蛋白質(zhì)理化性能與純化

1、第六節(jié)第六節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein一、理化性質(zhì)一、理化性質(zhì) （一）蛋白質(zhì)的兩性電離性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pHpH條條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 * 蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI)

2、當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的荷為零，此時溶液的pH稱為稱為蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)的等電點。（二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1 1萬至萬至100100萬萬或更大，由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形或更大，由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。其分子的直徑可達成膠體溶液。其分子的直徑可達1 1100nm100nm，為膠粒范，為膠粒范圍之內(nèi)。圍之內(nèi)。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典

3、型性質(zhì)，如丁達爾現(xiàn)象、蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。 * * 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素: :顆粒表面電荷、水化膜顆粒表面電荷、水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫

4、水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉（三）很多因素可引起蛋白質(zhì)的變性* 蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation)：在某些物理和化在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序?qū)W因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導致其理化性的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失；質(zhì)改變和生物活性的喪失；*變性后的蛋白質(zhì)稱為變性后的蛋白質(zhì)稱為變性蛋白變性蛋白； 造成變性的因素造成變性的因素溫度（熱、溫度（熱、冷冷）加熱；）加熱；強酸、強堿；強酸、強堿；尿素和鹽酸胍的影響（破壞分子內(nèi)部氫鍵、破壞尿

5、素和鹽酸胍的影響（破壞分子內(nèi)部氫鍵、破壞疏水效應(yīng)）；疏水效應(yīng)）；表面活性劑的影響：如十二烷基硫酸鈉（表面活性劑的影響：如十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）等）等 變性的本質(zhì)變性的本質(zhì) 破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。臨床醫(yī)學上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及臨床醫(yī)學上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。滅菌。食品方面；蛋白質(zhì)制備；酶制劑保存等；食品方面；蛋白質(zhì)制備；酶制劑保存等；此外此外, , 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。制劑（如疫苗等）的必要條件。 應(yīng)用舉例復性復性(renatura

6、tion) v若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構(gòu)象和蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構(gòu)象和功能，稱為功能，稱為復性復性；v類型：不可逆變性、可逆變性（可復性）。類型：不可逆變性、可逆變性（可復性）。 尿素、尿素、 -巰基乙醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性非折疊狀態(tài)，非折疊狀態(tài)，無活性無活性（四）蛋白質(zhì)的沉淀作用（四）蛋白質(zhì)的沉淀作用蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)沉淀 在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而蛋

7、白質(zhì)從溶液中析出；融會相互纏繞繼而聚集，因而蛋白質(zhì)從溶液中析出；變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性；性；蛋白質(zhì)的凝固作用蛋白質(zhì)的凝固作用 蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中；堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中；蛋白質(zhì)的沉淀分為可逆沉淀和不可逆沉淀蛋白質(zhì)的沉淀分為可逆沉淀和不可逆沉淀。 1、可逆沉淀、可逆沉淀在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱脑跍睾蜅l件下，通過改變?nèi)芤旱膒HpH或電荷狀況，或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離沉淀分離

8、。在沉淀過程中，在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為以這種沉淀又稱為非變性沉淀非變性沉淀。 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。鹽析鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉）使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象（酸鈉、氯化鈉）使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象（水與離子的水與離子的相互作用增加了蛋白質(zhì)表面的

9、疏水補丁的相互作用；同相互作用增加了蛋白質(zhì)表面的疏水補丁的相互作用；同時瓦解了以電荷為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分子之間的作用時瓦解了以電荷為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分子之間的作用）。）。鹽溶：鹽溶：低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，此現(xiàn)象低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，此現(xiàn)象叫鹽溶。叫鹽溶。等電點沉淀法（脫去水化層、降低介電常數(shù)）脫去水化層、降低介電常數(shù)）。在低溫下或縮短處理時。在低溫下或縮短處理時間可防止或減緩變性。間可防止或減緩變性。有機溶劑沉淀法 2、不可逆沉淀、不可逆沉淀在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)溶液的穩(wěn)定性，而

10、且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。（五）蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在這三種氨基酸的在280nm 280nm 附近有附近有最大吸收最

11、大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 280nm 附近顯示強的附近顯示強的吸收；吸收；蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的ODOD280280與其與其濃度濃度呈正比關(guān)系，可以呈正比關(guān)系，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒定和定量測定。對蛋白質(zhì)進行定性鑒定和定量測定。（六）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)可用于溶液蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生茚三酮反應(yīng)蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction) 。 肽鏈中的肽鍵可與雙縮脲試劑反應(yīng)肽鏈中的肽鍵可與雙縮脲試劑反應(yīng)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅蛋白質(zhì)和多

12、肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。質(zhì)水解程度。二、蛋白質(zhì)的分離和純化二、蛋白質(zhì)的分離和純化 純化的目標純化的目標 盡量提高蛋白質(zhì)的盡量提高蛋白質(zhì)的純度純度或或比活性比活性，設(shè)法除，設(shè)法除去變性的和不需要的蛋白質(zhì)，盡可能提高蛋去變性的和不需要的蛋白質(zhì)，盡可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。白質(zhì)的產(chǎn)量。（一）蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 1 1）從組織細胞中溶解放出蛋白質(zhì)）從組織細胞中溶解放出蛋白質(zhì)，并保持天，并保持天然狀態(tài)，常用低溫冰凍

13、、化學試劑及溶菌然狀態(tài)，常用低溫冰凍、化學試劑及溶菌 酶破酶破壁、破膜，再用溶劑提取。壁、破膜，再用溶劑提取。 2 2）分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)）分離所需要蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì) a a 等電點沉淀等電點沉淀 b b 鹽析和有機溶劑分級分離鹽析和有機溶劑分級分離 1、天然蛋白質(zhì)的分離4 4）結(jié)晶提純）結(jié)晶提純 a a 多次結(jié)晶，除雜蛋白和變性蛋白；多次結(jié)晶，除雜蛋白和變性蛋白； b b 結(jié)晶的最佳條件：略過飽和溶液；結(jié)晶的最佳條件：略過飽和溶液； 各步驟要求條件溫和，并加少量殺菌劑。各步驟要求條件溫和，并加少量殺菌劑。 防止蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)酶作用及微生物污染。防止蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)酶作用及微

14、生物污染。 3 3）純化：）純化：a a 離子交換層析離子交換層析 b b 凝膠過濾層析凝膠過濾層析 c c 親和層親和層 析析 d d 電泳方法電泳方法 e e 疏水相互作用色譜疏水相互作用色譜（二）透析及超濾法* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。開的方法。* * 超濾法超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。透析的示意圖（三）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用使用丙酮沉淀丙

15、酮沉淀時，必須在時，必須在04低溫下進行，低溫下進行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *鹽析鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質(zhì)電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質(zhì)沉淀。沉淀。 將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識

16、別相應(yīng)的白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質(zhì)，抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白?？蓮牡鞍踪|(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 免疫沉淀法（免疫沉淀法（immunoprecipitation) )（四）利用荷電性質(zhì)可將蛋白質(zhì)采用電泳法進行分離蛋白質(zhì)在高于或低于其蛋白質(zhì)在高于或低于其pIpI的溶液中為帶電的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù)質(zhì)的技術(shù), , 稱為稱為電泳電泳(elctr

17、ophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。膠電泳等。 *SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE),常用于蛋白質(zhì)分子量的常用于蛋白質(zhì)分子量的測定測定;*等電聚焦電泳等電聚焦電泳(isoelectric equilibrium electrophoresis,IEE)，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法蛋白質(zhì)的電泳方法;*雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(two-dimentional gel elec

18、trophoresis,2-DGE)是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術(shù)。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳電泳上樣和電泳圖走電泳 蛋白質(zhì)在等電蛋白質(zhì)在等電點點pHpH條件下，條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)不發(fā)生電泳現(xiàn)象。象。 利用蛋白質(zhì)的利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進以將蛋白質(zhì)進行分離純化。行分離純化。MSDS-15% PAGE大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的電泳（五）應(yīng)用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進行層析分離層析或色譜層析或色譜(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)

19、溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的相而達到分離蛋白質(zhì)的目的 。離子交換色譜離子交換色譜（凝膠過濾凝膠過濾( (gel filtration) )又稱分子篩層析又稱分子篩層析( (molecular sieve filtration) )或體積排阻色譜（或體積排阻色譜（ steric exclusion chromatography）；）；疏水相互作用色譜疏水相互作用色譜（

20、，HIC ）；）；親和色譜親和色譜（蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離 凝膠過濾或體積排阻凝膠過濾或體積排阻色譜（色譜（ SEC）或分子）或分子篩層析篩層析( (molecular sieve filtration) 是利是利用各蛋白質(zhì)分子大小用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離；不同分離；HIC HIC 是是基于用適度疏水性的固定相，以含鹽的基于用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動相分離；水溶液作為流動相分離；AFC是基于固定相的配基與生物大分子之間的特殊的生是基于固定相的配基與生物大分子之間的特殊的生物親和能力的不同來進行生物

21、大分子相互間的分離。物親和能力的不同來進行生物大分子相互間的分離。l常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。（六）利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進行超速離心分離* * 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)既可以既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。白質(zhì)的分子量。 *蛋白質(zhì)在離心場中的行為用蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示

22、，沉降表示，沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān) 。離心機和離心沉降法分離蛋白質(zhì)分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進行分析把肽鏈水解成片段，分別進行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基

23、酸順序的結(jié)果。基酸順序的結(jié)果。（七）用化學或反向遺傳學方法可分析多肽鏈中氨基酸序列通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因分離編碼蛋白質(zhì)的基因測定測定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列氨基酸和肽末端測定法離子交換色譜分析蛋白質(zhì)的氨基酸組分（八）應(yīng)用物理學、生物信息學原理可進行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定或預測1. 1.二級結(jié)構(gòu)測定二級結(jié)構(gòu)測定 通常采用圓二色譜（通常采用圓二色譜（circular dichroism,CD) )測定測定溶液狀態(tài)溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。a- a-螺旋

24、螺旋的的CDCD峰有峰有222nm222nm處的負峰、處的負峰、208nm208nm處的負峰和處的負峰和198nm198nm處的正峰三個成分；而處的正峰三個成分；而b-b-折疊的折疊的CDCD譜不譜不很固定。很固定。2. 三維空間結(jié)構(gòu)測定 X X射線衍射法射線衍射法（X-ray diffraction)； 核磁共振技術(shù)（核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance,NMR) ) 這兩種方法是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準確這兩種方法是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準確的方法。的方法。3. 根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預測其三維空間結(jié)構(gòu) 用用分子力學分子力學、分子動力學分子動力學的方法，根

25、據(jù)物理化的方法，根據(jù)物理化學的基本原理，從理論上計算蛋白質(zhì)的空間結(jié)學的基本原理，從理論上計算蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)；構(gòu)； 通過對已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進行分析，找出通過對已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進行分析，找出一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，總結(jié)出規(guī)律，用一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，總結(jié)出規(guī)律，用于于新的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預測新的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預測。三、蛋白質(zhì)的分析測定三、蛋白質(zhì)的分析測定 1 1 凱氏定氮法：凱氏定氮法： a 19a 19世紀丹麥化學家凱道爾所創(chuàng)造的方法，世紀丹麥化學家凱道爾所創(chuàng)造的方法，之后之后 又出現(xiàn)了一系列的改良凱氏法又出現(xiàn)了一系列的改良凱氏法; ; b b 將樣品蛋白質(zhì)的將樣品蛋白質(zhì)的N N經(jīng)

26、消化全部轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮經(jīng)消化全部轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮，測定，測定N N的含量，得到蛋白質(zhì)的含量。的含量，得到蛋白質(zhì)的含量。 2 2 雙縮脲法雙縮脲法 在強堿性溶液中，蛋白質(zhì)與在強堿性溶液中，蛋白質(zhì)與CuSOCuSO4 4反應(yīng)，生成反應(yīng)，生成紫紅色化合物是，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正紫紅色化合物是，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量和比，而與蛋白質(zhì)分子量和AAAA組成無關(guān)。組成無關(guān)。( (一）含量的測定3 3 福林福林酚試劑法酚試劑法 a a 福林福林酚試劑包括兩組試劑：堿性銅試劑和酚試劑包括兩組試劑：堿性銅試劑和磷鉬酸和磷鎢酸的混合試劑磷鉬酸和磷鎢酸的混合試劑; ; b b 堿性銅試劑與

27、蛋白質(zhì)產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)堿性銅試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng); ; c c 反應(yīng)后的蛋白質(zhì)的酚基在堿性條件將磷鉬酸反應(yīng)后的蛋白質(zhì)的酚基在堿性條件將磷鉬酸和磷鎢酸還原為藍色的鉬藍和鎢藍，藍色的深淺和磷鎢酸還原為藍色的鉬藍和鎢藍，藍色的深淺與蛋白含量質(zhì)成正比。與蛋白含量質(zhì)成正比。4 4 紫外線吸收法紫外線吸收法 蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)中的TyrTyr、TryTry在在280nm280nm左右具最大吸左右具最大吸收，且在各種蛋白質(zhì)中收，且在各種蛋白質(zhì)中TyrTyr、TryTry含量差別不大，含量差別不大，280nm280nm吸收值與濃度具正相關(guān)。吸收值與濃度具正相關(guān)。 1 1、 常用聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法常用聚

28、丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法; ; 2 2、 高純度：電泳得到均一的一條區(qū)高純度：電泳得到均一的一條區(qū)帶帶; ; 低純度：電泳得到幾條區(qū)帶低純度：電泳得到幾條區(qū)帶; ;（二）蛋白質(zhì)純度的鑒定 1 1、 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量 a a 電泳中加入電泳中加入SDSSDS（十二烷基硫酸鈉，其帶的負（十二烷基硫酸鈉，其帶的負電電 荷量大大超過蛋白質(zhì)分子電荷量），蛋白質(zhì)分子荷量大大超過蛋白質(zhì)分子電荷量），蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。荷和分子形狀無關(guān)。 b b 在

29、實際測定中用己知相對分子質(zhì)量的單體蛋白在實際測定中用己知相對分子質(zhì)量的單體蛋白質(zhì)作標準，用質(zhì)作標準，用MrMr和實際遷移率作圖，從圖上求知和實際遷移率作圖，從圖上求知MrMr。（三）蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定 2 2 凝膠過濾法測相對分子質(zhì)量凝膠過濾法測相對分子質(zhì)量 a a 依據(jù)蛋白質(zhì)大小分離蛋白質(zhì)依據(jù)蛋白質(zhì)大小分離蛋白質(zhì) b b不同不同MrMr洗脫體積洗脫體積VeVe不同，在一定條件下：不同，在一定條件下： lgMr=KlgMr=K1 1KK2 2VeVe c c 用己知和蛋白質(zhì)作標準，求出用己知和蛋白質(zhì)作標準，求出K K1 1、K K2 2 d d 由待測樣在同一凝膠柱上的由待測樣在同一凝膠

30、柱上的VeVe，求出其，求出其MrMr e e 要求樣品與標準蛋白質(zhì)具有相同分子形狀。要求樣品與標準蛋白質(zhì)具有相同分子形狀。鹽析鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉）使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象（酸鈉、氯化鈉）使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象（水與離子的水與離子的相互作用增加了蛋白質(zhì)表面的疏水補丁的相互作用；同相互作用增加了蛋白質(zhì)表面的疏水補丁的相互作用；同時瓦解了以電荷為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分子之間的作用時瓦解了以電荷為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分子之間的作用）。）。鹽溶：鹽溶：低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，此現(xiàn)象低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，此現(xiàn)象叫鹽溶。叫鹽溶。等電點沉淀法（脫去水化層、降低介電常數(shù)）脫去水化層、降低介電常數(shù)）。在低溫下或縮短處理時。在低溫下或縮短處理時間可防止或減緩變性。間可防止