蛋白質(zhì)的分離純化與表征

1、第七章 蛋白質(zhì)的分離、純化與表征一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀六、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則五、蛋白質(zhì)的分離純化方法一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)是一類(lèi)兩性電解質(zhì)，能與酸或堿發(fā)生作用。在蛋白質(zhì)分子中，可解離基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)，及少數(shù)N端-NH2和C端-COOH。 天然球狀蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)大部分可被滴定，而某些天然蛋白質(zhì)中有一部分可解離基團(tuán)由于埋藏在分子內(nèi)部或參與氫鍵形成而不能解離。 等電點(diǎn)：在某一pH，它所帶的正電荷與負(fù)電荷相等。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的比例有關(guān)。 等離子點(diǎn)：沒(méi)有其它鹽類(lèi)

2、干擾時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體解離出的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH值稱(chēng)等離子點(diǎn)，是每種蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。 二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子量如Mb含鐵量為0.335%，其最低相對(duì)分子質(zhì)量為：Mb最低相對(duì)分子質(zhì)量鐵的原子量鐵的百分含量10055.8/0.335 10016700Hb最低相對(duì)分子質(zhì)量167004牛血清白蛋白含Trp0.58%最低Mr=35200，實(shí)際為69000，含2個(gè)Trp楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（二）滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子量用半透膜將蛋白質(zhì)溶液與純水隔開(kāi)，當(dāng)滲透達(dá)平衡時(shí)，測(cè)定其滲透壓，計(jì)算分子量：MrRTlimcc0C：濃度（g/m3）

3、R：氣體常數(shù)（8.314J/(Kmol)T：絕對(duì)溫度（K）：以大氣壓表示的滲透壓(N/m2)（三）蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散：由于濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移。擴(kuò)散的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力是熵的增加。擴(kuò)散系數(shù)D：等于當(dāng)濃度梯度為一個(gè)單位時(shí)，在一秒鐘內(nèi)通過(guò)1cm2面積所擴(kuò)散的溶質(zhì)量。擴(kuò)散系數(shù)隨Mr的增加而降低，但對(duì)Mr的變化不敏感。對(duì)球形的大分子來(lái)說(shuō)，擴(kuò)散系數(shù)與Mr的立方根成反比。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（四）沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子量楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)1.沉降速率法楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)2.沉降平衡法楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（五）凝膠過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)

4、相對(duì)分子量（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子量三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀 （一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)爾現(xiàn)象，不能通過(guò)半透膜）。透析：將含小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入透析袋中，置水溶液中，小分子雜質(zhì)不斷從袋中出來(lái)，大分子蛋白質(zhì)仍留在袋中。 蛋白質(zhì)在水中溶解度依賴(lài)于多肽鏈氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的相對(duì)極性，離子化基團(tuán)數(shù)量越多，溶解度越大。穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開(kāi)，不會(huì)互相碰撞凝聚而沉淀。兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時(shí)，帶同種電荷，互相排斥不致聚集而沉淀。一旦電荷被中和或水

5、化膜被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（二）蛋白質(zhì)的沉淀鹽析法 向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。 有機(jī)溶劑沉淀法 破壞水化膜，降低介電常數(shù)。重金屬鹽沉淀 pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與重金屬離子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）結(jié)成不溶性沉淀生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法 pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類(lèi)的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類(lèi)試劑，單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸 類(lèi)：三氯乙酸、磺基水楊酸。加熱變性沉淀 往往是不

6、可逆的。 四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則純化的實(shí)質(zhì)：增加制品(preparation)的純度或比活性。蛋白與非蛋白分開(kāi)，蛋白質(zhì)之間分開(kāi) 一般程序：前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)、濃縮與保存楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó) 電泳 前處理粗分離細(xì)分離生物組織 無(wú)細(xì)胞提取液破碎、溶 解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾疏水層析吸附層析1、前處理：將組織和細(xì)胞破碎動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)（waring blender) 勻漿器（homogenizer) 超聲波處理（ultrasonication)植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨 纖維素酶處理細(xì)菌： 超聲波震蕩、與砂研磨、

7、高壓擠壓、溶菌 酶處理（分解肽聚糖）差速離心法收集細(xì)胞的某一組分（differential centrifugation)： 在不同離心力下沉降的細(xì)胞組分如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)2、粗分級(jí)（rough fractionation)一般用選擇性沉淀法。（NH4）2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析）等電點(diǎn)選擇性沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法熱處理選擇性沉淀法生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3、細(xì)分級(jí)（fine fractionation)透析除鹽sephdex G-25凝膠過(guò)濾除鹽層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析

8、（反相HPLC）電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤(pán)狀電泳、等電聚焦、雙向電泳密度梯度離心4、濃縮與保存濃縮方法：保存方法：晶體保存：結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度 的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。凍干粉保存：溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20-70保存。五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾透析：半透膜阻留蛋白質(zhì)分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過(guò)，以除去蛋白質(zhì)溶液

9、中小分子（鹽、低分子酸等）。超濾：施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關(guān)。離心后按其沉降的速度不同，彼此分開(kāi)形成區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)定位，針刺或冰凍切片采樣分析。2.密度梯度（區(qū)帶）離心蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)3.凝膠過(guò)濾交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Gel P ）；瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-Gel A）楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（二

10、）利用溶解度差別的純化方法1.等電點(diǎn)沉淀和pH控制在等電點(diǎn)條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度最小，粘度最大。在pI時(shí)，分子電荷為零，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥消失，從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析鹽溶：低鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度增加。鹽析：高鹽濃度時(shí)，使蛋白質(zhì)溶解度降低析出。鹽析多用溶解度大的中性鹽，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的飽和溶液。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。在室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀，而且

11、伴隨者變性。在一定溫度、pH和離子強(qiáng)度條件下，引進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此控制有機(jī)溶劑濃度也可以分離蛋白質(zhì)。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變介質(zhì)的介電常數(shù)；另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇（PEG）也能引起蛋白質(zhì)沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脫去蛋白質(zhì)的水化層。聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水基團(tuán)發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二酵中的溶解度明顯地依賴(lài)于聚乙二醇的分子量。4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響在一定的溫度范圍內(nèi)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定

12、，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在0或更低的溫度下進(jìn)行。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（三）根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)電泳(electrophoresis)或離子泳(ionphoresis)。電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要于段，而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的一種物理化學(xué)方法。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細(xì)管電泳從電泳結(jié)果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤(pán)狀電泳從裝置上分： 圓盤(pán)電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。從支持物

13、分： 自由界面電泳、紙電泳（或薄膜電泳）、凝膠電 泳（PAGE ，瓊脂糖膠，淀粉膠等）楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)2.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）3.毛細(xì)管電泳楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)4.等電聚焦電泳等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)pI5.SDS-PAGE6.離子交換層析離子交換纖維素：離子交換交聯(lián)葡聚糖：兼有分子篩效應(yīng)離子交換交聯(lián)瓊脂糖：楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（四）利用選擇性吸附的純化方法極性：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離子吸引和氫鍵）非極性：活性炭（范德華力、疏水作用）最廣泛最有效：羥基磷灰石（hydroxyapatite)，即結(jié)晶磷酸鈣Ca10（PO4）6（OH）

14、2，可分離蛋白質(zhì)、核酸，與DNA的親和力最高層析介質(zhì)：苯基瓊脂糖（phenyl-sephadex) 辛基瓊脂糖(octa-sephadex) 洗脫： 低鹽高pH 非離子型去污劑（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇）（五）利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體，生物素與親和素（抗親和素蛋白），凝集素。免疫親和層析凝集素親和層析金屬螯和層析染料配體層析楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)六、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定（一）蛋白質(zhì)含量測(cè)定總蛋白含量分析：凱氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、雙縮脲法、

15、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法。特定蛋白組分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗體反應(yīng)(western blot)楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)（二）純度鑒定（均一性）基本手段：電泳分析：?jiǎn)螚l帶。 N端測(cè)定：1種N端氨基酸。 選用手段：沉降分析、溶解度分析、結(jié)晶分析（能結(jié)晶的一般比較純，具有活性）其它鑒定工作：1.分子量的測(cè)定；2.等電點(diǎn)測(cè)定；3.N-末端AA測(cè)定；4.C-末端AA的測(cè)定（肼解法）；5.分子中糖鏈：血球凝集反應(yīng)；糖蛋白電泳（甲苯胺蘭、R山蘭、schiff試劑）；糖組分分析（

16、層析、液相色譜）6.含脂成分：蘇丹黑預(yù)染、電泳。7.光吸收：全波長(zhǎng)掃描。找出它的吸收峰位置和最大吸收值。 8.AA組分分析。（四）沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子量楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則純化的實(shí)質(zhì)：增加制品(preparation)的純度或比活性。蛋白與非蛋白分開(kāi)，蛋白質(zhì)之間分開(kāi) 一般程序：前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)、濃縮與保存楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)2、粗分級(jí)（rough fractionation)一般用選擇性沉淀法。（NH4）2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析）等電點(diǎn)選擇性沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法熱處理選擇性沉淀法生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3、細(xì)分級(jí)（fine fractionation)透析除鹽sephdex G-25凝膠過(guò)濾除鹽層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤(pán)狀電泳、等電聚焦、雙向電泳密度梯度離心4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響在一定的溫度范圍內(nèi)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在0或更低的溫度下進(jìn)行。楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系 范樹(shù)國(guó)5.SDS-PAGE（五）利用對(duì)配體的