酶工程：2 酶的微生物發(fā)酵（酶學(xué)與酶工程）2學(xué)時(shí)

1、第二章 酶的生產(chǎn)酶的應(yīng)用領(lǐng)域EnzymesDiagnosticIndustrialenzymesBasic ResearchTherapeuticsAgricultureStructuralstudies 本課程講授主要針對(duì)工業(yè)酶制劑酶的生產(chǎn)方法 動(dòng)植物天然提取但動(dòng)植物原料生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、成本高，又受但動(dòng)植物原料生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、成本高，又受地理、氣候和季節(jié)等因素影響。地理、氣候和季節(jié)等因素影響。 野生菌發(fā)酵 基因工程菌(已經(jīng)成為主流方法)目前工業(yè)應(yīng)用酶大多數(shù)來(lái)自微生物，這是因?yàn)槟壳肮I(yè)應(yīng)用酶大多數(shù)來(lái)自微生物，這是因?yàn)橐晕⑸餅樯a(chǎn)原料有許多優(yōu)點(diǎn)以微生物為生產(chǎn)原料有許多優(yōu)點(diǎn)微生物種類繁多；微生物種類繁多

2、； 產(chǎn)酶微生物多；產(chǎn)酶微生物多；一種微生物可以產(chǎn)多種酶；一種微生物可以產(chǎn)多種酶；微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)方便；微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)方便；微生物易改造，可通過(guò)多種手段進(jìn)行育種。微生物易改造，可通過(guò)多種手段進(jìn)行育種。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝流程微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝流程酶的生產(chǎn)菌酶的生產(chǎn)菌 先決條件，直接影響發(fā)酵的生產(chǎn)成本先決條件，直接影響發(fā)酵的生產(chǎn)成本. .對(duì)生產(chǎn)菌的要求：對(duì)生產(chǎn)菌的要求：產(chǎn)酶量高，產(chǎn)酶量高，最好分泌胞外酶最好分泌胞外酶；容易培養(yǎng)和管理，能容易培養(yǎng)和管理，能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短。生產(chǎn)菌穩(wěn)定，不易變異、退化、不易感染噬菌體；生產(chǎn)菌穩(wěn)定，不易變異

3、、退化、不易感染噬菌體；非病源菌，非病源菌，同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無(wú)關(guān)，不產(chǎn)毒素同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無(wú)關(guān)，不產(chǎn)毒素及其他生理活性物質(zhì)及其他生理活性物質(zhì)；中國(guó)國(guó)家級(jí)菌種保藏管理中心（7個(gè)） 名稱及成立年份名稱及成立年份 依依 托托 單單 位位 中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 (ACCC)1980 (ACCC)1980 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 (CICC)1979 (CICC)1979 中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)醫(yī)

4、學(xué)微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所 (CMCC)1979 (CMCC)1979 中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)獸醫(yī)藥品檢定所中國(guó)獸醫(yī)藥品檢定所 (CVCC)1979 (CVCC)1979 中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 (CFCC)1985 (CFCC)1985 中國(guó)抗菌素菌種保藏管理中心中國(guó)抗菌素菌種保藏管理中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 (CACC)1979 (CACC)1979 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心中

5、國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 (CCGMC)1979 (CCGMC)1979 國(guó)外菌種中心American Type Culture CollectionAmerican Type Culture Collection Japan Collection of Microorganisms Japan Collection of Microorganisms http:/www.jcm.riken.go.jphttp:/www.jcm.riken.go.jpThe The Un

6、ited Kingdom National Culture United Kingdom National Culture collection collection http:/www.ukncc.co.ukhttp:/www.ukncc.co.ukDeutsche Sammlung von Mikroorganismen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen und Zellkulturen http:/www.dsmz.dehttp:/www.dsmz.deATCC ATCC 美國(guó)菌種中心，最大的菌種中美國(guó)菌種中心，

7、最大的菌種中心心, ,有病毒、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞有病毒、細(xì)菌、真菌、細(xì)胞等不同的微生物等不同的微生物JCM JCM 日本微生物菌種中心日本微生物菌種中心英國(guó)國(guó)家菌種中心，英國(guó)國(guó)家菌種中心，Over 70,000 Over 70,000 micro-organisms and cell micro-organisms and cell lines are available. lines are available. 德國(guó)微生物與細(xì)胞收集中心德國(guó)微生物與細(xì)胞收集中心主要產(chǎn)酶菌（野生）枯草桿菌枯草桿菌：工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌之一，淀粉酶、：工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷

8、酸酯酶等的產(chǎn)酶菌。葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶等的產(chǎn)酶菌。酵母：酵母：工業(yè)上廣泛應(yīng)用。工業(yè)上廣泛應(yīng)用。霉菌（黑曲、米曲、青霉、木霉和黃曲酶菌等）：霉菌（黑曲、米曲、青霉、木霉和黃曲酶菌等）：糖化糖化酶、蛋白酶、果膠酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、酶、蛋白酶、果膠酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基?；浮⒅久傅榷喾N酶。淀粉酶、氨基?；?、脂肪酶等多種酶。大腸桿菌：大腸桿菌：因?yàn)槠溥z傳背景清楚而廣泛應(yīng)用于遺傳工程因?yàn)槠溥z傳背景清楚而廣泛應(yīng)用于遺傳工程改造微生物的宿主，被改造成表達(dá)優(yōu)良性狀的改造微生物的宿主，被改造成表達(dá)優(yōu)良性狀的“工程工程菌菌”。也常在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、。也常

9、在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、門冬氨酸酶、限制性核酸內(nèi)切酶等。門冬氨酸酶、限制性核酸內(nèi)切酶等。主要產(chǎn)酶菌（基因工程菌） 米曲霉（真核系統(tǒng)） 木霉（真核系統(tǒng)） 酵母（真核系統(tǒng)），畢赤酵母是高效表達(dá)系統(tǒng)。 枯草桿菌（原核系統(tǒng)） 大腸桿菌（E. coli） （原核系統(tǒng)）蛋白質(zhì)的糖基化限制了原核系統(tǒng)。酶合成的調(diào)節(jié) 原核部分為重點(diǎn) 真核生物的僅做了解 一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制DNARNA （一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription) 定義定義 以以

10、DNADNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNARNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNARNA分分子的過(guò)程。子的過(guò)程。RNARNA合成過(guò)程合成過(guò)程起始起始雙鏈雙鏈DNA局部解開(kāi)局部解開(kāi)磷酸二酯磷酸二酯鍵形成鍵形成終止階段終止階段解鏈區(qū)到達(dá)解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)基因終點(diǎn)延長(zhǎng)階段延長(zhǎng)階段5 3 RNA 啟動(dòng)子啟動(dòng)子（promotor) 終止子終止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 離開(kāi)離開(kāi) 定義定義 以以mRNAmRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過(guò)各種體上通過(guò)

11、各種tRNAtRNA、酶和輔助因子的作用，合、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過(guò)程。成多肽鏈的過(guò)程。（二）蛋白質(zhì)的生物合成（二）蛋白質(zhì)的生物合成-翻譯翻譯(translation) 蛋白質(zhì)的合成過(guò)程蛋白質(zhì)的合成過(guò)程 （大腸桿菌）（大腸桿菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始v 肽鏈的延伸肽鏈的延伸v 肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)式：反應(yīng)式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 對(duì)于對(duì)于E.co

12、liE.coli而言，肽鏈合成時(shí)的第一而言，肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。二、酶生物合成的調(diào)節(jié)二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：定義：通過(guò)調(diào)節(jié)酶合成的量來(lái)控制微生物通過(guò)調(diào)節(jié)酶合成的量來(lái)控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。進(jìn)行的。意義：意義：通過(guò)阻止酶的過(guò)量合成，節(jié)約生物通過(guò)阻止酶的過(guò)量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。 操縱子操縱子基因表達(dá)的協(xié)同單位基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子操縱子結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì)（編碼蛋白質(zhì), , structural gene, S）控制

13、部位控制部位操縱基因操縱基因（operator gene, O）啟動(dòng)子啟動(dòng)子（promotor gene, P）Jacob and Monod的的） 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因(regulator gene)： 可產(chǎn)生一種組成型可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白(regulatory protein) ，通過(guò)與效應(yīng)物通過(guò)與效應(yīng)物(effector) （包括誘導(dǎo)物或輔阻遏物）（包括誘導(dǎo)物或輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。因的結(jié)合力。 調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游?；虿倏v子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)

14、示意圖 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因 操縱基因操縱基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 DNA 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 mRNA 翻譯翻譯 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑 控制區(qū)控制區(qū) 信息區(qū)信息區(qū)操縱子操縱子RPOSD N AC RP-cA M P復(fù) 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖復(fù)合物的作用示意圖 啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因（promotor gene）（）（啟動(dòng)子）：?jiǎn)?dòng)子）： 有兩個(gè)位點(diǎn)：有兩個(gè)位點(diǎn)： （1 1）RNARNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。的結(jié)合

15、位點(diǎn)。CAPCAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，RNARNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才能開(kāi)始。能開(kāi)始。 操縱基因操縱基因（Operater gene）: : 位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特

16、異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因（Structural gene）: : 決定某一多肽的決定某一多肽的DNADNA模板，與酶有各自的模板，與酶有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNAmRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。再翻譯為蛋白質(zhì)。( (二二) ) 酶合成調(diào)節(jié)的類型酶合成調(diào)節(jié)的類型 1.1.誘導(dǎo)誘導(dǎo) (induction) 組成酶：細(xì)胞固有的酶類。組成酶：細(xì)胞固有的酶類。 誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)類似誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)

17、類似 物而臨時(shí)合成的一類酶。物而臨時(shí)合成的一類酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression) 反饋?zhàn)瓒舴答佔(zhàn)瓒?feedback repression) 酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： - -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； 透過(guò)酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。透過(guò)酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：（1 1）大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)）大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)上述三種酶合成；上述三種酶合成；（2 2）大腸桿菌生長(zhǎng)在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述

18、三種）大腸桿菌生長(zhǎng)在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；酶合成； 表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成需要時(shí)才合成。調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 關(guān)關(guān) 閉閉啟啟動(dòng)動(dòng)子子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結(jié)構(gòu)基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟啟動(dòng)動(dòng)子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（無(wú)活性）（無(wú)活性） 基基 因因 表表達(dá)達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)B、乳糖酶的誘導(dǎo)、乳糖酶的誘導(dǎo) 乳糖乳糖 阻遏蛋

19、白阻遏蛋白（有活性）（有活性） 2. 2.末端產(chǎn)物阻遏末端產(chǎn)物阻遏 由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過(guò)量累積引起的阻遏。由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過(guò)量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現(xiàn)象：酶合成阻遏的現(xiàn)象： 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)： （1 1）大腸桿菌生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，）大腸桿菌生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)， 檢測(cè)檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在； （2 2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。合成酶的活性降低，直至消失。 表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌表明色氨酸的存

20、在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則: :不需要就不合成不需要就不合成。 色氨酸操縱子色氨酸操縱子酶的阻遏酶的阻遏調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基基因不能表達(dá)因不能表達(dá)酶酶的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)和和阻阻遏遏操操縱縱子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑有活性阻遏蛋白加

21、誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.無(wú)活性阻遏蛋白無(wú)活性阻遏蛋白D.無(wú)活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無(wú)活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因操縱基因啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋阻遏蛋白白(有活性有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合, 結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白阻遏蛋白(無(wú)活性無(wú)活性)酶蛋白酶蛋白

22、mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物調(diào)控方式調(diào)控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 與操縱基與操縱基因結(jié)合因結(jié)合阻遏效應(yīng)阻遏效應(yīng)舉例舉例酶的誘導(dǎo)酶的誘導(dǎo)有活性有活性不轉(zhuǎn)錄，不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯繼而不翻譯誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯繼而翻譯乳糖操乳糖操縱子縱子酶的阻遏酶的阻遏無(wú)活性無(wú)活性阻遏物阻遏物不轉(zhuǎn)錄，不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯繼而不翻譯色氨酸色氨酸操縱子操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對(duì)比酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對(duì)比3.3.分解代謝物阻遏分解代謝物阻

23、遏 指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。 分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過(guò)甲碳源（或氮源等）在其分解過(guò)程中所過(guò)甲碳源（或氮源等）在其分解過(guò)程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利

24、用葡細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開(kāi)始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)萄糖。待葡萄糖耗盡后才開(kāi)始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開(kāi)一個(gè)生長(zhǎng)延滯期的期中間隔開(kāi)一個(gè)生長(zhǎng)延滯期的“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象二次生長(zhǎng)現(xiàn)象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。02468020406080 細(xì)胞 濃 度(OD)時(shí) 間(h) 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺

25、苷酸受體蛋白（物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRPCRP）, ,亦稱亦稱降解物基因活化蛋白（降解物基因活化蛋白（CAPCAP）。）。分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表達(dá)達(dá)CAP基因基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)結(jié)合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代謝產(chǎn)物謝產(chǎn)物腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene ac

26、tivation protein）降低降低cAMP濃度濃度使使CAP呈失活狀態(tài)呈失活狀態(tài)酶生產(chǎn)發(fā)酵工藝菌種篩選菌種篩選搖瓶試驗(yàn)搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)酶生產(chǎn)發(fā)酵工藝 培養(yǎng)基組成碳源、氮源、碳氮比、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子 pH值 溫度 溶解氧 誘導(dǎo)方式 阻遏解除 其它添加劑 發(fā)酵工藝的優(yōu)化 培養(yǎng)基：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等； pH值：與細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖及發(fā)酵產(chǎn)酶都有密切關(guān)系，并且在細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和代謝物產(chǎn)生過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生變化，所以必須進(jìn)行必要的調(diào)控。還可以此改變各種酶產(chǎn)量比。 溫度： 是影響細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素，不同細(xì)菌有各自不同的最適生長(zhǎng)溫度，在發(fā)酵的不同階段培養(yǎng)基溫度變化明顯；產(chǎn)

27、酶最適溫度和細(xì)胞最適生長(zhǎng)溫度不同 ，故必須經(jīng)常及時(shí)地進(jìn)行溫度調(diào)控。 溶解氧：根據(jù)細(xì)胞對(duì)溶解氧的需要量進(jìn)行 連續(xù)不斷的無(wú)菌空氣供給，以使 培養(yǎng)基中的溶解氧維持在一定水 平，保證碳源有氧降解。發(fā)酵周期：作生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線，確定放 罐時(shí)間，避免自溶。 總之，總之，優(yōu)良菌種的篩選、適宜條件的確定是獲優(yōu)良菌種的篩選、適宜條件的確定是獲得高產(chǎn)酶的重要措施，能較大幅度提高酶產(chǎn)量，盡得高產(chǎn)酶的重要措施，能較大幅度提高酶產(chǎn)量，盡量挖掘微生物的產(chǎn)酶潛力。但是措施是有限的，并量挖掘微生物的產(chǎn)酶潛力。但是措施是有限的，并且是經(jīng)驗(yàn)的，隨機(jī)性大，單靠這些措施很不夠。為且是經(jīng)驗(yàn)的，隨機(jī)性大，單靠這些措施很不夠。為了使酶產(chǎn)

28、量有一個(gè)飛躍，要采取另外一些有效措施。了使酶產(chǎn)量有一個(gè)飛躍，要采取另外一些有效措施。 2、采用添加誘導(dǎo)物、解除阻遏物、流加等技術(shù) 誘導(dǎo)酶：對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，添加適量誘導(dǎo)物可使酶產(chǎn)量顯著提高；許多工業(yè)用酶都屬誘導(dǎo)酶。 誘導(dǎo)物：原理是，加入效應(yīng)物與阻遏蛋白結(jié)合，阻止其與操縱基因結(jié)合，使結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)；實(shí)際工作中，關(guān)鍵是選擇一個(gè)恰當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物、確定誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間。 誘導(dǎo)物一般有以下幾類： 難于被利用的底物，底物類似物或底物修飾物； 誘導(dǎo)物的前體； 胞外酶的作用產(chǎn)物； 誘導(dǎo)物添加的量和時(shí)間要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。 降低阻遏濃度 引起阻遏的原因有兩種： 尾產(chǎn)物阻遏：可去除尾產(chǎn)物或使其盡量少形成，如添加尾產(chǎn) 物類似物或抑制劑；采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株并限 制其生長(zhǎng)必需因子的供應(yīng)。 分解代謝產(chǎn)物阻遏： A)、盡量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源； B)、流加。 表面活性劑促進(jìn)分泌到胞外 細(xì)胞內(nèi)酶含量提高到一定程度，會(huì)被胞內(nèi)蛋白酶分解，加入表面活性劑之類促進(jìn)分泌劑，可使胞內(nèi)酶未被分解即被釋放到胞外。因?yàn)楸砻婊钚詣┯兄诟纳萍?xì)胞通透性，因而也可打破細(xì)胞內(nèi)酶合成的“反饋平衡”。 常用：Tween-80、Triton x-100等。3