病毒轉基因技術原理概述

1、課程背景課程背景l(fā)1980s,1980s, 轉基因技術隨分子克隆技術出現(xiàn)l2003年，我國SFDA批準了全球第一種基因治療藥物“今又生”上市。（State Food and Drug Administration）l2005年，我國SFDA批準了全球第二種基因治療藥物HB101上市。（國家食品藥品監(jiān)督管理局）l2009年12月18日出版的Science雜志將”return of gene therapy”作為年度重大的科學突破之一。l2012年12月歐盟批準地全球第三種基因治療藥物上市。l迄今，多達1900種基因治療臨床試驗方案并正在進行臨床試驗。轉基因技術正成為分子醫(yī)學的一種革命性的技術手段

2、，并已成為治療許多遺傳性和獲得性疾病的潛在希望所在。問題問題l社會公眾對健康需求的增加l生命科學和醫(yī)學研究的推動l對轉基因技術的安全和倫理關注持續(xù)增加。課程內容課程內容l分為理論課與實踐課l轉基因技術概述l病毒轉基因技術原理、純化制備技術和醫(yī)學應用l生物安全l醫(yī)學倫理問題l表達外源基因的復制缺陷型重組腺病毒的構建和鑒定DNA病毒RNA病毒雜合病毒第一章第一章 轉基因技術概述轉基因技術概述 范雄林范雄林86-27-華中科技大學同濟醫(yī)學院病原生物學系華中科技大學同濟醫(yī)學院病原生物學系研究生高水平課程病毒轉基因技術原理主要內容主要內容l基因轉移方式基因轉移方式l真核細胞的轉基因技術真核細胞的轉基因技

3、術l外源基因表達讀框的構建原理外源基因表達讀框的構建原理 1. 定定 義義l基因轉移基因轉移（gene transfer）: 自然發(fā)生自然發(fā)生l轉基因技術轉基因技術(transgene technology):(transgene technology): 人工利用人工利用2. 常見的基因轉移方式常見的基因轉移方式l轉化轉化(transformation)(transformation)l轉導轉導(transduction )(transduction )l轉染轉染 (transfection)(transfection)現(xiàn)象現(xiàn)象定義定義分類分類用途用途l轉化轉化 （transformatio

4、n transformation ）u現(xiàn)象: 肺炎鏈球菌的轉化試驗肺炎鏈球菌的轉化試驗u定義:u分類和應用:自然轉化自然轉化: :感受態(tài)感受態(tài), ,宿主菌種類宿主菌種類 人工轉化人工轉化: : 低溫低溫CaCl2CaCl2、電穿孔、電穿孔小鼠的肺炎鏈球菌的轉化試驗小鼠的肺炎鏈球菌的轉化試驗l轉導轉導(transduction )(transduction )u現(xiàn)象:“U”“U”型管實驗型管實驗 u定義:u分類和應用:普遍性轉導普遍性轉導 局限性轉導局限性轉導局限性轉導局限性轉導l轉染轉染 (transfection)(transfection)u現(xiàn)象: 感染感染(infection)(infe

5、ction)、病毒感染、病毒感染u定義: 廣義和狹義廣義和狹義u分類和應用:物理化學方法物理化學方法 生物學方法生物學方法( (病毒載體病毒載體) ) 野生型病毒的自然感染、病毒載體轉染和質粒經(jīng)化學法介導的轉染野生型病毒的自然感染、病毒載體轉染和質粒經(jīng)化學法介導的轉染3. 基因轉移入真核細胞的方法基因轉移入真核細胞的方法l基因轉移入真核細胞的影響因素基因轉移入真核細胞的影響因素 l外源基因轉移入真核細胞的類型外源基因轉移入真核細胞的類型和方法和方法 l構建外源基因的基本要素構建外源基因的基本要素 轉移入原核細胞的影響因素:u限制限制- -修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng)u質粒宿主范圍和相容性質粒宿主范圍和相容

6、性u同源重組與非同源重組同源重組與非同源重組l基因轉移入真核細胞的影響因素基因轉移入真核細胞的影響因素 真核與原核細胞具有顯著區(qū)別;外源基因要進入真核細胞，要突破三大障礙; 理想的轉基因技術方法質粒型載體:l物理方法l化學方法l外源基因轉移入真核細胞的類型和方法外源基因轉移入真核細胞的類型和方法l傳統(tǒng)的針頭注射l顯微注射l粒子轟擊l電穿孔l流體動力學l包裹微球l超聲l磷酸鈣法l脂質體法lDEAE-Dxtran法常用的物理方法介導基因轉移常用的物理方法介導基因轉移l外源基因轉移入真核細胞的類型和方法外源基因轉移入真核細胞的類型和方法病毒顆粒型載體(病毒介導的轉基因技術) u假型病毒載體（復制缺陷性病毒載體）：具有感染性u重組型病毒載體：具有感染性lDNA病毒載體：AdV, AAV,HSV-1,etc.lRNA病毒載體: HIV, etc.l雜合型病毒載體 不同類型轉基因技術方法的優(yōu)缺點比較不同類型轉基因技術方法的優(yōu)缺點比較l構建外源基因的基本要素構建外源基因的基本要素 u轉錄控制元件u翻譯