抗Xa與抗IIa活性檢測方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、一、USP方法抗IIa活性（20.035.0IU/mg）.1儀器：紫外可見分光光度計、低溫循環(huán)槽、電子天平.2試液：醋酸溶液：取冰乙酸42ml于100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。pH7.4聚乙二醇6000緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷6.08g和氯化鈉8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，加聚乙二醇6000 1.0g，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，加水稀釋至刻度。pH7.4緩沖溶液：稱取三羥甲基氨基甲烷6.08g和氯化鈉8.77g于1000ml容量瓶中，加水500ml溶解后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，加水稀釋至刻度。pH 8.4緩沖溶液：稱取三羥甲基氨基甲烷3.03g、氯化鈉5

2、.12g和乙二胺四乙酸二鈉1.40g于500ml容量瓶中，加水250ml溶解后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.4，加水稀釋至刻度?？鼓窱II溶液：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000緩沖液稀釋成0.5Unit/ml。人凝血酶溶液：用水將人凝血酶復(fù)溶，用pH7.4聚乙二醇6000緩沖液稀釋成5Units/ml。顯色底物：選擇適合凝血酶的阿米酚試驗的顯色底物，用水稀釋成濃度約3mmol/L。臨用前用pH 8.4緩沖溶液稀釋至0.5 mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液：用pH 7.4緩沖溶液將USP依諾肝素鈉活性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為濃度0.0150.070USPIU/ml之間的四個

3、濃度梯度。樣品溶液：用pH 7.4緩沖溶液將依諾肝素鈉樣品稀釋為與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度一致的濃度梯度。.3檢測過程：取18支檢測管，B1、B2為空白；T1、T2、T3、T4為樣品溶液，各雙份平行；S1、S2、S3、S4為標(biāo)準(zhǔn)溶液，各雙份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的順序，每管中加入抗凝血酶III的體積為V（2050l），和同樣體積的pH 7.4緩沖溶液（空白）、標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液；混合，但不要產(chǎn)生氣泡。于37溫浴1分鐘。向每管中加入2V人凝血酶溶液（40100l），溫浴1分鐘。再加入5V顯色底物（100250l），4

4、分鐘后加入5V的醋酸溶液（100250l）終止反應(yīng)。以B1為空白，用紫外可見分光光度計在405nm處測量光吸收?？瞻譈2的吸收值相比B1不得超過0.05。.4計算對每個濃度系列，將光吸收回歸，與樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對數(shù)值作線性分析。然后以量平行線分析統(tǒng)計方法計算每mL中依諾肝素鈉抗IIa因子IU活性。4個濃度溶液的計算值組合計算得到最終的平均值，然后計算可信限度?？笽Ia因子用IU/mg表示，按干品計。兩人結(jié)果的相對平均偏差不得超過5.0%?？筙a因子活性（90125IU/mg）.1儀器：紫外可見分光光度計、低溫循環(huán)槽、電子天平.2試液：醋酸溶液、pH7.4聚乙二醇6000緩沖液、pH7.

5、4緩沖溶液、pH 8.4緩沖溶液同抗IIa因子檢測?？鼓窱II：取1支抗凝血酶III，加水溶解成5Units/ml。用pH7.4聚乙二醇6000緩沖液稀釋成1.0Unit/ml。Xa因子溶液：用pH7.4聚乙二醇6000緩沖液稀釋，使之在下述檢測中405nm處光吸收每分鐘增加不超過0.20，但要用體積為V的 pH7.4的緩沖液代替依諾肝素鈉溶液。顯色底物：選擇適合Xa因子的阿米酚試驗的顯色底物，用水稀釋成濃度約3mmol/L。臨用前用pH 8.4緩沖溶液稀釋至0.5 mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液：用pH 7.4緩沖溶液將USP依諾肝素鈉活性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為濃度0.0760.180 USP IU/ml

6、之間的四個濃度梯度。樣品溶液：用pH 7.4緩沖溶液將依諾肝素鈉樣品稀釋為與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度一致的濃度梯度。.3檢測過程：取18支檢測管，B1、B2為空白；T1、T2、T3、T4為樣品溶液，各雙份平行；S1、S2、S3、S4為標(biāo)準(zhǔn)溶液，各雙份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的順序，每管中加入抗凝血酶III的體積為V（2050l），和同樣體積的pH 7.4緩沖溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液；混合，但不要產(chǎn)生氣泡。于37溫浴1分鐘。向每管中加入2VXa因子溶液（40100l），溫浴1分鐘。再加入5V顯色底物（100250l），

7、4分鐘后加入5V的醋酸溶液（100250l）終止反應(yīng)。以B1為空白，用紫外可見分光光度計在405nm處測量光吸收?？瞻譈2的吸收值相比B1不得超過0.05。.4計算對每個濃度系列，將光吸收的回歸，與樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對數(shù)值作線性分析。然后以量平行線分析統(tǒng)計方法計算每mL中依諾肝素鈉抗Xa因子IU活性。4個濃度溶液的活性對數(shù)值組合計算得到最終的幾何平均值，同時計算可信限度?？筙a因子用IU/mg表示，按干品計。兩人結(jié)果的相對平均偏差不得超過2.0%。二、EP方法 抗FXa因子和抗Fa因子活性檢測：（2人檢測）.1.溶液的配制.1.1緩沖液的制備.1.1.1三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩沖液(p

8、H 7.4)：溶解三羥甲基氨基甲烷6.08g和氯化鈉8.77g于純化水500ml中，加牛血清蛋白10g。用鹽酸（取濃鹽酸85 ml用蒸餾水稀釋到1000 ml，以下所用鹽酸無特殊要求外，指此濃度鹽酸）調(diào)節(jié)pH至7.4，用純化水稀釋到1000 ml。.1.1.2 三羥甲基氨基甲烷-EDTA緩沖液(pH 8.4)： 溶解氯化鈉5.12g和三羥甲基氨基甲烷3.03g和EDTA二鈉1.4g于純化水250ml中。用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.4，用純化水稀釋到500 ml。.1.2顯色底物的制備：.1.2.1顯色底物R1(N-芐氧基羰基-D-精氨酰基-L-甘氨?；?L-精氨酸-4-硝基苯胺的二氫氯化物)：顯色底物

9、S-2765：用水溶解顯色底物成3mmol/L的溶液。臨用前用三羥甲基氨基甲烷-EDTA緩沖液(pH 8.4)稀釋成0.5mmol/L的溶液。.1.2.2顯色底物R2(D-苯基丙氨?；?pipecolyl-L-精氨酸-4-硝基苯胺的二氫氯化物水溶液)：顯色底物S-2238：用水溶解顯色底物成3mmol/L的溶液。臨用前用三羥甲基氨基甲烷-EDTA緩沖液(pH 8.4)稀釋成0.5mmol/L的溶液。.1.3牛Xa因子參照液的制備：Xa因子溶液：取Xa因子1瓶，加pH7.4緩沖液10ml溶解并稀釋。.1.4 Antithrombin(抗凝血酶)：用三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩沖液(pH 7.4)配

10、制成含5IU/ml的溶液，在28下保存。.1.5 Thrombin：用pH7.4緩沖液稀釋至5IU/ml，28下保存。.1.6抗凝血酶 R1參照標(biāo)準(zhǔn)品的制備：用三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩沖液(pH 7.4)配制成含1IU/ml的溶液。.1.7抗凝血酶R2參照標(biāo)準(zhǔn)品的制備：用三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩沖液(pH 7.4)配制成含0.5IU/ml的溶液。.1.8 30%乙酸：量取冰乙酸30ml于100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻即得。.2. 抗FXa因子活性檢測：（抗FXa因子活性90IU/mg125IU/mg）.2.1反應(yīng)原理w 低分子肝素（LMWH）+抗凝血酶（AT過量）低分子肝素抗凝血

11、酶的復(fù)合物（LMWH-AT）w 低分子肝素抗凝血酶復(fù)合物（LMWH-AT）+FXa (FXa過量) LMWHATFXa +FXa(剩余) w 顯色底物R1（S-2765）肽（peptide）+PNAw PNA在405nm處有吸收特性。.2.2檢測.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)液的配制根據(jù)原標(biāo)準(zhǔn)液的抗Xa因子的濃度（104IU/安瓿），加超純水1ml配成約含104IU/ml貯備液，使用之前用pH7.4的緩沖液稀釋成最大濃度0.18IU/ml、劑間比為0.75的四個濃度的對照液，分別記為S1、S2、S3和S4。稀釋方法：取104IU/ml標(biāo)準(zhǔn)液0.0962ml于25ml容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，得0.400

12、IU/ml標(biāo)準(zhǔn)液。0.400IU/ml0.180IU/ml0.180IU/mlIU/ml0.180IU/ml0.101IU/ml0.180IU/ml0.076IU/ml.2.2.2樣品溶液的配制： 首先估測樣品的抗FXa因子含量（IU/mg），根據(jù)估測樣品的抗FXa因子含量將樣品用用pH7.4的緩沖液稀釋成與標(biāo)準(zhǔn)溶液相一致的四個濃度的檢測液，分別記為T1、T2、T3和T4。稀釋方法：將樣品稀釋為50IU/ml，取此溶液1.0ml于25ml容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，得2.00IU/ml樣品液。2.00IU/ml0.180IU/ml0.180IU/mlIU/ml0.180IU/ml0.101I

13、U/ml0.180IU/ml0.076IU/ml.2.2.3準(zhǔn)備18支試管，T1、T2、T3和T4表示為檢測樣品，S1、S2、S3 和S4表示參照品，A01、A02作為空白，按A01，S1，S2，S3，S4，T1，T2，T3，T4， T1、T2、T3，T4，S1，S2，S3，S4，A02的順序每支管中加入抗凝血酶 R1參照品溶液50l，分別加入檢測樣品液或參照品液或三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩沖液(pH 7.4)（檢測空白）50l，用相同方法檢測空白開始時和結(jié)束時的吸收度，兩次空白檢測的吸光度相差不超過0.05。每一支加完后，混合但不能產(chǎn)生氣泡。.2.2.4在370.2下保溫1min，每支管加入

14、牛抗Xa R參照品液100l，保溫1min，加入顯色底物R1250l。在370.2準(zhǔn)確保溫4min，最后加入30%乙酸溶液375l。.2.2.5移取反應(yīng)混合液至半微量比色皿在405nm處以30%的乙酸溶液為參比，用紫外可見分光光度計檢測吸收度，A01與A02的吸光度不得有顯著差異，應(yīng)在1小時內(nèi)檢測。.2.2.6結(jié)果計算：使用中國藥典生物檢定統(tǒng)計程序BS2000軟件計算得出樣品的抗Xa因子含量。平均可信限率 FL %應(yīng)小于 15%。.3抗Fa因子活性檢測：.3.1檢測抗Fa反應(yīng)原理w 低分子肝素（LMWH）+抗凝血酶（AT過量）低分子肝素抗凝血酶的復(fù)合物（LMWH-AT）w 低分子肝素抗凝血酶復(fù)

15、合物（LMWH-AT）+Fa (Fa過量) LMWHATFa +Fa (剩余)w 顯色底物R2（S-2238）肽（peptide）+PNAw PNA在405nm處有光吸收特性。.3.2檢測.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)液的配制根據(jù)原標(biāo)準(zhǔn)液的抗IIa因子的濃度（31IU/安瓶），加超純水1ml配成約含31IU/ml貯備液，使用之前用pH 7.4的緩沖液稀釋成0.070IU/ml、0.042IU/ml、0.025IU/ml 、0.015IU/ml四個濃度的對照液，分別記為S1、S2、S3和S4。稀釋方法：取31IU/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0962ml于25ml容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，得0.119IU/ml標(biāo)準(zhǔn)

16、液。0.119IU/ml0.070IU/ml0.070IU/ml0.042IU/ml0.070IU/ml0.025IU/ml 0.070IU/ml0.015IU/ml.3.2.2樣品溶液的配制：首先估測樣品的抗FIIa因子含量（IU/mg），根據(jù)估測樣品的抗FIIa因子含量將樣品用pH 7.4的緩沖液稀釋成相應(yīng)抗FIIa四個濃度的檢測液，分別記為T1、T2、T3和T4。稀釋方法：將樣品溶液稀釋為13.5IU/ml，取此溶液1.0ml于25ml容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，得0.54IU/ml樣品液。0.54IU/ml0.07IU/ml0.070IU/ml0.042IU/ml 0.070IU/m

17、l0.025IU/ml 0.070IU/ml0.015IU/ml .3.2.3準(zhǔn)備18支試管，T1、T2、T3和T4表示為檢測樣品，S1、S2、S3 和S4表示參照品，A01、A02作為空白，按A01，S1，S2，S3，S4，T1，T2，T3，T4， T1、T2、T3，T4，S1，S2，S3，S4，A02的順序，每支管中加入抗凝血酶R2參照品溶液50l，分別加入檢測樣品液或參照品液或三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩沖液(pH 7.4)（檢測空白）50l，用相同方法檢測空白開始時和結(jié)束時的吸收度，兩次空白檢測的吸光度相差不超過0.05。每一支加完后，混合但不能產(chǎn)生氣泡。.3.2.4在370.2下保溫1min，每支管加入人凝血酶 R參照品液10