人體正中神經(jīng)內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的三維重建與可視化研究(一).

1、人體正中神經(jīng)內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的三維重建與可視化研究（一）作者：孫廓,胡平,張峰，張鍵，李華【摘要】目的探索應(yīng)用計(jì)算機(jī)處理人體正中神經(jīng)全長(zhǎng)連續(xù)冰凍組織切片的 二維圖像信息，開發(fā) 3DNerve 神經(jīng)三維可視化系統(tǒng)，重建人體正中神經(jīng)內(nèi)部顯 微結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)三維可視化。方法取新鮮人尸正中神經(jīng)標(biāo)本1 例，以人長(zhǎng)發(fā)為定位線、OCT 包埋劑包埋、采用連續(xù)冰凍組織切片、乙酰膽堿脂酶組織化學(xué) 法染色、高分辨率掃描儀獲取二維數(shù)碼信息后、應(yīng)用3DNerve 對(duì)正中神經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維重建。結(jié)果正中神經(jīng)在不同斷面神經(jīng)束的數(shù)目、位置以及神 經(jīng)束內(nèi)神經(jīng)纖維的性質(zhì)變化較大。連續(xù)斷面觀察顯示各神經(jīng)束均是混合束，未 見有純粹的感覺束

2、或運(yùn)動(dòng)束的出現(xiàn)。通過3D Nerve 可在任意斷面放大的視野下觀察正中神經(jīng)的顯微結(jié)構(gòu)，追蹤各神經(jīng)束在正中神經(jīng)內(nèi)的立體行徑。從而動(dòng)態(tài) 地展示正中神經(jīng)內(nèi)部神經(jīng)束的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。結(jié)論重建的正中神經(jīng)三維可視化 真實(shí)地再現(xiàn)正中神經(jīng)干全長(zhǎng)及其內(nèi)部各神經(jīng)束和束組的三維立體結(jié)構(gòu)，可為臨 床修復(fù)正中神經(jīng)損傷提供精確的斷層解剖圖像?！娟P(guān)鍵詞】 正中神經(jīng)； 三維重建； 三維可視化； 乙酰膽堿脂酶Abstract : ObjectiveTo explore the application of computer indealJng巧two dimensi on(iiniDge informcition of hurnt.

3、n median nerveseriesfreez ing tissue secti ons, in order to develop n ervethroe diincnsional visualization sysieni (31) Nerve)、ciiv.1 Iinally torecon struct 3D internal microstructure of huma n media n n erve and realize 3Dvisualization. MethodOne fresh cadaver median nerve wastake n, I ocated with

4、huma n hair and embedded in OCT. Series freez ing tissue sections were made and stai ned with ACHE histochemistry method, and 2D imageinformation was obtained through high resolution scanner. Microstructure of media nn erve was fin ally recon structed with 3D Nerve. ResultDifferent cross sectionsof

5、median nerve had quite differe nt nu mber and positi ons of fasciculi. In additi on,characters of fasciculus s internal n erve fiber were also quite differe nt.Scross sections observati on showed that all fasciculi were mixed fasciculi. With the 3D Nerve,the microstructure of media n n erve was able

6、 to be observed in magnifying visualfield at any cross secti on, and the track ing of stereo course of fasciculi in media nnerve became possible. ConclusionReconstructed 3D visualizationcan reveal the whole microstructure of media n n erve and the threedimensionalstereo slrucl-ure oT Pasciculi andas

7、cicuius groups exactly and truly. It can provideexact topographic atlas and facilitate precise clixical repair of median nerve injury.Key words :IH-JHi;ri m；;d io kiln?/l J.jri;three cli mensi on?jl visiiiii za-TJ or : acetyl ch o inesrerase盡管顯微外科技術(shù)不斷進(jìn)步，正中神經(jīng)損傷后修復(fù)的結(jié)果仍然難以預(yù)料和滿意。其中重要原因是不能分辨運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)束支1。由于

8、神經(jīng)纖維不是始 終沿著某一神經(jīng)束行走，而是在束間互相穿插移行，呈叢狀反復(fù)交叉，使神經(jīng) 束的大小、數(shù)目和位置不斷發(fā)生變化。因此迫切需要一個(gè)精確真實(shí)的正中神經(jīng) 內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)的三維立體圖譜。目前正中神經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)的三維重建研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道均極少。1945 年 Sunderland2通過大體解剖學(xué)和組織學(xué)方法描述了神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜的束型變化，并繪 制了神經(jīng)斷面的二維分布圖。據(jù) Sunderland 的研究，甚至相距 0.8 mm,神經(jīng) 的局部排列已有差異。1980 年 Jabaley3描繪出正中神經(jīng)遠(yuǎn)端的一幅三維概 念圖，發(fā)現(xiàn)在正中神經(jīng)的遠(yuǎn)端，束型在較長(zhǎng)段內(nèi)保持穩(wěn)定。1984 年 Terzis4在實(shí)體解剖

9、和組織學(xué)切片的基礎(chǔ)上建立了正中神經(jīng)的三維模型。1991 年Greg P.Watchmaker 5等對(duì)前臂遠(yuǎn)段及手部的正中神經(jīng)進(jìn)行連續(xù)組織切片邢 染色后，應(yīng)用開發(fā)的軟件進(jìn)行圖像識(shí)別和統(tǒng)計(jì)處理并通過三維構(gòu)建的方法進(jìn)行 了神經(jīng)束交錯(cuò)變化特征的研究。但是這些以結(jié)構(gòu)研究為目的的三維構(gòu)建仍然缺 乏臨床的實(shí)用性。2006 年 Meek MF6等采用磁共振 DTI 技術(shù)來重建在體正中 神經(jīng)，但其只能顯示正中神經(jīng)主干的走形，無法更進(jìn)一步顯示正中神經(jīng)內(nèi)部結(jié) 構(gòu)的顯微圖像。本研究基于正中神經(jīng)連續(xù)冰凍組織切片的二維圖像信息，制備成正中神經(jīng)從其 起始處到腕部連續(xù)的染色前、后神經(jīng)斷面的二維圖像信息數(shù)據(jù)庫(kù)，并根據(jù)該數(shù) 據(jù)庫(kù)

10、實(shí)現(xiàn)了一個(gè)具備神經(jīng)三維可視化全套功能的3D Nerve 神經(jīng)三維可視化軟件系統(tǒng)，逼真地重現(xiàn)了包括正中神經(jīng)結(jié)構(gòu)信息的三維立體圖譜，為臨床上正中神 經(jīng)損傷修復(fù)方式的選擇提供有益幫助，同時(shí)對(duì)組織工程化的人工神經(jīng)的仿生構(gòu) 建也具有參考意義。1 材料與方法1.1 標(biāo)本準(zhǔn)備獲取自愿捐獻(xiàn)尸體的成人新鮮左側(cè)正中神經(jīng)標(biāo)本 1 例（從內(nèi)、外側(cè)根組成正中神 經(jīng)處至橈骨莖突，長(zhǎng)約 47 cm）。將其固定在自行設(shè)計(jì)的支架上，用 4 根人長(zhǎng)發(fā) （直徑約 80 卩 m）等距離平行地固定在標(biāo)本四周作為定位線，然后用 OCT 包埋劑 將標(biāo)本與定位線一起包埋，液氮速凍。1.2 連續(xù)組織切片將正中神經(jīng)作連續(xù)冰凍組織切片（LEICA

11、 CM1850 型冰凍切片機(jī)），切片厚度 20 卩m 切片間距為 100 卩 m 共切取 4650 張切片。1.3 染色前的切片掃描 為了防止因切片在染色后的定位點(diǎn)丟失或移位而導(dǎo)致重建的困難，染色前先以2 400 dpi 的分辨率對(duì)原始圖像進(jìn)行掃描（Epson 4990 型掃描儀），以便染色 前、后圖像上的定位點(diǎn)的對(duì)比配準(zhǔn)，以保證定位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。1.4 切片染色將切片用乙酰膽堿脂酶（acetylcholinesterase, AChe）組織化學(xué)法進(jìn)行染色，24 h 即可。1.5 圖像獲取將染色后的切片以 2 400 dpi 的分辨率進(jìn)行掃描，同時(shí)將所得 JPEG 格式的圖像 輸入計(jì)算機(jī)。采用

12、Photoshop CS 29.0 將染色前、后的圖像進(jìn)行定位點(diǎn)的比 對(duì)，以保證定位點(diǎn)的原始可靠性。然后對(duì)圖像進(jìn)行邊緣銳化、圖像增強(qiáng)，去除 噪聲等二維處理，使圖像在進(jìn)行輪廓分割時(shí)更易于識(shí)別。1.6 三維重建于可視化將所得系列染色后的二維圖像按順序逐幅輸入計(jì)算機(jī)后，采用作者研發(fā)的用于 三維神經(jīng)可視化的 3D Nerve 軟件系統(tǒng)進(jìn)行三維重建，獲得正中神經(jīng)干全長(zhǎng)及內(nèi) 部各神經(jīng)束的三維立體行徑圖譜。2 結(jié)果2.1 正中神經(jīng)連續(xù)斷面觀察正中神經(jīng)在不同斷面的神經(jīng)束的數(shù)目以及位置變化均較大，各神經(jīng)束均是混合束，未見有純粹的感覺束或運(yùn)動(dòng)束的出現(xiàn)。2.1.1 起始部及上臂部 正中神經(jīng)在內(nèi)、外側(cè)根組成處呈橢圓形

13、，神經(jīng)束數(shù)量為17 個(gè)，其中以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的混合束為6 個(gè)，其余 11 個(gè)是以感覺神經(jīng)纖維為主的混合束（圖 1）。連續(xù)斷面觀察顯示神經(jīng)束數(shù)量逐漸減少，在大圓肌下 緣有神經(jīng)束 8 個(gè)，均為混合神經(jīng)束。在肱骨中段部位神經(jīng)束數(shù)量減少到6 個(gè)，繼續(xù)向下走行神經(jīng)束數(shù)量又逐漸增加。2.1.2 肘部正中神經(jīng)在肘關(guān)節(jié)部呈扁帶狀，與正中神經(jīng)下行穿過旋前圓肌兩頭 之間，受到肌肉的擠壓有關(guān)。由于該處有骨間前神經(jīng)及前臂淺組屈肌等分支加 入，所以神經(jīng)束數(shù)量有所增加。在肱骨內(nèi)、外髁連線處神經(jīng)束數(shù)量為14 個(gè)，其中以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的混合神經(jīng)束為 9 個(gè)，其余 5 個(gè)是以感覺神經(jīng)纖維為主 的混合神經(jīng)束（圖 2）。2.1

14、.3 前臂部及腕部正中神經(jīng)在前臂接近圓形，神經(jīng)束組成數(shù)量不等的神經(jīng)功能束組。連續(xù)的神經(jīng) 斷面觀察顯示正中神經(jīng)在前臂神經(jīng)束與束之間的神經(jīng)纖維交錯(cuò)較少，并且運(yùn)動(dòng) 神經(jīng)纖維有所增加。正中神經(jīng)在腕部呈扁平狀，在橈骨莖突部位神經(jīng)束的數(shù)量為 21 個(gè)，橈側(cè)有 1 個(gè)以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的混合束，其余 20 個(gè)均為混合束（圖 3） ，為神經(jīng)束數(shù)量最多的部位。與正中神經(jīng)在腕部發(fā)出大量終末支分布于拇收 肌以外的魚際肌、第 I、2 蚓狀肌以及掌心、魚際、橈側(cè) 3 個(gè)半指的掌面及其中 節(jié)和遠(yuǎn)節(jié)手指背面的皮膚相符合。2.2 三維顯示在正中神經(jīng)三維可視化過程中，利用 3D Nerve 采用不同的顏色來標(biāo)識(shí)區(qū)分不同 的神經(jīng)

15、束，束的粗細(xì)按內(nèi)部各神經(jīng)束的實(shí)際粗細(xì)進(jìn)行適當(dāng)縮小，這樣可以看清 正中神經(jīng)內(nèi)部的各神經(jīng)束三維行徑（圖 4）。為了更清晰地觀測(cè)正中神經(jīng)內(nèi)部各 神經(jīng)束的三維立體行徑，將正中神經(jīng)全長(zhǎng)等距離地分成九段進(jìn)行三維顯示（圖5）。正中神經(jīng)可視化結(jié)果能夠真實(shí)地再現(xiàn)正中神經(jīng)干全長(zhǎng)及其內(nèi)部各神經(jīng)束和束組 的三維立體結(jié)構(gòu)；形象地展示各神經(jīng)束的交叉穿插、混合重組的變化規(guī)律；既 能單獨(dú)顯示正中神經(jīng)干或單個(gè)神經(jīng)束的立體行徑，又能將二者疊加混合顯示， 還能隱藏其它的結(jié)構(gòu)，追蹤單個(gè)神經(jīng)束或整個(gè)正中神經(jīng)干，從而動(dòng)態(tài)地展示正 中神經(jīng)內(nèi)部神經(jīng)束的復(fù)雜結(jié)構(gòu)（圖 6）。通過 3D Nerve，重建的正中神經(jīng)能在空 間位置上繞任意軸旋轉(zhuǎn)任意

16、角度，或者以不同的速度連續(xù)旋轉(zhuǎn)，便于從不同的 角度對(duì)各神經(jīng)束的形態(tài)、空間位置及相互毗鄰關(guān)系進(jìn)行觀察；還可在任意斷面 進(jìn)行任意角度的切割，并可在放大的視野下觀察正中神經(jīng)的顯微結(jié)構(gòu)（圖 17）。圖 1 正中神經(jīng)內(nèi)、外側(cè)根匯合部神經(jīng)斷面示意圖共有神經(jīng)束 17 個(gè)，其中6 個(gè)神經(jīng)束是以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的混合束，其余11 個(gè)神經(jīng)束是以感覺神經(jīng)纖維為主的混合束 圖 2 正中神經(jīng)在肘部肱骨內(nèi)、外髁連線處神經(jīng)斷面示意圖共有神經(jīng)束 14 個(gè)，其中 9 個(gè)神經(jīng)束是以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的混合束，其余5 個(gè)神經(jīng)束是以感覺神經(jīng)纖維為主的混合束圖 3 正中神經(jīng)在橈骨莖突部神經(jīng)斷面示意圖 共有神經(jīng)束 21 個(gè)，橈側(cè)有 1 個(gè)

17、以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的混合束，余 20 個(gè)均 為混合束。圖 13 中 A 為該神經(jīng)斷面的掃描圖片進(jìn)行輪廓分割的示意圖（分辨率為 2400 dpi）,B 為在 3D Nerve 中該神經(jīng)斷面的輪廓匹配示意圖。淡藍(lán)色代表 以感覺神經(jīng)纖維為主的混合束；綠色代表以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的混合束；紫藍(lán)色 代表混合神經(jīng)束圖 4 正中神經(jīng)起始部位，長(zhǎng) 5 cm。A 為神經(jīng)束中心線示意 圖，每一中心線代表一神經(jīng)束的走行行徑；B 為神經(jīng)束表面重建示意圖。正中神經(jīng)內(nèi)部神經(jīng)束結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，它們相互間不斷交叉重組，形成獨(dú)特的神經(jīng)束 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。采用不同的顏色來標(biāo)識(shí)區(qū)分不同的神經(jīng)束，束的粗細(xì)按內(nèi)部各神經(jīng) 束的實(shí)際粗細(xì)進(jìn)行適當(dāng)縮小

18、，這樣可以看清正中神經(jīng)內(nèi)部的各神經(jīng)束三維行 徑。C 為包括神經(jīng)外膜的表面重建示意圖。箭頭所指方向?yàn)榻酥吝h(yuǎn)端的走行 方向 圖 5AI 分別等距離顯示正中神經(jīng)內(nèi)部神經(jīng)束的三維立體行徑（自正中神 經(jīng)內(nèi)外側(cè)根匯合處至橈骨莖突）箭頭所指方向?yàn)榻酥吝h(yuǎn)端的走行方向。采用不 同的顏色來標(biāo)識(shí)區(qū)分不同的神經(jīng)束圖 6 AC 示在 3D Nerve 中進(jìn)行從近端至遠(yuǎn)端的正中神經(jīng)追蹤的連續(xù)截圖 箭頭所指方向?yàn)榻酥吝h(yuǎn)端的走行方向圖 7A、B 圖示從不同角度觀察圖 6 中 E 段正中神經(jīng)的示意圖便于從不同的角度對(duì) 各神經(jīng)束的形態(tài)、空間位置及相互毗鄰關(guān)系進(jìn)行觀察。C 圖示對(duì) E 段正中神經(jīng)行任意斷面切割的示意圖，可以觀

19、測(cè)該斷面正中神經(jīng)內(nèi)各神經(jīng)束的數(shù)量及分布 位置。箭頭所指方向?yàn)榻酥吝h(yuǎn)端的走行方向3 討論 3.1 正中神經(jīng)三維重建與可視化的意義周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)與重建是當(dāng)前周圍神經(jīng)外科領(lǐng)域的一大難題。目前臨床上 應(yīng)用骨骼縮短、神經(jīng)改道、自體神經(jīng)移植或移位等方法來進(jìn)行神經(jīng)缺損的修 復(fù)。神經(jīng)移植雖然效果尚可，但是神經(jīng)來源有限，且遺留有供區(qū)感覺減退，移 植神經(jīng)直徑往往與受體神經(jīng)不符等問題7。而組織工程化人工神經(jīng)則有著明 顯的優(yōu)點(diǎn)：(1)不受來源限制，可被制成任意長(zhǎng)度和口徑；(2)采用套接法將神經(jīng) 遠(yuǎn)近端放置于神經(jīng)管內(nèi)，手術(shù)簡(jiǎn)單，能有效避免吻合端神經(jīng)瘤產(chǎn)生，并防止新 生神經(jīng)纖維向外生長(zhǎng)，保護(hù)再生神經(jīng)纖維有效地向遠(yuǎn)端

20、延伸8。因此，近年來人們開始用組織工程方法體外構(gòu)建人工神經(jīng)，即將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的大量的雪 旺細(xì)胞和生物材料復(fù)合來引導(dǎo)周圍神經(jīng)再生9, 10。但是人工神經(jīng)研制的重 要前提條件是首先要明確神經(jīng)的內(nèi)部神經(jīng)束的復(fù)雜交叉重組關(guān)系。只有按照人 體神經(jīng)內(nèi)部天然精確結(jié)構(gòu)來構(gòu)建人工神經(jīng)，才能獲得最佳的效果。本研究利用 計(jì)算機(jī)真實(shí)地實(shí)現(xiàn)了正中神經(jīng)的三維可視化，能準(zhǔn)確地顯示正中神經(jīng)內(nèi)部每一 神經(jīng)束的各個(gè)斷面及其全長(zhǎng)的解剖結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系，各神經(jīng)束中任意斷面的 感覺與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維的準(zhǔn)確定位資料，因此對(duì)于組織工程化人工神經(jīng)的仿生構(gòu) 建有著重要的指導(dǎo)意義。同時(shí)為臨床上正中神經(jīng)損傷的修復(fù)方式的選擇提供一 定的解剖參考意義。并

21、且提供了一種周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)三維可視化的 有效方法，為中國(guó)虛擬人周圍神經(jīng)系統(tǒng)的構(gòu)建作了有益的探索。3.2 定位方法三維重建要準(zhǔn)確顯示重建結(jié)構(gòu)的空間形態(tài)，必須使連續(xù)切片的圖像有和原物體 一樣的對(duì)應(yīng)空間立體關(guān)系，即對(duì)圖像進(jìn)行定位。若定位不準(zhǔn)確，重建的圖像就會(huì)失真。組織的連續(xù)冰凍切片在切片、染片的過程中不可避免地會(huì)產(chǎn)生一定的 偏差，其位置的客觀性和準(zhǔn)確性均受到一定的限制，所以需要通過設(shè)置參照的 方法來保證切片的對(duì)位始終準(zhǔn)確11。定位方法一般可分為外定位和內(nèi)定位 2 種，這 2 種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。所謂外定位方法，是指采用各種機(jī)械的方法在 連續(xù)切片圖像上標(biāo)記一些基準(zhǔn)點(diǎn)，通過基準(zhǔn)點(diǎn)的對(duì)齊來達(dá)到定位

22、效果。陳增淦12等采用人長(zhǎng)發(fā)作為外定位的材料，取得較好效果。而所謂內(nèi)定位方法， 是指根據(jù)生物組織的連續(xù)性和完整性，通過一定的配準(zhǔn)算法達(dá)到兩幅連續(xù)切片 圖像間的對(duì)齊。它具有靈活、準(zhǔn)確度高和可進(jìn)行回溯性研究等優(yōu)點(diǎn)，所以是較 有發(fā)展前途的一類定位方法。但是內(nèi)定位并不足以解決一些非線性變形如切片 的卷曲等情況，而且由于存在需要針對(duì)重建對(duì)象專門設(shè)計(jì)軟件、人機(jī)交互工作 量及計(jì)算量均較大等問題，還有待改進(jìn)， 目前還無法完全替代外定位的方法。因此采用內(nèi)定位和外定位相結(jié)合的方法，定位精度將更為理想，這是今后的發(fā) 展方向13。本研究將標(biāo)本固定在自行設(shè)計(jì)的支架上，采用 4 根人長(zhǎng)發(fā)作為定位線，分別等 距離固定在神經(jīng)四周，頭發(fā)切割后在切片上留下的點(diǎn)作為標(biāo)志點(diǎn)。頭發(fā)直徑 小，而且與玻片的粘附性較好，同時(shí)在玻片上用涂層，增加了組織的粘附能力，這樣就保證了定位的準(zhǔn)確性。作者認(rèn)為這是計(jì)算機(jī)三維重 建研究中一種準(zhǔn)確而