜交），這一片段即含有所需要的基因?；蛟\斷是一種快

30、速簡(jiǎn)便的方法。例如：用珠蛋白的DNA探針可以檢測(cè)出鐮刀型細(xì)胞貧血癥；用苯丙氨酸羥化酶基因探針可以檢測(cè)出苯丙酮尿癥。此外，基因診斷技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用也取得了重要成果。 5基因治療及其原理基因治療是把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，達(dá)到治療疾病的目的。其原理是把健康的基因?qū)牒谢蛉毕莸募?xì)胞中，在有基因缺陷的病人的細(xì)胞中既含有缺陷基因，又含有通過(guò)基因工程導(dǎo)入的健康基因。因此，在病人體內(nèi)兩種基因都能夠表達(dá)，健康基因的表達(dá)產(chǎn)物掩蓋了缺陷基因的表達(dá)產(chǎn)物，從而治愈了有基因缺陷的疾病。例如，有一種人類遺傳病叫做半乳糖血糖，患這種病的人，由于細(xì)胞內(nèi)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶，因此當(dāng)

31、乳糖分解成半乳糖后，不能繼續(xù)轉(zhuǎn)化成為葡萄糖，過(guò)多的半乳糖在體內(nèi)積聚，會(huì)引起肝、腦等功能受損。1971年，美國(guó)的一位科學(xué)家在體外做了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，他用帶有半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的噬菌體侵染患者的離體組織細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些組織細(xì)胞能夠利用半乳糖了。（三）基因工程與農(nóng)業(yè)基因工程在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要是培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)或具有特殊用途的動(dòng)植物新品種?；蚬こ淘谵r(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面。首先，是通過(guò)基因工程技術(shù)獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具有優(yōu)良品質(zhì)的農(nóng)作物。例如，用基因工程的方法可以改善糧食作物的蛋白質(zhì)含量。其次，是用基因工程的方法加快農(nóng)作物新品種的培育?？茖W(xué)家們?cè)诶没蚬こ碳夹g(shù)改良農(nóng)作物方面已取得重大進(jìn)展，一場(chǎng)

32、新的綠色革命近在眼前。這場(chǎng)新的綠色革命的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥行業(yè)降融合到一起?；蚣夹g(shù)的突破使科學(xué)家們得以用傳統(tǒng)育種專家難以想象的方式改良農(nóng)作物。例如，基因技術(shù)可以使農(nóng)作物自己釋放殺蟲劑，可以使農(nóng)作物種植在旱地或鹽堿地上，或者生產(chǎn)出營(yíng)養(yǎng)更豐富的食品?？茖W(xué)家們還在開(kāi)發(fā)可以生產(chǎn)出能夠防病的疫苗和食品的農(nóng)作物?；蚣夹g(shù)也使開(kāi)發(fā)農(nóng)作物新品種的時(shí)間大為縮短。利用傳統(tǒng)的育種方法，需要七、八年時(shí)間才能培養(yǎng)出一個(gè)新的植物品種，基因工程技術(shù)使研究人員可以將任何一種基因注入到一種植物中，從而培育出一種全新的農(nóng)作物品種，時(shí)間則縮短一半。基因工程在畜牧養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用也具有廣闊的前景，科學(xué)家將某些

33、特定基因與病毒DNA構(gòu)成重組DNA，然后通過(guò)感染或顯微注射技術(shù)，將重組DNA轉(zhuǎn)移到動(dòng)物受精卵中。由這種受精卵發(fā)育稱的動(dòng)物可以獲得人們所需要的各種優(yōu)良品質(zhì)，如具有抗病能力、高產(chǎn)仔率、高產(chǎn)奶率和高質(zhì)量的皮毛等。（四）基因工程與環(huán)境保護(hù)基因工程的方法可以用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，和被污染環(huán)境的凈化。利用基因工程可獲得同時(shí)能分解多種有毒物質(zhì)的新型菌種。例如，1975年，有人把降解芳烴、萜烴和多環(huán)芳烴的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到能降解烴的一種假單胞桿菌內(nèi)，結(jié)果獲得了能同時(shí)降解四種烴類的“超級(jí)菌”，它能把原油中約三分之二的烴分解掉。這種新型“工程菌”在環(huán)境保護(hù)方面有很大的潛力。據(jù)報(bào)道，利用自然菌種分解海上浮油要花費(fèi)一年以上的時(shí)間，而

34、這中“超級(jí)菌”卻只要幾個(gè)小時(shí)就夠了。六危害與倫理1轉(zhuǎn)基因食品的安全性 1994年美國(guó)Caigene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，成為第一例通過(guò)安全評(píng)價(jià)的轉(zhuǎn)基因植物食品。迄今為止，全世界已有40多個(gè)可能作為食品來(lái)源的轉(zhuǎn)基因植物獲得批準(zhǔn)上市。主要包括延熟番茄，抗除草劑的玉米、棉花、大豆和油菜，抗蟲的馬鈴薯、棉花和玉米，抗病毒的西葫蘆、南瓜和番木瓜，雄性不育的玉米和萵苣，以及改變油脂特性的油菜和大豆等。 轉(zhuǎn)基因植物由于采用遺傳工程操作的特殊手段，可能存在無(wú)法預(yù)測(cè)的其它性狀的改變，從而帶來(lái)某些轉(zhuǎn)基因植物食品的安全性問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類的危害主要有3大類：（1）可能含有已知或未知的毒素，對(duì)人體

35、產(chǎn)生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的過(guò)敏源，引起人體的過(guò)敏反應(yīng)。（3）這種食品某些營(yíng)養(yǎng)成分或營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量可能產(chǎn)生變化，使人體出現(xiàn)某種病癥。1993年經(jīng)濟(jì)發(fā)展合作組織（OECD）提出了食品安全性分析的實(shí)質(zhì)等同性（Substantial equivalence）原則，即生物技術(shù)產(chǎn)生的食品及食品成分是否與目前市場(chǎng)上銷售的食品具有實(shí)質(zhì)等同性。轉(zhuǎn)基因食品的安全評(píng)估主要包括：有無(wú)毒性、有無(wú)過(guò)敏性以及抗生素抗性等標(biāo)記基因的安全性。食品安全性試驗(yàn)最主要的問(wèn)題是提出相關(guān)的科學(xué)問(wèn)題并加以回答，假設(shè)安全性分析包括所有可能的變數(shù)，則會(huì)太復(fù)雜到難以處置；相反，若僅觀察少數(shù)變數(shù)，則某些重要因素可能會(huì)被忽略。由于人們對(duì)轉(zhuǎn)基

36、因食品的潛在危險(xiǎn)性和安全性缺乏足夠的預(yù)見(jiàn)能力，因此，根據(jù)國(guó)情建立一系列的轉(zhuǎn)基因食品安全管理程序和措施是十分必要的。2DNA技術(shù)引發(fā)倫理問(wèn)題對(duì)人類的基因干預(yù)有可能引發(fā)現(xiàn)存人類道德不能包容的倫理難題，也是引致廣泛爭(zhēng)論的話題。因?yàn)閷?duì)人類生命的干預(yù)，以前從未在這種廣度和深度進(jìn)行，社會(huì)倫理缺乏充分的接納準(zhǔn)備。而克隆技術(shù)的最新發(fā)展，使人們更有理由擔(dān)心基因研究被應(yīng)用于非人道的目的。如果復(fù)制技術(shù)被某些不受管制的“瘋子”濫用，世界也將因人類科技進(jìn)步而陷入噩夢(mèng)般的境地。    美國(guó)廣播公司1997年就復(fù)制技術(shù)進(jìn)行的一項(xiàng)民意調(diào)查顯示，82%的美國(guó)人反對(duì)用復(fù)制技術(shù)培育人類；93%的美國(guó)人

37、說(shuō)，他們本人不愿意被人應(yīng)用復(fù)制技術(shù)造出另一個(gè)與他一模一樣的人。民意調(diào)查還表明，50%的美國(guó)人不贊成搞復(fù)制技術(shù)研究。    1995年諾貝爾和平獎(jiǎng)獲得者，英國(guó)核物理學(xué)家羅特布拉特反“復(fù)制羊”的問(wèn)世同原子彈的出現(xiàn)相提并論。他最近不無(wú)憂慮地說(shuō)，遺傳工程像原子彈一樣“具有令人恐怖的可能性”。他強(qiáng)烈呼吁建立一個(gè)國(guó)際倫理委員會(huì)，負(fù)責(zé)阻止可能危及人類的科學(xué)研究項(xiàng)目。美國(guó)生物技術(shù)工業(yè)組織也對(duì)復(fù)制技術(shù)諱莫如深，該組織曾經(jīng)發(fā)表公報(bào)，告誡其所屬的700家企業(yè)和研究中心不得從事無(wú)性生殖的研究活動(dòng)?！皬?fù)制羊”的消息公布后，美國(guó)政府迅速做出反應(yīng)。2月24日當(dāng)天，美國(guó)總統(tǒng)克林頓即發(fā)表談話，要求

38、美國(guó)國(guó)家生物倫理學(xué)咨詢委員會(huì)研究復(fù)制技術(shù)在法律和倫理方面可能造成的影響，并在3個(gè)月之內(nèi)向他匯報(bào)?？肆诸D甚至主張對(duì)美國(guó)現(xiàn)有的關(guān)于人類胚胎研究的立法進(jìn)行調(diào)整。   【典型例題】例1作為基因的運(yùn)輸工具運(yùn)載體，必須具備的條件之一及理由是A能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來(lái)并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因B具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C具有某些標(biāo)記基因，以便目的基因的表達(dá)提供條件D在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進(jìn)行篩選析：本題考查的是運(yùn)載體必須具備的條件及理由，條件與理由必須相符。作為運(yùn)載體要攜帶目的基因進(jìn)入手提細(xì)胞并使之表達(dá)，必須能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地保存并

39、大量復(fù)制，以便通過(guò)復(fù)制提供大量目的基因。同時(shí)要具有某些標(biāo)記基因，是為了通過(guò)標(biāo)記基因是否表達(dá)判斷目的基因是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，從而進(jìn)行篩選手提細(xì)胞。運(yùn)載體要具有多個(gè)限制切點(diǎn)，則是為了便于與外源基因連接。綜上所述，正確答案為A。答案：A。例2下列有關(guān)基因工程技術(shù)的敘述，正確的是A重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶和載體B所有的限制酶都只能識(shí)別同一種特定的核苷酸序列C選用細(xì)菌作為重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞是因?yàn)榧?xì)菌繁殖快D只要目的基因進(jìn)入了受體細(xì)胞就能成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)析：此題考查了基因的操作工具、目的基因的表達(dá)等知識(shí)。解答題目明確以下幾方面的知識(shí)：基因操作的工具酶是現(xiàn)之美、DNA連接酶；一種限制酶只能識(shí)別

40、特定的核苷酸序列；載體是基因的運(yùn)載體工具；目的基因進(jìn)入體細(xì)胞后，受體細(xì)胞表現(xiàn)出特定的性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)過(guò)程；導(dǎo)入受體細(xì)胞中目的基因主要為了表達(dá)、生產(chǎn)目的基因的產(chǎn)物，因此能夠快速繁殖是選擇受體細(xì)胞的重要條件之一。答案：C。例3下列高科技成果中，根據(jù)基因重組原理進(jìn)行的是我國(guó)科學(xué)家袁隆平利用雜交技術(shù)培育出超級(jí)水稻 我國(guó)科學(xué)家將蘇云金芽孢桿菌的某些基因移植到棉花體內(nèi)，培育出抗蟲棉 我國(guó)科學(xué)家通過(guò)返回式衛(wèi)星搭載種子培育出太空椒 我國(guó)科學(xué)家通過(guò)體細(xì)胞克隆技術(shù)培養(yǎng)出太空牛A B C D析：本題考查幾種高薪技術(shù)所依據(jù)的遺傳學(xué)原理。袁隆平培育新型水稻利用的是雜交技術(shù)，他本人也被稱為“雜交水稻之父”

41、。而雜交技術(shù)的原理就是基因的自由組合定律；基因工程是認(rèn)為地將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使之表達(dá)，所以抗蟲棉的培育原理也應(yīng)是基因重組；太空育種的原理是基因突變；克隆技術(shù)則是無(wú)性繁殖。答案：B。例4：科學(xué)家應(yīng)用基因工程培育出了一種抗蟲棉，它能產(chǎn)生毒素殺死害蟲，目前正在大面積推廣種植?？茖W(xué)家還研究了害蟲的遺傳基因，發(fā)現(xiàn)不抗毒素對(duì)抗毒素為顯性（此處分別用B和b表示）。據(jù)此回答:（1）種植抗蟲棉，有利于生態(tài)環(huán)境保護(hù)，這是因?yàn)?。?）棉田不抗毒素害蟲的基因型為；抗毒素害蟲的基因型為。（3）不抗毒素害蟲與抗毒素害蟲雜交則子代的基因型為。析：本題主要考查以下幾個(gè)問(wèn)題：“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”具有抗害蟲的能力，這表明棉花體

42、內(nèi)產(chǎn)生了抗蟲的毒蛋白物質(zhì)。這個(gè)事實(shí)說(shuō)明，害蟲和植物共用一套遺傳密碼，蛋白質(zhì)合成的方式是相同的?！稗D(zhuǎn)基因抗蟲棉”康害蟲的遺傳信息傳遞過(guò)程可表示為DNA（基因）RNA蛋白質(zhì)?？茖W(xué)家語(yǔ)言，此種“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”獨(dú)立種植若干代以后，也將出現(xiàn)不抗蟲的植株，此現(xiàn)象來(lái)源于基因突變。 答案：（1）可以減少或不再使用農(nóng)藥殺蟲，從而避免農(nóng)藥對(duì)環(huán)境造成污染（2）BB或bb （3）Bb或bb例5：蠶的絲腺細(xì)胞能產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)叫絲蛋白。這些細(xì)胞不產(chǎn)生血液中的蛋白質(zhì)，因此推測(cè)絲腺細(xì)胞A只有絲蛋白基因 B有血蛋白和絲蛋白基因C有絲蛋白基因和其他基因，但沒(méi)有血液蛋白基因D比合子的基因少析 生物體每個(gè)正常體細(xì)胞中都含

43、有本物種整套的基因。對(duì)一個(gè)不斷分裂的胚性細(xì)胞而言，這些基因能按一定的發(fā)育順序被逐漸打開(kāi)；而對(duì)一個(gè)高度分化的細(xì)胞（如絲腺細(xì)胞）而言，細(xì)胞內(nèi)絕大部分基因被關(guān)閉了，一般只有少部分與該細(xì)胞功能有關(guān)的基因才具有表達(dá)功能。因此，絲腺細(xì)胞中絲蛋白和血液蛋白基因都存在，但絲蛋白基因可以表達(dá)而血液蛋白基因被關(guān)閉了，不能表達(dá)。答案：B?！局悄苡?xùn)練】1根據(jù)基因工程的定義，下列名詞中不能替代基因工程的是A基因誘變 B分子克隆 CDNA重組 D傳工程 E基因無(wú)性繁殖2基因工程操作的三大基本元件是A供體、受體、載體 B供體、受體、抗體C供體、受體、配體 D供體、抗體、載體3型限制性內(nèi)切核酸酶是指A有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列B僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供C限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列D有外切核酸酶和甲基化的核苷酸序列4限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識(shí)別A雙鏈DNA的特定堿基對(duì) B雙鏈DNA的特定堿基序列C特定的三聯(lián)密碼 D以上都正確5經(jīng)抗藥性遺傳標(biāo)記法篩選出的轉(zhuǎn)化體中，往往會(huì)出現(xiàn)無(wú)載體或無(wú)重組DNA分子的菌落，其原因很可能是A標(biāo)記基因發(fā)生突變 B載體或重組DNA分子整合到了受體染色體C載體空載 D載體或重組D