病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理概述

1、課程背景課程背景l(fā)1980s,1980s, 轉(zhuǎn)基因技術(shù)隨分子克隆技術(shù)出現(xiàn)l2003年，我國(guó)SFDA批準(zhǔn)了全球第一種基因治療藥物“今又生”上市。（State Food and Drug Administration）l2005年，我國(guó)SFDA批準(zhǔn)了全球第二種基因治療藥物HB101上市。（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局）l2009年12月18日出版的Science雜志將”return of gene therapy”作為年度重大的科學(xué)突破之一。l2012年12月歐盟批準(zhǔn)地全球第三種基因治療藥物上市。l迄今，多達(dá)1900種基因治療臨床試驗(yàn)方案并正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)正成為分子醫(yī)學(xué)的一種革命性的技術(shù)手段

2、，并已成為治療許多遺傳性和獲得性疾病的潛在希望所在。問題問題l社會(huì)公眾對(duì)健康需求的增加l生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的推動(dòng)l對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全和倫理關(guān)注持續(xù)增加。課程內(nèi)容課程內(nèi)容l分為理論課與實(shí)踐課l轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述l病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理、純化制備技術(shù)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用l生物安全l醫(yī)學(xué)倫理問題l表達(dá)外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定DNA病毒RNA病毒雜合病毒第一章第一章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述 范雄林范雄林86-27-華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系研究生高水平課程病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理主要內(nèi)容主要內(nèi)容l基因轉(zhuǎn)移方式基因轉(zhuǎn)移方式l真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù)真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技

3、術(shù)l外源基因表達(dá)讀框的構(gòu)建原理外源基因表達(dá)讀框的構(gòu)建原理 1. 定定 義義l基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）: 自然發(fā)生自然發(fā)生l轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgene technology):(transgene technology): 人工利用人工利用2. 常見的基因轉(zhuǎn)移方式常見的基因轉(zhuǎn)移方式l轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation)(transformation)l轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction )(transduction )l轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)(transfection)現(xiàn)象現(xiàn)象定義定義分類分類用途用途l轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 （transformatio

4、n transformation ）u現(xiàn)象: 肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)u定義:u分類和應(yīng)用:自然轉(zhuǎn)化自然轉(zhuǎn)化: :感受態(tài)感受態(tài), ,宿主菌種類宿主菌種類 人工轉(zhuǎn)化人工轉(zhuǎn)化: : 低溫低溫CaCl2CaCl2、電穿孔、電穿孔小鼠的肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)小鼠的肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)l轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction )(transduction )u現(xiàn)象:“U”“U”型管實(shí)驗(yàn)型管實(shí)驗(yàn) u定義:u分類和應(yīng)用:普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)l轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)(transfection)u現(xiàn)象: 感染感染(infection)(infe

5、ction)、病毒感染、病毒感染u定義: 廣義和狹義廣義和狹義u分類和應(yīng)用:物理化學(xué)方法物理化學(xué)方法 生物學(xué)方法生物學(xué)方法( (病毒載體病毒載體) ) 野生型病毒的自然感染、病毒載體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒經(jīng)化學(xué)法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染野生型病毒的自然感染、病毒載體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒經(jīng)化學(xué)法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染3. 基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的方法基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的方法l基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素 l外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法和方法 l構(gòu)建外源基因的基本要素構(gòu)建外源基因的基本要素 轉(zhuǎn)移入原核細(xì)胞的影響因素:u限制限制- -修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng)u質(zhì)粒宿主范圍和相容性質(zhì)粒宿主范圍和相容

6、性u(píng)同源重組與非同源重組同源重組與非同源重組l基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素 真核與原核細(xì)胞具有顯著區(qū)別;外源基因要進(jìn)入真核細(xì)胞，要突破三大障礙; 理想的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法質(zhì)粒型載體:l物理方法l化學(xué)方法l外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法l傳統(tǒng)的針頭注射l顯微注射l粒子轟擊l電穿孔l流體動(dòng)力學(xué)l包裹微球l超聲l磷酸鈣法l脂質(zhì)體法lDEAE-Dxtran法常用的物理方法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移常用的物理方法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移l外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法病毒顆粒型載體(病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)) u假型病毒載體（復(fù)制缺陷性病毒載體）：具有感染性u(píng)重組型病毒載體：具有感染性lDNA病毒載體：AdV, AAV,HSV-1,etc.lRNA病毒載體: HIV, etc.l雜合型病毒載體 不同類型轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較不同類型轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較l構(gòu)建外源基因的基本要素構(gòu)建外源基因的基本要素 u轉(zhuǎn)錄控制元件u翻譯