病原性真菌檢驗(yàn)臨床微生物學(xué)三軍醫(yī)大學(xué)

1、第一部分 弧 菌第1頁/共62頁概 述 弧菌科（Vibrionaseae）包括一群氧化酶陽性、具有端極鞭毛、動(dòng)力陽性的細(xì)菌，有4個(gè)菌屬，其中，弧菌屬是一群氧化酶陽性，發(fā)酵葡萄糖，對(duì)弧菌抑制劑O/129（二氨基二異丙基喋啶）敏感的細(xì)菌。 弧菌屬(Vibrio)廣泛分布于自然界，尤以水中為多，有100多種。主要致病菌為霍亂弧菌和副溶血弧菌（致病性嗜鹽菌）。前者引起霍亂；后者引起食物中毒。第2頁/共62頁霍 亂 弧 菌霍亂弧菌（V.cholera）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫的烈性傳

2、染病。第3頁/共62頁 霍亂弧菌包括兩個(gè)生物型：古典生物型（Classical biotype）和埃爾托生物型（EL-Tor bio-type）。這兩種型別除個(gè)別生物學(xué)性狀稍有不同外，形態(tài)和免疫學(xué)性基本相同，在臨床病理及流行病學(xué)特征上沒有本質(zhì)的差別。自1817年以來，全球共發(fā)生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍亂弧菌，第七次病原是埃爾托型所致。第4頁/共62頁1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集。該菌株在水中的存活時(shí)間較01群霍亂弧菌長，因而有可能成為引

3、起世界性霍亂流行的新菌株。第5頁/共62頁一、生物學(xué)性狀（一）形態(tài)染色 霍亂弧菌呈弧形或逗點(diǎn)形態(tài)，大小為1.42.60.50.8m。革蘭氏陰性菌，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞。 取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察，可見細(xì)菌運(yùn)動(dòng)極為活潑，呈流星穿梭運(yùn)動(dòng)。 第6頁/共62頁圖注：霍亂弧菌的鞭毛（）和它可溶解的鞘膜（） 負(fù)染，3 100 圖注：分裂中的霍亂弧菌 冰凍蝕刻，70 000 第7頁/共62頁第8頁/共62頁（二）培養(yǎng)特性 霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌; ; 營養(yǎng)要求不高，耐堿不耐酸，在pH8.89.0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好。因其他細(xì)菌在這一pH不易生長，故堿性蛋白胨水可作

4、為選擇性增殖霍亂弧菌的培養(yǎng)基; ; 在堿性平板上菌落直徑為2mm，圓形，光滑，透明。 第9頁/共62頁第10頁/共62頁 常用的選擇培養(yǎng)基為硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板（TCBS），霍亂弧菌在其中可形成較大的菌落，因發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸而使菌落呈黃色。第11頁/共62頁第12頁/共62頁（三）生化反應(yīng) 兩個(gè)生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。遲緩發(fā)酵乳糖，不分解阿拉伯糖。 氧化酶、明膠酶試驗(yàn)均陽性。 能產(chǎn)生靛基質(zhì)，霍亂紅反應(yīng)陽性第13頁/共62頁El Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應(yīng)有所不同 El Tor型VP試驗(yàn)為陽性，能產(chǎn)生強(qiáng)烈的溶血素，溶解羊紅細(xì)

5、胞，在血平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血環(huán)， 古典型試驗(yàn)VP試驗(yàn)為陰性，不溶解羊紅細(xì)胞。 個(gè)別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。 第14頁/共62頁霍亂弧菌的抗原結(jié)構(gòu)特性O(shè)抗原H抗原屬共同抗原 群特異性型特異性耐熱性（100 2h）（四）抗原性 1抗原結(jié)構(gòu)：第15頁/共62頁2分群和分型： 根據(jù)O抗原的特異性，可將霍亂弧菌分成139個(gè)血清群。 根據(jù)是否與O1抗血清凝集分兩大群， 凡能與O1群抗血清發(fā)生凝集的稱為O1群霍亂弧菌； 凡不被O1群抗血清凝集的其它血清群統(tǒng)稱為非O1群霍亂弧菌。第16頁/共62頁O1群霍亂弧菌的血清分型型別別名O抗原成份原型稻葉型（Inaba）A、C異型小川型（O

6、gawa）A、B中間型彥島型（Hikojima）A、B、C血清型：O1群霍亂弧菌的菌體抗原由A、B、C三個(gè)抗原成份組成第17頁/共62頁 生物型：O1群霍亂弧菌有古典生物型和E1 Tor 生物型之分，兩個(gè)生物型具有相同的血清型。我國流行以El Tor、小川型霍亂弧菌為主。 噬菌體分型： 對(duì)噬菌體的敏感性進(jìn)行分型，其中較為實(shí)用的是第組和第組噬菌體。第18頁/共62頁霍亂弧菌兩個(gè)生物型的鑒別性 狀古 典 型E1 Tor 型溶血（1%綿羊紅細(xì)胞）d血凝（2.5%雞紅細(xì)胞）V-P試驗(yàn)多 粘 菌 素 B 敏 感 試 驗(yàn)（50U/片）噬 菌 體 組 裂 解（106/ml）噬 菌 體 組 裂 解（106/m

7、l）以上為陽性；以上為陰性；陽性第19頁/共62頁霍亂弧菌的變異性形態(tài)變異弧型直桿狀 多形 菌落變異S RL 溶血性變異（ El Tor型）溶血性 非溶血性 傳代 毒力變異強(qiáng)毒株 弱毒株 無毒株 血清型別變異小川型 稻葉型 （五）變異性：第20頁/共62頁（六）抵抗力 霍亂弧菌古典生物型對(duì)外環(huán)境抵抗力較弱，EL-Tor生物型抵抗力較強(qiáng)。 霍亂弧菌對(duì)熱、干燥、日光、化學(xué)消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿而不耐酸。 霍亂弧菌對(duì)鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素敏感，但El Tor生物型對(duì)一定濃度的多粘菌素B及慶大霉素有耐藥性。第21頁/共62頁二、致病性和免疫性1致病物質(zhì)（1） 鞭毛、菌毛、粘液素酶（2） 霍亂

8、腸毒素（cholera enterotoxin） 霍亂腸毒素本質(zhì)是蛋白質(zhì)，不耐熱。對(duì)蛋白酶敏感而對(duì)胰蛋白酶抵抗。 該毒素屬外毒素，具有很強(qiáng)的抗原性。第22頁/共62頁霍亂腸毒素霍亂腸毒素1個(gè)A亞單位毒性單位A1肽鏈具有激活腺苷酸環(huán)化酶的酶活性A2肽鏈結(jié)合B亞單位；參與轉(zhuǎn)位5個(gè)B亞單位（46）結(jié)合單位特異地識(shí)別腸上皮細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂受體第23頁/共62頁第24頁/共62頁致病機(jī)理霍亂弧菌胃對(duì)酸敏感，很快被殺死腸胃酸降低或缺乏，菌體增多鞭毛、菌毛、粘液素酶絨毛上大量繁殖CT的B亞單位結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂受體形成膜通道A1肽鏈進(jìn)入細(xì)胞第25頁/共62頁ATP cAMP 腸粘膜上皮細(xì)胞分泌亢進(jìn)腸液大量分

9、泌大量體液和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔而發(fā)生劇烈吐瀉大量脫水和失鹽發(fā)生代謝性酸中毒，血循環(huán)衰竭，甚至休克或死亡激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)第26頁/共62頁2所致疾病 引起烈性腸道傳染病的霍亂，為我國的法定傳染病（甲類），表現(xiàn)為劇烈的上吐下瀉，導(dǎo)致嚴(yán)重的脫水、酸中毒、痙攣、尿閉、休克和死亡。 人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經(jīng)口傳染（糞口途徑）。患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”，并含大量弧菌，此為本病典型的特征。 第27頁/共62頁3免疫性 患過霍亂的人可獲得牢固的免疫力，再感染者少見。 病后小腸內(nèi)可出現(xiàn)分泌型lgA。第28頁/共62頁三、微生物學(xué)診斷 由于霍亂流行迅速，且

10、在流行期間發(fā)病率及死亡率均高，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對(duì)治療和預(yù)防本病的蔓延有重大意義。（一）標(biāo)本采集： 標(biāo)本以糞便為主， 一般米泔水樣便采取13ml，成形便采取蠶豆大小。 在某些情況下，亦可采取嘔吐物和尸體腸內(nèi)容物作檢材。 第29頁/共62頁檢驗(yàn)程序第30頁/共62頁（三）檢驗(yàn)方法及鑒定1直接鏡檢：1）動(dòng)力觀察：采取病人“米泔水樣”大便或嘔吐物制成懸滴片，觀察細(xì)菌動(dòng)力，可見流星或穿梭狀動(dòng)力的細(xì)菌。2）制動(dòng)試驗(yàn)： 標(biāo)本， 霍亂多價(jià)診斷血清（效價(jià)1：64），用暗視野鏡觀察，3分鐘內(nèi)運(yùn)動(dòng)被抑制的即為陽性， 此法優(yōu)點(diǎn)是快速而特異操作簡便，但必須有數(shù)量較多的弧菌才檢出。第31頁/共62頁3

11、）涂片染色：革蘭氏染色陰性并成魚群狀排列的弧菌。第32頁/共62頁2快速診斷：1） 免疫熒光菌球法：將標(biāo)本接種于含有霍亂弧菌熒光抗體的堿性蛋白胨水中，經(jīng)3746h，如有霍亂弧菌，在熒光顯微鏡下可見發(fā)熒光的菌球。本法適用于做大量標(biāo)本的初篩。2） SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)：以霍亂弧菌IgG型抗體與SPA陽性葡萄球菌結(jié)合作為試劑，與米泔水樣便或增菌液作玻片凝集，立即出現(xiàn)明顯凝集者（）為陽性。第33頁/共62頁3細(xì)菌分離培養(yǎng)1） 直接分離培養(yǎng)： 分離用的培養(yǎng)基有強(qiáng)、弱2種選擇培養(yǎng)基。 弱選擇培養(yǎng)基：堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂。 強(qiáng)選擇培養(yǎng)基：常用的有慶大霉素瓊脂、4號(hào)瓊脂和TCBS瓊脂等。 現(xiàn)多采用堿性蛋白胨水

12、增菌，再用強(qiáng)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離。 第34頁/共62頁4 鑒定： 根據(jù)霍亂弧菌在各種選擇培養(yǎng)基上的特點(diǎn)，挑選可疑菌落進(jìn)行鑒定。鑒定以血清學(xué)（玻片凝集）為主，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)作出判斷。1） 玻片凝集試驗(yàn)：從分離培養(yǎng)基上挑取可疑菌落于霍亂弧菌多價(jià)診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)。診斷血清應(yīng)稀釋成1:32-1:64的效價(jià)使用，立即出現(xiàn)凝集者為陽性，同時(shí)設(shè)生理鹽水和陽性細(xì)菌株對(duì)照。 第35頁/共62頁2） 形態(tài)學(xué)檢查：取純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)及染色性。用懸滴法或半固體穿刺法檢測動(dòng)力。3） 生化反應(yīng)：霍亂弧菌氧化酶試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、粘絲試驗(yàn)和霍亂紅試驗(yàn)均陽性。 粘絲試驗(yàn)：用于測定霍亂弧菌形成粘絲的

13、特性。將0.5去氧膽酸鈉水溶液于霍亂弧菌混勻制成濃厚菌液，1min內(nèi)懸液由混變清，并變得粘稠，以接種環(huán)挑取時(shí)可以拉出絲來?；魜y弧菌古典生物型和El Tor生物型均呈陽性。 第36頁/共62頁第37頁/共62頁 霍亂紅試驗(yàn)：出現(xiàn)薔薇色，為霍亂紅試驗(yàn)陽性。由于霍亂弧菌和其他弧菌均有此種反應(yīng)，故無特異性。（霍亂弧菌含有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，霍亂弧菌液能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，因此當(dāng)霍亂弧菌培養(yǎng)在含有硝酸鹽成分的蛋白胨水中，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽可與吲哚結(jié)合成亞硝酸吲哚，滴加濃硫酸即可出現(xiàn)薔薇色，稱為霍亂紅試驗(yàn)陽性） O/129敏感試驗(yàn)：將O/129（2，4二氨基6，7二異丙基喋啶）藥敏紙片（101

14、50g）貼在接種有待測菌的瓊脂平板上作紙片擴(kuò)散試驗(yàn)，凡藥物紙片周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)者為敏感。第38頁/共62頁4） 霍亂弧菌的分型鑒別試驗(yàn)：血清分型：用小川型和稻葉型單價(jià)診斷血清作玻片凝集。與小川型血清凝集而與稻葉型血清不凝集者為小川型，反之為稻葉型。在兩個(gè)單價(jià)血清中均有明顯凝集者為彥島型。生物型別的鑒定：目前，兩型主要依靠第組霍亂噬菌體裂解試驗(yàn)進(jìn)行鑒別，并輔以多粘菌素敏感試驗(yàn)、雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、VP試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)。 第39頁/共62頁 第組霍亂噬菌體裂解試驗(yàn)： 第組霍亂噬菌體常規(guī)稀釋液（106/ml）一般僅裂 解古典型，而不裂解El Tor型。 多粘菌素B B敏感試驗(yàn)： 取被檢菌2-3h肉湯培養(yǎng)物

15、點(diǎn)種到含藥營養(yǎng)瓊脂平板上（多粘菌素B50Uml）,37培養(yǎng)24h，El TorEl Tor生物型生長，而古典型敏感。第40頁/共62頁第41頁/共62頁 雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)：在玻片上滴加生理鹽水一滴，取被檢菌18-24h培養(yǎng)物少許在鹽水中制成濃厚菌懸液，然后加一滴2.5雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻，1min1min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性，紅細(xì)胞呈均勻分散者為陰性。El TorEl Tor生物型為陽性，古典型為陰性。第42頁/共62頁鑒定要點(diǎn)：確診O1群霍亂弧菌必須具備的條件：1、涂片為革蘭氏陰性弧菌或桿菌；2、TCBS等選擇培養(yǎng)基上典型的菌落特征；3、動(dòng)力陽性；4、O1群霍亂弧菌診斷血清凝集試驗(yàn)陽性。第4

16、3頁/共62頁四、防治原則 必須貫徹預(yù)防為主。 人群的菌苗預(yù)防接種，可獲良好效果， 治療主要為及時(shí)補(bǔ)充液體和電解質(zhì)及應(yīng)用抗菌藥物如四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素、強(qiáng)力霉素及氟哌酸類抗生素藥物。 第44頁/共62頁第二部分 彎曲菌屬第45頁/共62頁 彎曲菌屬(Campylobacter)細(xì)菌是一類微需氧、不分解糖類、氧化酶陽性、菌體彎曲呈逗點(diǎn)狀、S型或螺旋狀、有動(dòng)力的革蘭氏陰性菌。 對(duì)人類致病的主要是空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌胎兒亞種，前者是人類腹瀉最常見的病原菌之一，后者在免疫功能低下時(shí)可引起敗血癥、腦膜炎等。 本節(jié)主要以空腸彎曲菌介紹本屬的生物學(xué)特性和檢驗(yàn)方法第46頁/共62頁一、生物學(xué)性狀（一）形態(tài)

17、與染色 空腸彎曲菌 （C.jejuni）菌體輕度彎曲似逗點(diǎn)狀，長1.55 m，寬0.20.8 m。菌體一端或兩端有鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，在暗視野鏡下觀察似飛蠅。有莢膜，不形成芽胞。革蘭氏陰性。圖注：空腸彎曲菌的兩端單鞭毛（） 負(fù)染，21 000 第47頁/共62頁（二）培養(yǎng)特性 為微需氧菌，在含2.55%氧和10%CO2的環(huán)境中生長最好。最適溫度為3742。在正常大氣或無氧環(huán)境中均不能生長。 本菌營養(yǎng)要求高，需加入血液、血清才能生長。 在凝固血清和血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)36小時(shí)可見無色半透明毛玻璃樣小菌落，單個(gè)菌落呈中心凸起，周邊不規(guī)則，無溶血現(xiàn)象。第48頁/共62頁（三）生化反應(yīng)空腸彎曲生化反應(yīng)不活潑

18、，不發(fā)酵糖類，不分解尿素，不液化明膠，靛基質(zhì)陰性。可還原硝酸鹽，氧化酶和過氧化氫酶為陽性。甲基紅和VP試驗(yàn)陰性；枸椽酸鹽培養(yǎng)基中不生長。 第49頁/共62頁（四）抵抗力 抵抗力不強(qiáng)，易被干燥、直射日光及弱消毒劑所殺滅，565分鐘可被殺死。 對(duì)紅霉素、新霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。但近年發(fā)現(xiàn)了不少耐藥菌株。 第50頁/共62頁（五）抗原構(gòu)造 本菌抗原構(gòu)造與腸道桿菌一樣具有O、H和K抗原。 根據(jù)O抗原，可把空腸彎曲菌分成45個(gè)以上血清型。 第51頁/共62頁二、致病性與免疫性空腸彎曲菌是多種動(dòng)物如牛、羊、狗及禽類的正常寄居菌。污染食物和飲水，可引起人類急性腸炎和食物中毒，

19、其致病因素與腸毒素、內(nèi)毒素、細(xì)胞毒素、侵襲力有關(guān)。感染后能產(chǎn)生特異性血清抗體，第52頁/共62頁三、微生物學(xué)診斷（一）標(biāo)本采集： 取腹瀉病人新鮮糞便或肛拭子立即送檢。如不能及時(shí)送檢，應(yīng)將標(biāo)本接種于卡布運(yùn)送培養(yǎng)基。（二）檢驗(yàn)程序：第53頁/共62頁第54頁/共62頁（三）檢驗(yàn)方法及鑒定1直接涂片 （1）懸滴標(biāo)本檢查： 顯微鏡下觀察有無投鏢式或螺旋狀運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌。腦脊液制成涂片作懸滴檢查。 （2）革蘭氏染色檢查： 為革蘭氏陰性，逗點(diǎn)狀、S形或螺旋狀小桿菌。第55頁/共62頁第56頁/共62頁2分離培養(yǎng)：選擇培養(yǎng)基分離 接種于具有高度選擇性的平板培養(yǎng)（布氏菌血瓊脂抗性分離培養(yǎng)基），然后放玻璃缸內(nèi)（內(nèi)含

20、85%N2，10%CO2，5%O2），置42孵箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)。 挑選可疑菌落，菌落為灰色、平坦、規(guī)則，在血平板上不溶血，再用生化反應(yīng)和血清凝集試驗(yàn)作出最后鑒定。 第57頁/共62頁第58頁/共62頁鑒定要點(diǎn): 氧化酶陽性，革蘭氏陰性，菌體彎曲或稱S形，微需氧，觸酶試驗(yàn)陽性，不利用糖類，42時(shí)生長。第59頁/共62頁空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌的生化反應(yīng)鑒定試驗(yàn)種類空腸彎曲菌胎兒彎曲菌萘啶酸敏感試驗(yàn)敏感耐藥頭孢噻吩敏感試驗(yàn)?zāi)退幟舾旭R尿酸鹽水解試驗(yàn)醋酸吲哚水解試驗(yàn)第60頁/共62頁四、防治原則本病的預(yù)防在及時(shí)診斷和治療病人，以免傳播。加強(qiáng)衛(wèi)生防疫及人畜糞便管理，注意飲食和飲水衛(wèi)生。本菌對(duì)多種抗生素敏感，常用紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素治療。 第61頁/共62頁謝謝第62頁/共62頁霍 亂 弧 菌霍亂弧菌（V.cholera）是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫的烈性傳染病。第3頁/共62頁（三）生化反應(yīng) 兩個(gè)生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇