培養(yǎng)基及其配制

1、第3章 培養(yǎng)基及其配制講授：白鳳麟 2013.09.26培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制 本章主要內(nèi)容培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一一、培養(yǎng)基的種類二、培養(yǎng)基的組成二、培養(yǎng)基的組成 植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機體的建造，成為物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn) 定、電荷平衡等點化學(xué)方面

2、的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、 器官建成。培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成無機營養(yǎng)成分+有機營養(yǎng)成分=基本培養(yǎng)基Arnon和和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的素的3個標(biāo)準(zhǔn)個標(biāo)準(zhǔn)A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史。B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充該元素來預(yù)防和恢復(fù)。C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進而產(chǎn)生的間接效果。國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、

3、Cl、（Ni） 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上； 9種微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg 7種按照國際植物生理協(xié)會的建議：按照國際植物生理協(xié)會的建議： 所需濃度所需濃度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素為大量元素的元素為大量元素 所需濃度所需濃度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素為微量元素的元素為微量元素1、大量元素、大量元素N N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成

4、成分，在植物生命活動中脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。占有重要的位置。 P P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KHKH2 2POPO4 4 NaHNaH2 2POPO4 4等。等。 K K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。有密切關(guān)系。MgMg、S S、CaCa是葉綠素的組成成分，又是激酶的是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S S是含是含S S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。CaCa是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對

5、細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，CaCa及鈣調(diào)素在細(xì)胞及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。2、微量元素、微量元素 在微量元素中，在微量元素中，鐵鐵的使用最大的使用最大 ： 一些氧化酶的組成成分一些氧化酶的組成成分 葉綠素形成的必要條件葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-FeEDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀鰲合物防止鐵的沉淀 硼硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關(guān)系與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關(guān)系 銅銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生是某些氧化酶的成分，能夠

6、促進離體根的生長長 錳錳參與植物的光合、呼吸代謝參與植物的光合、呼吸代謝 鉬鉬參與氮素的代謝參與氮素的代謝 氯氯是光合作用水光解的活化劑是光合作用水光解的活化劑 微量元素的主要作用是作為微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑酶的輔助因子或激活劑參與參與代謝的調(diào)節(jié)。代謝的調(diào)節(jié)。 缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時，新梢頂端枯死。引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時，新梢頂端枯死。 桃樹桃樹缺銅癥狀：缺銅癥狀： 新梢頂端葉片的葉尖失綠新梢頂端葉

7、片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點至變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點至擴大變成深褐色，引起落葉。擴大變成深褐色，引起落葉。 枝頂端生長不良，其下部枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的的芽開始生長，形成叢生的細(xì)枝。細(xì)枝。 菊花菊花缺錳典型癥狀：缺錳典型癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。由幼葉開始。 菜豆菜豆缺鉬典型癥狀：缺鉬典型癥狀：葉較小，葉脈間失綠葉較小，葉脈間失綠,有壞有壞死斑點，且葉邊緣焦枯，死斑點，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時葉片十字花科植物缺鉬時葉片卷曲畸形，

8、老葉變厚且枯卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。焦。 白菜白菜缺硼典型癥狀：缺硼典型癥狀： 受精不良受精不良,籽粒減少籽粒減少 ，“花而不實花而不實”， “蕾而不蕾而不花花”； 根尖、莖尖的生長點停止根尖、莖尖的生長點停止生長，而形成簇生狀；生長，而形成簇生狀； 常引起各種腐爛病。常引起各種腐爛病。 馬鈴薯馬鈴薯3、碳源、碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以酸，以糖類糖類物質(zhì)最重要。物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點：糖類物質(zhì)特點： 具有熱易變的性質(zhì)具有熱易變的性質(zhì) 利于吸收和利用利于吸收和利用 使用濃度一般在使用濃度一般在2%2%5%5% 提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓提

9、供能源和調(diào)節(jié)滲透壓4、維生素類、維生素類 以各種以各種輔酶輔酶的形式存在的形式存在 參與多種代謝活動參與多種代謝活動 對生長，分化等有很好的促進作用對生長，分化等有很好的促進作用 主要分為主要分為脂溶性維生素脂溶性維生素和和水溶性維生素水溶性維生素 常用維生素有常用維生素有V VB1B1和和V VB6B6 5、肌醇、肌醇 環(huán)己六醇環(huán)己六醇 細(xì)胞壁的構(gòu)建材料細(xì)胞壁的構(gòu)建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動生理活動 促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用6、氨基酸、氨基酸 蛋白質(zhì)的組成成分蛋白質(zhì)的組成成分 有機氮源有機氮源 可直接被細(xì)胞吸收利用可

10、直接被細(xì)胞吸收利用 培養(yǎng)基中常用的是培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸甘氨酸7、天然復(fù)合物、天然復(fù)合物 促進某些愈傷組織和器官的生長促進某些愈傷組織和器官的生長 化學(xué)成分不明、復(fù)雜化學(xué)成分不明、復(fù)雜 天然營養(yǎng)混合物天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、瓊脂、瓊脂 是使用最普遍的凝固劑是使用最普遍的凝固劑用量一般在用量一般在6 610g/L10g/L之間之間顏色以淺、透明度高好，顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。冷膠等。9、活性炭、活性炭 吸附培養(yǎng)基及

11、培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì) 抑制外植體褐變抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產(chǎn)生防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進培養(yǎng)物生長和分化促進培養(yǎng)物生長和分化 促進生根促進生根缺點：缺點： 沒有選擇性沒有選擇性10、抗生素、抗生素 防止外植體內(nèi)生菌造成的污染防止外植體內(nèi)生菌造成的污染活性炭活性炭11、生長素類、生長素類 促進細(xì)胞伸長和分裂促進細(xì)胞伸長和分裂 促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實 誘導(dǎo)愈傷組織形成誘導(dǎo)愈傷組織形成 溶于溶于95%95%酒精或酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的Na

12、OHNaOH中，后者的中，后者的溶解效果更好溶解效果更好 常用的生長素：常用的生長素： IAA(IAA(吲哆乙酸吲哆乙酸) ) NAA ( NAA (奈乙酸奈乙酸 ) ) 2,4-D( 2,4-D(二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸) ) IBA( IBA(吲哆丁酸吲哆丁酸) )生長素作用強弱順序：IAANAAIBA2,4-D強強弱弱2，4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織，IBA和NAA常用于生根12、細(xì)胞分裂素類 促進細(xì)胞分裂和分化 誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成 延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控 溶于0.51.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中 常用的細(xì)胞分裂素： KT (激動素) BA(6-

13、卞基腺嘌呤) ZT(異戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素類和脫落酸 A、赤霉素類 組織培養(yǎng)中不常使用 加速細(xì)胞的伸長生長 促進細(xì)胞的分裂 主要是GA3 B、脫落酸 抑制細(xì)胞分裂和伸長 促進脫落和衰老 促進休眠和提高抗逆能力14、水作用：作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。 注意：注意：用蒸餾水，最好是雙蒸水；以保持用蒸餾水，最好是雙蒸水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時可用培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。自來水。1、MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 無機鹽濃度高無機鹽濃度高 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽高含量的氮

14、、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽含有一定數(shù)量的銨鹽 營養(yǎng)豐富營養(yǎng)豐富 不需要添加更多的有機附加物不需要添加更多的有機附加物（一）、幾種常見培養(yǎng)基的特點（一）、幾種常見培養(yǎng)基的特點（二）、（二）、White培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19431943年由年由WhiteWhite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計 19631963年作了改良，提高年作了改良，提高MgSOMgSO4 4的濃度和增加硼元素的濃度和增加硼元素 無機鹽濃度較低無機鹽濃度較低 使用廣泛使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果（三）、（三）、B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19681968年由年由Gamb

15、orgGamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計而設(shè)計 含有較低的銨鹽含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素（四）、（四）、N6培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19741974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計養(yǎng)設(shè)計 AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出現(xiàn)濃度：1-10mg/L抗生素：抗生素：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。作用：可防止外植體內(nèi)生菌污染。濃度：520mg/L。1、 母液母液(stock solution)的配制和保存的配制和保存v所謂所謂母液母液是欲配制液的是欲配制液的濃縮液濃縮液。v意義意義: 保證各

16、物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性 配制時的快速移取配制時的快速移取 便于低溫保藏。便于低溫保藏。三、三、 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制v單配法：單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用度的母液。一般用mg/ml 。v混配法：混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。v母液配制時可分別配成母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等鐵鹽、有機物和激素類等 母液的配制方法：母液的配制方法： 培養(yǎng)

17、基母液的配制 vMS母液配制：vMSI 大量元素 20X MSII 微量元素 200X MSIII鐵 鹽 200X MSIV有機 物 200X MSV肌 醇 200X 激 素 0.1mg/ml將將1、2、4、5稱好放入燒稱好放入燒杯分別溶解混杯分別溶解混合，將合，將3最后最后混合，再定容混合，再定容到到1L，放入試，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，劑瓶貼標(biāo)簽，備用備用 定容定容貼標(biāo)簽貼標(biāo)簽1L MS X20 2013.9.26 HXH注：注： Ca2+和和S042-混合后易沉淀。混合后易沉淀。將將17稱好放入燒杯分稱好放入燒杯分別溶解混合，定容到別溶解混合，定容到1L，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備放入試劑瓶貼標(biāo)簽，

18、備用用 定容定容貼標(biāo)簽貼標(biāo)簽1L MS X200 2013.9.26 HXHMS (鐵鹽鐵鹽)配方用量配方用量mg/L200X（mg）稱量稱量(g)1.FeSO47H2O27.855605.562.Na2EDTA2H2O37.374607.46將將1稱好放入稱好放入燒杯甲溶解，燒杯甲溶解，將將2放入燒杯放入燒杯乙溶解，再混乙溶解，再混合定容到合定容到1L，放入試劑瓶貼放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用標(biāo)簽，備用1L混合定容混合定容貼標(biāo)簽貼標(biāo)簽 MS X200 2013.9.26 HXH將將1、2、3、4稱好放入燒稱好放入燒杯分別溶解混杯分別溶解混合，定容到合，定容到1L，放入試劑瓶貼放入試劑瓶貼標(biāo)簽，備用

19、標(biāo)簽，備用 定容定容貼標(biāo)簽貼標(biāo)簽1L MS X200 2013.9.26 HXH將肌醇稱好放將肌醇稱好放入燒杯溶解定入燒杯溶解定容到容到1L，放入，放入試劑瓶貼標(biāo)簽，試劑瓶貼標(biāo)簽，備用備用溶解定容溶解定容貼標(biāo)簽貼標(biāo)簽1L MS X200 2013.9.26 HXHv母液配制時應(yīng)注意事項：母液配制時應(yīng)注意事項：母液配好后放人冰箱內(nèi)母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存低溫保存（4），用時），用時再按比例稀釋。再按比例稀釋。其中其中III、IV、以及激素類物質(zhì)應(yīng)以、以及激素類物質(zhì)應(yīng)以棕色瓶棕色瓶盛裝。盛裝。母液母液使用前搖動瓶子使用前搖動瓶子，如有沉淀、絮狀物、微，如有沉淀、絮狀物、微生物污染應(yīng)停止使用生物

20、污染應(yīng)停止使用取樣時移液管要取樣時移液管要對應(yīng)取樣，對應(yīng)取樣，防止交叉污染防止交叉污染2、培養(yǎng)基的配制：MSBA2NAA0.2糖3.0瓊脂0.7 pH=5.8 MS：MS I 50 mlMS II 5 mlMS III 5 mlMS IV 5 mlMS V 5 ml BA：20ml; NAA：2ml 糖：30g; 瓊脂：7gV貯備液用量貯備液用量V V配制配制/ /濃縮倍數(shù)濃縮倍數(shù)V V激素貯備液激素貯備液 C激素激素*V V配制配制/0.1/0.1mg/mlmg/ml培養(yǎng)基的選擇v培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 植物激素植物激素 v培養(yǎng)基的選擇在實質(zhì)上講就是設(shè)計營養(yǎng)物培養(yǎng)基的選擇在實質(zhì)上講就是設(shè)計營養(yǎng)物質(zhì)與激素（種類、用量）的最佳組合。質(zhì)與激素（種類、用量）的最佳組合。v篩選培養(yǎng)基常用的試驗方法：篩選培養(yǎng)基常用的試驗方法： 單因子試驗單因子試驗 多因子試驗多因子試驗 逐步添加