抗體酶的催化原理技術(shù)方法研究進(jìn)展及應(yīng)用 的研究

1、蛋白質(zhì)與酶工程課程論文抗體酶的催化原理、技術(shù)方法、研究進(jìn)展及應(yīng)用的研究姓 名：閆 雨專 業(yè)：生物科學(xué)學(xué) 號：20104083040日 期：2013年5月摘要：催化抗體也叫抗體酶，是具有催化活性的免疫球蛋白.由于它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性，因而催化抗體制備技術(shù)的開發(fā)預(yù)示著可以人為生產(chǎn)適應(yīng)各種用途的，特別是自然界不存在的高效催化劑，對生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)等多種學(xué)科有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值.綜述了催化抗體研究的最新進(jìn)展，討論了該領(lǐng)域目前存在的問題，提出了解決這些問題的可能辦法。關(guān)鍵詞：抗體酶；催化原理;技術(shù)方法;研究進(jìn)展;應(yīng)用緒論抗體酶抗體酶(abzyme)，又稱催化抗體(cat

2、3;alytic antibody)，是指通過一系列化學(xué)與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學(xué)性質(zhì)，還類似于酶，能催化某種活性反應(yīng)?？贵w與酶相似，它們都是蛋白質(zhì)分子酶與底物的結(jié)合及抗體與抗原的結(jié)合都是高度專一性的，但這兩種結(jié)合的基本區(qū)別在于酶與高能態(tài)的過渡態(tài)分子相結(jié)合，而抗體則與抗原(基態(tài)分子)相結(jié)合。抗體與天然酶相比，最大的優(yōu)點(diǎn)在于抗體的種類是巨大的，免疫系統(tǒng)可以擁有10 種抗原特異性不同的抗體分子。制備成功的抗體酶不但能催化一些天然酶能催化的反應(yīng)，而且還能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)。1抗體酶 1.1抗體酶的發(fā)現(xiàn) 早在l948年，美國斯坦福大學(xué)榮譽(yù)退休化學(xué)教授l_波

3、林(LinusPaulin'f)就提出過渡態(tài)理論(transition state theory) 2。這一理論認(rèn)為，酶之所以具有催化能力，是因?yàn)樗c反應(yīng)分子(底物)的牢固結(jié)合的方式，有利于反應(yīng)中的過渡態(tài)(transition state)的結(jié)構(gòu)。而這種結(jié)構(gòu)會(huì)迅速重新排列成該反應(yīng)的產(chǎn)物。任何有利于過渡態(tài)，而不是其它可能的結(jié)構(gòu)的因素，都能加快化學(xué)反應(yīng)速度。1 969年，布蘭戴斯大學(xué)生物化學(xué)家w ·詹克斯(w ·Jenks)進(jìn)一步發(fā)展了這一理論。他和幾位美國科學(xué)家認(rèn)為，如果波林的觀點(diǎn)是正確的話，那么利用某一反應(yīng)過渡態(tài)的模擬物作為免疫原，則會(huì)得到催化該反應(yīng)的抗體。這種抗體

4、能特異地識(shí)別化學(xué)反應(yīng)的過渡態(tài)，并利用其結(jié)合能降低反應(yīng)的活化能。那么，適當(dāng)?shù)目贵w也就能夠以一種方式與真正的酶反應(yīng)物結(jié)合成為“酶家族”中新成員，去催化正常情況下由酶來完成的化學(xué)反應(yīng)。1986年以后，抗體酶研究進(jìn)入一個(gè)新的階段。這一年的12月，RALerner和PGSChutz兩個(gè)小組同時(shí)在科學(xué)(Science)雜志上報(bào)道，他們已成功地得到了具有酶活性的抗體酶。SChutz等人認(rèn)為對硝基苯酚磷酸膽堿酯（PNPPC）作為相應(yīng)羧酸二酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)類似物，推測用這個(gè)類似物作為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的單克隆抗體可能對羧酸二酯的水解反應(yīng)有催化活性。通過對單克隆抗體的篩選，找到了一株MOPC167單抗，后來又找到一

5、株抗體酶T15,經(jīng)證明該催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)行為滿足米氏方程。3 Lerner等人，從金屬肽酶的研究成果中得到啟發(fā)，合成了一個(gè)含有吡啶甲酸的膦酸酯類似物為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)單抗6D4，用來催化不含吡啶甲酸的相應(yīng)羧酸酯化合物的水解反應(yīng)，使反應(yīng)加速近1000倍，并表現(xiàn)出底物專一性和對介質(zhì)pH的依賴性等。4 1.2抗體酶的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 抗體酶主要來自IgG抗體分子5。對抗體結(jié)構(gòu)分析表明IgG分子s是由兩條相同的重鏈及兩條相同的輕鏈靠二硫鍵連接而成。木瓜蛋白酶作用抗體后，產(chǎn)生三個(gè)片斷，其中相同的二個(gè)片斷為抗原結(jié)合片斷(Fab)；在抗原結(jié)合片斷中與抗原結(jié)合的部位，是“高度可變區(qū)”(Fv)，該部位廣泛的結(jié)構(gòu)

6、及順序變化決定了抗體對外來物質(zhì)的識(shí)別特性，其中電荷互補(bǔ)及立體互補(bǔ)是其分子識(shí)別的主要特征。2抗體酶催化原理 抗體酶能催化酯水解反應(yīng)，OxyCope重排反應(yīng)，還原反應(yīng)，環(huán)氧化及氧化物開環(huán)反應(yīng)， DielsAlder反應(yīng)，Claisen重排反應(yīng)。6 而在抗體催化的反應(yīng)中，研究最廣泛的是酯水解反應(yīng)，所以在這里只介紹一下酯水解反應(yīng)的原理。酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)是帶負(fù)電荷的四面體結(jié)構(gòu)。以MOPCI67催化碳酸脂水解為例說明。首先通過化學(xué)合成過渡態(tài)磷酸脂的類似物硝基苯磷酰膽堿脂，利用過渡態(tài)類似物作為半抗原，并將其與牛血清蛋白偶合，制成抗原注入動(dòng)物體內(nèi)，動(dòng)物體的血液中就會(huì)產(chǎn)生可以和過渡態(tài)碳酸脂特異性結(jié)合的抗體MO

7、PCl67，然后采用單克隆技術(shù)分離純化出MOPCI67。在抗體催化碳酸脂反應(yīng)中，MOPCI67和過渡態(tài)碳酸脂結(jié)合后，提高了反應(yīng)物過渡態(tài)的穩(wěn)定性，降低了反應(yīng)的活化能，從而加速了水解反應(yīng)的進(jìn)程。該反應(yīng)的產(chǎn)物生成速度常數(shù)l(c 達(dá)到了(o40±004)/min，米氏常數(shù)Km為208±431molL。) 3抗體酶技術(shù)方法 抗體酶與其催化的活性化合物之間具有結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的性質(zhì)，即酶分子與“反應(yīng)過渡態(tài)”化合物互補(bǔ)，從分子識(shí)別角度來看，這種互補(bǔ)關(guān)系類似于抗體抗原間的互補(bǔ)作用?？贵w酶最初的產(chǎn)生手段是按以下步驟進(jìn)行的：首先合成穩(wěn)定的反應(yīng)過渡態(tài)類似物，將此化合物做為半抗原與載體蛋白相連，免疫動(dòng)物制

8、備單克隆抗體，由它誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，可以按預(yù)定方向取得催化活性。該方法中最重要的是半抗原的分子設(shè)計(jì)和合成。近年來，抗體酶的產(chǎn)生途徑又有新的進(jìn)展。主要有以下途徑和方法： 3.1 直接引入天然或合成的催化基團(tuán)7 化學(xué)誘變法一將合成的或天然的具有催化活性的基團(tuán)通過化學(xué)修飾法引入分子中；蛋白質(zhì)工程技術(shù)一通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)使抗體結(jié)合部位的氨基酸殘基產(chǎn)生定向改變，既可以直接產(chǎn)生酶活性。也可以對初步具有酶活性的抗體進(jìn)行進(jìn)一步改造，構(gòu)建高活性體。 3.2 基因工程技術(shù)由免疫學(xué)可知對獨(dú)特的分子抗原，動(dòng)物可有510000個(gè)不同的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而通過細(xì)胞融合產(chǎn)生的單克隆抗體一般只有上百個(gè)。因此重組抗體分子在細(xì)菌Ec

9、oli中的表達(dá)，可以提供抗體庫。基因工程抗體庫得到的抗體數(shù)量比免疫技術(shù)得到的抗體要高幾個(gè)數(shù)量級。但該方法中篩選抗體的技術(shù)還需進(jìn)一步完善。 3.3 相似分子誘導(dǎo)法在反應(yīng)過渡態(tài)類似物難以合成的條件下，采用化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的舒子如酶的抑制劑分子做半抗原，也可篩選到抗體酶因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)對一個(gè)半抗原可以產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)大致相同但卻存在細(xì)微差別的抗體，因此用含有與半抗原類似結(jié)旬的化臺(tái)物篩選單克隆抗體也會(huì)找到所需要的有特殊識(shí)別功能及催化作用的抗體酶。 3.4 共價(jià)抗原免疫法這是在親和標(biāo)記抑制劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的抗體酶制備方法。如果以親和標(biāo)記劑為半抗原，則抗體結(jié)合部位將產(chǎn)生與親和基團(tuán)電荷性質(zhì)相反的基團(tuán)，如親核性、親電

10、性氨基酸，酸性氨基酸、堿性氯基酸等。該途徑適用于產(chǎn)生一些晤性部位中含有上述氨基酸的酶。 3.5 細(xì)胞融合法8 其過程如下：要得到一特定抗原的抗體，如果抗原是小分子，必須將其和載體蛋白相聯(lián)。然后對此抗原進(jìn)行免疫，使宿主有機(jī)體針對抗原產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞相融合。融合得到的雜交細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能在體外培養(yǎng)。通過選擇培養(yǎng)，雜交細(xì)胞得以存留。將雜交體克隆化，即繁殖成母體的同一細(xì)胞或分離成菌落。這些菌落能產(chǎn)生單一均勻的抗體。對這些菌落用酶聯(lián)免疫吸收試驗(yàn)加以篩選，以評價(jià)其選擇性結(jié)合抗原的能力。然后把抗原結(jié)合到一種固體支撐物上，再加入含有抗體的介質(zhì)，這樣抗原一抗體復(fù)合物隨即形成，經(jīng)過提純就得

11、到ABAG復(fù)合物。4抗體酶的研究進(jìn)展 4.1抗體酶在有機(jī)合成中的應(yīng)用 迄今為止, 科學(xué)家們已成功開發(fā)出能催化所有6種類型的酶促反應(yīng)和幾十種類型的化學(xué)反應(yīng)的抗體酶?？贵w原先催化的反應(yīng)范圍也由于重新設(shè)計(jì)半抗原而擴(kuò)大,催化效率也因此而得到改善。 4.2 抗體酶在醫(yī)療方面的應(yīng)用 （1） 抗體酶在幫助戒毒方面的應(yīng)用 吸毒是一個(gè)困繞著很多國家的難題,尤其是吸毒上癮后很難戒掉,直接拮抗可卡因上癮的抗體至今還沒有找到。一個(gè)替換的方法是阻斷可卡因、鴉片和受體的結(jié)合。雖說抗鴉片的抗體能有效拮抗注射海洛因上癮的猴子,然而由于抗體和抗原形成復(fù)合物后不能再生,必須使用高劑量的抗體使這一應(yīng)用受到限制?？贵w酶則不一樣,不但

12、能和抗原結(jié)合,而且能使抗原水解而再生,這不但能減少抗體酶的用量,也能減少抗體酶的免疫原性。因此比其它抗體臨床應(yīng)用前景更好。Landry 等用可卡因水解的過渡態(tài)類似物- 磷酸單酯為半抗原,產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解,其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰膽堿酯酶差不多,水解后的可卡因片斷失去了可卡因刺激功能。因此,用人工抗體酶的被動(dòng)免疫也許能阻斷可卡因上癮,達(dá)到戒毒目的。圖注：過濾太類似物（2） 抗體酶用于腫瘤治療 腫瘤病人化療遇到的最大問題是藥物選擇性差而導(dǎo)致高毒性及藥物半衰期短和對腫瘤浸潤性差,因此達(dá)到腫瘤細(xì)胞表面的藥物濃度很低。目前正在發(fā)展一種稱為抗體介導(dǎo)前藥治療 (ADEPT)技術(shù),

13、即將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián),這樣酶就會(huì)通過和腫瘤結(jié)合的抗體而存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后,當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近,抗體酶就會(huì)將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物,從而提高腫瘤細(xì)胞局部藥物濃度, 增強(qiáng)對腫瘤的殺傷力, 達(dá)到提高腫瘤化療效果的目的。當(dāng)然前藥只能被抗體酶水解而不能被內(nèi)源性酶水解,抗原還要盡量減少免疫原性。5抗體酶的應(yīng)用前景 5.1抗體酶的應(yīng)用(一)在有機(jī)合成領(lǐng)域的應(yīng)用目前，已成功篩選出可催化6種類型酶促反應(yīng)和幾十種化學(xué)反應(yīng)的抗體酶，可催化許多困難和能量不利的反應(yīng)催化類型包括底物異構(gòu)化反應(yīng)、酯水解、酰胺水解、?；D(zhuǎn)移、Claisen重排反應(yīng)、光誘導(dǎo)反

14、應(yīng)、氧化還原、金屬螯合、環(huán)化反應(yīng)等，抗體酶還可以作為手性助劑控制光加成反應(yīng)產(chǎn)物的立體化學(xué)，用于手性化合物的拆分，還可用于探索化學(xué)反應(yīng)機(jī)制(二)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用利用抗體酶催化藥物在體內(nèi)的還原，有利于機(jī)體對藥物的吸收，并降低藥品的毒副作用；將抗體酶技術(shù)和蛋白質(zhì)融合技術(shù)結(jié)合在一起，設(shè)計(jì)出既有催化功能又有組織特異性的嵌合抗體，用于切割惡性腫瘤；將抗體酶直接作為藥物，以治療酶缺陷癥患者¨(三)在戒毒領(lǐng)域的應(yīng)用抗體酶可以拮抗可卡因等麻醉劑的成癮性，使可卡因失去刺激功能，以幫助癮君子戒除毒癮抗體酶還可以水解清除血液中的毒素，如分解可卡因、有機(jī)磷毒劑等(四)在前藥設(shè)計(jì)中的應(yīng)用9 前藥(prodrug

15、)是指為降低藥物毒性而設(shè)計(jì)的一類自身無活性或活性較低，需在體內(nèi)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化為活性藥物以發(fā)揮作用的化合物抗體酶在正在發(fā)展的ADEPT體系中成功地對前藥進(jìn)行活化，提高了腫瘤治療的選擇性，顯示出很好的應(yīng)用前景10ADEPT 體系，即抗體靶向的酶前藥治療(antibody directed enzyme prodrug therapy ADEPT )體系將能催化前藥轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞毒劑的酶，與腫瘤細(xì)胞專性抗體相偶聯(lián)，酶通過與腫瘤抗體的結(jié)合而存在于腫瘤細(xì)胞表面，當(dāng)前藥擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞表面或附近時(shí)，抗體酶就會(huì)將前藥迅速水解，釋放出抗腫瘤藥物這樣大大提高了腫瘤細(xì)胞附近局部藥物的濃度，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷力，減少對

16、正常細(xì)胞的殺傷作用11經(jīng)過科學(xué)家們的不斷努力，抗體酶在ADEPT 體系中的應(yīng)用將日益完善，有可能成為癌癥化療的重要武器。 5.2.前景抗體酶的研究是當(dāng)今科學(xué)前沿多學(xué)科研究的交匯點(diǎn)，吸引著合成化學(xué)家、生物學(xué)家、免疫學(xué)家、化學(xué)動(dòng)力學(xué)家、催化學(xué)家的格外關(guān)注。它突破了傳統(tǒng)的束縛、大分子、配位化合物等模擬酶的框框，開辟了嶄新的模擬酶研究的方向，開辟了催化劑研究的新領(lǐng)域，無論是在理論探索方面或是實(shí)踐應(yīng)用方面，都具有極其廣闊的前景。它將在醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)、制藥學(xué)等諸多學(xué)科中發(fā)揮重要的作用。(1)可以使不可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)變?yōu)榭赡堋?2)可以使苛刻條件下的化學(xué)反應(yīng)在溫和條件下實(shí)現(xiàn)。(3)可以選擇性地

17、催化平行反應(yīng)中的某一反應(yīng)，從而大大增加產(chǎn)品的產(chǎn)率。它可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)化學(xué)家夢寐以求的不對稱合成，只催化生成某一光學(xué)異構(gòu)體的反應(yīng)，使原料的利用率大大提高。(4)在不久的將來，有可能研究成功蛋白質(zhì)氨基酸序列快速分析的抗體酶，從而大大簡化和加速蛋白質(zhì)氨基酸序列的測定。(5)病毒蛋白在水解過程中的過渡態(tài)相似物誘發(fā)的抗體酶，可作為醫(yī)學(xué)上的接種疫苗。(6)指導(dǎo)未知酶的尋找。有些反應(yīng)，如Cope重排和Dids- Alter反應(yīng)，明明知道是酶催化的，但時(shí)至今日，人們對催化上述反應(yīng)的酶仍一無所知，對這些反應(yīng)的抗體酶的結(jié)構(gòu)和功能的研究無疑會(huì)對未知酶的尋找提供方向性的提示。(7)通過對抗體酶的研究，對其過渡態(tài)相似物結(jié)構(gòu)

18、的研究，無疑對確定基元反應(yīng)的過渡態(tài)提供十分有用的信息，為確定化學(xué)反應(yīng)機(jī)理提供依據(jù)。12 短短的10來年，抗體酶的研究獲得了迅猛的發(fā)展，取得了長足的進(jìn)步。人們常常感嘆裁縫手藝的精巧絕倫，而現(xiàn)今，科學(xué)家正在使動(dòng)物的免疫系統(tǒng)成為制造催化劑的“高級裁縫”，使它根據(jù)過渡態(tài)相似物的幾何形狀、電性結(jié)構(gòu)、酸堿性質(zhì)等“量體裁衣式”地制造抗體酶，使科學(xué)邁向催化劑制備的自由王國，這將使人類朝實(shí)現(xiàn)控制化學(xué)反應(yīng)的目標(biāo)不斷逼近?？偨Y(jié) 目前，抗體酶研制和應(yīng)用的許多歷程還不清楚，從而無法設(shè)計(jì)過渡態(tài)穩(wěn)定類似物。而在反應(yīng)歷程中，抗體酶的方法又將在其中發(fā)揮重要作用，可以通過構(gòu)制預(yù)期的抗體酶來驗(yàn)證反應(yīng)歷程，使理論上的歷程更接近實(shí)際。

19、 未來對抗體酶的研究重點(diǎn)是： 1通過制定催化活性實(shí)現(xiàn)對特定化學(xué)反應(yīng)的催化，實(shí)現(xiàn)對那些不能用天然酶催化的反應(yīng)的催化； 2抗體酶體內(nèi)治療作用的拓展； 3抗體酶生產(chǎn)庫以及生產(chǎn)技術(shù)的研究，使抗體酶能降低成本，實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。隨著蛋白質(zhì)工程，基因工程，免疫學(xué)等生物技術(shù)的不斷發(fā)展，抗體酶的研究將會(huì)有更大的突破和廣泛的應(yīng)用前景。 總之，抗體酶是化學(xué)和生物學(xué)的研究成果在分子水平交叉滲透的產(chǎn)物，是抗體的多樣性和酶分子的巨大催化能力結(jié)合在一起的一種新策略。雖然抗體酶的研究存在很多不足之處，但我們相信通過多學(xué)科的交叉協(xié)作，隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展和酶的作用機(jī)制的闡明，抗體酶的研究必將達(dá)到一個(gè)新的水平，一定會(huì)結(jié)出更加令人振奮的成果。 參考文獻(xiàn)1張江麗，廊坊師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版.2009,9(2).-65-67 抗體酶研究的進(jìn)展洪維劍，