分子生物學(xué)-第5章 基因的表達(dá)與調(diào)控(上)dd

1、第六章 基因的表達(dá)與調(diào)控(上)原核基因表達(dá)調(diào)控模式自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在每30分鐘增殖一次的109細(xì)菌群體中，若一個(gè)細(xì)菌變成29.5分鐘增殖，經(jīng)過80天的連續(xù)生長后，這個(gè)群體中的99.9%都將具有29.5分鐘增殖一倍的生長速度。原核生物細(xì)胞的基因和蛋白質(zhì)種類較少，如大腸桿菌基因組約為4.20106bp共有4 288個(gè)開放讀碼框（表6-1）。據(jù)估計(jì)，一個(gè)細(xì)胞中總共含有107個(gè)蛋白質(zhì)分子。表6-1 大腸桿菌、傷寒桿菌和尿殖道支原體基因組中的基因總量比較與功能分析基 因 數(shù)大腸桿菌傷寒桿菌尿殖道支原體總讀碼框數(shù)氨基酸合成分類輔基等的合成核苷酸合成細(xì)胞膜合成與裝配能量代謝其它合成代謝脂

2、肪代謝DNA復(fù)制、重組和修復(fù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯吸收與運(yùn)轉(zhuǎn)4288131103582372431884811591785518242717276854538411230258766427141123470151917316632771210134每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞有約15 000個(gè)核糖體，50種核糖體蛋白、糖酵解體系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代謝過程中必需的，其合成速率不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響，這一類蛋白質(zhì)被稱為永久型（constitutive）合成的蛋白質(zhì)。另一類則被稱為適應(yīng)型或調(diào)節(jié)型（adaptive or regulated），因?yàn)檫@類蛋白質(zhì)的合成速率明顯地受環(huán)境的影

3、響而改變。如大腸桿菌細(xì)胞中一般只有15個(gè)-半乳糖苷酶，但若將細(xì)胞培養(yǎng)在只含乳糖的培養(yǎng)基中，每細(xì)胞中這個(gè)酶的量可高達(dá)幾萬個(gè)分子。6. 1 原核基因表達(dá)調(diào)控總論隨著生物個(gè)體的發(fā)育，DNA分子能有序地將其所承載的遺傳信息，通過密碼子-反密碼子系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)，執(zhí)行各種生理生化功能。科學(xué)家把從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)（geneexpression），對這個(gè)過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控（gene regulation或genecontrol）。圖6-1基因表達(dá)的第一步是由RNA聚合酶拷貝DNA雙鏈中的模板鏈，生成與該序列完全互補(bǔ)的RNA鏈?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方面：轉(zhuǎn) 錄 水 平 上 的

4、 調(diào) 控 （ transcriptionalregulation）；轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptionalregulation），包括（1）mRNA加工成熟水平調(diào)控（differentialprocessing of RNA transcript）；（2）翻譯水平調(diào)控（differential translationof mRNA）。細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程幾乎發(fā)生在同一時(shí)間間隔內(nèi)，轉(zhuǎn)錄與翻譯相耦聯(lián)（coupled transcription andtranslation）。真核生物中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primary transcript）只有從核內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)到核外，才能被核糖體翻譯成蛋

5、白質(zhì)（圖6-2）。原核生物的基因調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因 的 產(chǎn) 物 是 阻 遏 蛋 白（repressor），阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)其作用特征又分為負(fù)控誘導(dǎo)和負(fù)控阻遏二大類。在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。阻遏蛋白作用于操縱區(qū)。在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。根據(jù)其作用特性分為正控誘導(dǎo)系統(tǒng)和正控阻遏系統(tǒng)。在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子的存在使激活

6、蛋白處于非活性狀態(tài)（圖6-3，表6-2）。圖6-3 細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控體系。a. 負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)；b. 正控誘導(dǎo)系統(tǒng)；c. 負(fù)控阻遏系統(tǒng)；d. 正控阻遏系統(tǒng)。因子在結(jié)構(gòu)上具有同源性，所以統(tǒng)稱70家族，含有4個(gè)保守區(qū)（圖6-4），其中第2個(gè)和第4個(gè)保守區(qū)參與結(jié)合啟動(dòng)區(qū)DNA，第2個(gè)保守區(qū)的另一部分還參與雙鏈DNA解開成單鏈的過程。圖6-4 大腸桿菌中的因子（以70為例）主要包括四個(gè)結(jié)構(gòu)域。54因子識別并與DNA上的-24和-12區(qū)相結(jié)合（圖6-5）。70因子只有在核心酶結(jié)合到DNA鏈上之后才能與啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合，而54則類似于真核生物的TATA區(qū)結(jié)合蛋白（TBP），可以在無核心酶時(shí)獨(dú)立結(jié)合到啟動(dòng)子上。

7、圖6-5 70 （上）和54 （下） 因子識別并結(jié) 合在所調(diào)控基因上游的不同區(qū)域。6. 2 乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)大 腸 桿 菌 乳 糖 操 縱 子 （ lactoseoperon）包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動(dòng)子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是在啟動(dòng)區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。3個(gè)結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶。-半乳糖苷酶是一種-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的-半乳糖苷透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移

8、酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。6. 2. 1 酶的誘導(dǎo)lac體系受調(diào)控的證據(jù)一般情況下，lac+基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個(gè)細(xì)胞只有12個(gè)酶分子。但是，在乳糖培養(yǎng)基上酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，超過105個(gè)酶分子/細(xì)胞。在無葡萄糖有乳糖的培養(yǎng)基中，lac+細(xì)菌中將同時(shí)合成-半乳糖苷酶和透過酶。用32P標(biāo)記的mRNA與模板DNA進(jìn)行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖12分鐘后，編碼-半乳糖苷酶和透過酶的lac mRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降。實(shí)驗(yàn)室常用兩種乳糖類似物異丙基巰基半乳糖苷（I

9、PTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發(fā)色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因?yàn)樗鼈兌疾皇前肴樘擒彰傅牡孜铮杂?稱 為 安 慰 性 誘 導(dǎo) 物 （ gratuitousinducer）。用35S標(biāo)記大腸桿菌細(xì)胞（培養(yǎng)基中沒有半乳糖），將這些帶有放射性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S的培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)物后-半乳糖苷酶便開始合成。分離純化-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無35S標(biāo)記，說明這種酶是加入誘導(dǎo)物后新合成的。6. 2. 2 操縱子模型及其影響因子Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時(shí)稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個(gè)基因調(diào)控問題，而且可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，他們通過大量實(shí)驗(yàn)及分析，建立了現(xiàn)在已經(jīng)

10、被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。圖6-9 Lac操縱子的調(diào)控模式。A. Z、Y、A基因產(chǎn)物由同一條多順反子mRNA分子所編碼。B. 該mRNA分子的啟動(dòng)區(qū)（P）位于阻遏基因（I）與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨(dú)起始半乳糖苷酶和透過酶基因的高效表達(dá)。C. 操縱區(qū)是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。D. 當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合時(shí)，lac mRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。E. 誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變其三維構(gòu)象，使之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，誘發(fā)lac mRNA的合成。圖6-10 培養(yǎng)基中有無誘導(dǎo)物對LacmRNA及-半乳糖苷酶活性的影響阻遏物lac I基因產(chǎn)物及功能lac操縱子

11、阻遏物mRNA是由弱啟動(dòng)子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基均含有347個(gè)氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結(jié)合,每個(gè)細(xì)胞中有510個(gè)阻遏物分子。-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果將葡萄糖和乳糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā)lac操縱子（圖6-11）。某大腸桿菌突變體，它不能將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為下一步代謝中間物，該細(xì)菌的lac基因能在葡萄糖存在時(shí)被誘導(dǎo)合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解產(chǎn)物抑制lac mRNA的合成，科學(xué)上把葡萄糖的這種效應(yīng)稱之為代謝物阻遏效應(yīng)（catabolite repression）。cAM

12、P與代謝物激活蛋白cAMP是在腺苷酸環(huán)化酶的作用下由ATP轉(zhuǎn)變而來的，在真核生物的激素調(diào)節(jié)過程中也起著十分重要的作用。將細(xì)菌放在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，cAMP的濃度就低；如果培養(yǎng)基中只有甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度就會很高。大腸桿菌中的代謝物激活蛋白，由Crp基因編碼，能與cAMP形成復(fù)合物。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP是一個(gè)不同于阻遏物的正調(diào)控因子，而lac操縱子的功能是在這兩個(gè)相互獨(dú)立的調(diào)控體系作用下實(shí)現(xiàn)的。圖6-13 gal，lac 和ara操縱子上游啟動(dòng)子區(qū)與CRP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)的相對位置分析半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、山

13、梨醇等在降解過程中均轉(zhuǎn)化成葡萄糖或糖酵解途徑中的其他中間產(chǎn)物，這些糖代謝中有關(guān)的酶都是由可誘導(dǎo)操縱子控制的，被稱為降解物 敏 感 型 操 縱 子 (catabolitesensitive operon），由cAMP-CRP調(diào)控。圖6-14 大腸桿菌lac操縱子啟動(dòng)區(qū)CRP-cAMP及-35區(qū)，-10區(qū)序列分析。cAMP-CRP復(fù)合物與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合是lac mRNA合成起始所必需的，因?yàn)檫@個(gè)復(fù)合物結(jié)合于啟動(dòng)子上游，能使DNA雙螺旋發(fā)生彎曲，有利于形成穩(wěn)定的開放型啟動(dòng)子-RNA聚合酶結(jié)構(gòu)。阻遏物則是一個(gè)抗解鏈蛋白，阻止形成開放結(jié)構(gòu)，從而抑制RNA聚合酶的功能。圖 6-15CRP-cAMP 與上

14、游 DNA位點(diǎn)結(jié)合后造成模板 DNA 沿對稱序列中央發(fā)生90的彎曲6. 2. 3 lac操縱子的調(diào)控區(qū)域P、O區(qū)P區(qū)（即啟動(dòng)子區(qū)）一般是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游5-10bp，而O區(qū)（即阻遏物結(jié)合區(qū)）位于-7+28位，該區(qū)的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對。圖6-16 不同操縱子啟動(dòng)區(qū)及O區(qū)相對位置的比較。6. 2. 4 lac操縱子中的其他問題1、lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較在完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中，-半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1：0.5：0.2，這個(gè)比例在一定程度上反映了以-半乳糖苷作為唯一碳源時(shí)細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)

15、節(jié)所致。lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。因此，存在著從mRNA的5末端到3末端的蛋白質(zhì)合成梯度。在lac mRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解，因此，在任何時(shí)候Z基因的完整拷貝數(shù)要比A基因多。2、操縱子的融合與基因工程pur操縱子在染色體上位于lac操縱子沿轉(zhuǎn)錄方向的下游，中間只隔了一個(gè)控制細(xì)胞對T6噬菌體敏感性的tsx基因。pur操縱子被“嫁接”到lac啟動(dòng)子上，形成融合基因。因?yàn)閘ac啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，通過它可以使較弱啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。6. 3 色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)trp體系參與生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CR

16、P的調(diào)控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個(gè)基因參與整個(gè)合成過程（圖6-17）。圖6-17 細(xì)菌中色氨酸生物合成途徑。trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶，trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，trpF編碼異構(gòu)酶，trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB則分別編碼色氨酸合酶的和亞基。在許多細(xì)菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分別融合成一個(gè)基因，產(chǎn)生具有雙重功能的蛋白質(zhì)。trpE基因是第一個(gè)被翻譯的基因，與trpE緊鄰的是啟動(dòng)子區(qū)和操縱區(qū)。前導(dǎo)區(qū)和弱化子區(qū)分別定名為trpL和trpa。trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠(yuǎn)。后者位于大腸桿菌染色體

17、圖上25分鐘處，而前者則位于90分鐘處。在位于65分鐘處還有一個(gè)trpS（色氨酸t(yī)RNA合成酶），它與攜帶有色氨酸的tRNATrp共同參與trp操縱子的調(diào)控作用。6. 3. 1 trp操縱子的阻遏系統(tǒng)trpR基因突變常引起trp mRNA的永久型合成，該基因產(chǎn)物因此被稱為輔阻遏蛋白（aporepressor）。除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個(gè)輔阻遏蛋白不會與操縱區(qū)結(jié)合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合并關(guān)閉trp mRNA轉(zhuǎn)錄。效應(yīng)物分子色氨酸是trp操縱子所編碼的生物合成途徑的末端終產(chǎn)物。當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時(shí)，它與游離的輔阻遏蛋白相結(jié)合，并使之與操縱區(qū)DNA緊密結(jié)

18、合；當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸供應(yīng)不足時(shí)，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區(qū)上解離，trp操縱子去阻遏。6. 3. 2 弱化子與前導(dǎo)肽1、弱化子在trp mRNA 5 端有一個(gè)長162bp的mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，其中123150位堿基序列如果缺失，trp基因表達(dá)可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個(gè)區(qū)域終止，產(chǎn)生一個(gè)僅有140個(gè)核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄。這個(gè)區(qū)域被稱為弱化子，該區(qū)mRNA可通過自我配對形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。2、前導(dǎo)肽分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，能產(chǎn)生一個(gè)含有14個(gè)氨基酸的多肽，這個(gè)假設(shè)的多肽被稱為前導(dǎo)肽。在

19、前導(dǎo)序列的第10和第11位上有相鄰的兩個(gè)色氨酸密碼子。組氨酸操縱子含有7個(gè)相鄰的組氨酸密碼子，苯丙氨酸操縱子也有7個(gè)苯丙氨酸密碼子，這些密碼子參與了操縱子中的轉(zhuǎn)錄弱化機(jī)制。3、mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定，引人注目的是其中4個(gè)分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對，有時(shí)以1-2和3-4配對，有時(shí)只以2-3方式互補(bǔ)配對。RNaseT1降解實(shí)驗(yàn)（此酶不能水解配對的RNA）表明，純化的trp前導(dǎo)序列中確有1-2和3-4的配對方式，由此定位的3-4配對區(qū)正好位于終止密碼子的識別區(qū)，當(dāng)這個(gè)區(qū)域發(fā)生破壞自我配對的堿基突變時(shí)有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行（圖6-23

20、）。4、轉(zhuǎn)錄弱化作用培養(yǎng)基中色氨酸濃度低，負(fù)載有色氨酸的tRNATrp就少，翻譯通過兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度就慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個(gè)相鄰的trp密碼子處），前導(dǎo)區(qū)2-3配對，不形成3-4配對的終止結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行。培養(yǎng)基中色氨酸濃度高，核糖體順利通過兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達(dá)2區(qū)，3-4區(qū)自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止。所以，弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。圖6-24 trp操縱子前導(dǎo)序列的變構(gòu)與轉(zhuǎn)錄的弱化。一般認(rèn)為，阻遏物從有活性向無活性的轉(zhuǎn)變速度較慢，需要有一個(gè)能更快地做出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培

21、養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)纳彼崴?。弱化子能較快地通過抗終止的方法來增加trp基因表達(dá)，迅速提高內(nèi)源色氨酸濃度。那么，為什么還要有阻遏體系呢？阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在時(shí)，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA的合成，它使這個(gè)合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟(jì)。6. 4 其他操縱子6. 4. 1 半乳糖操縱子大 腸 桿 菌 半 乳 糖 操 縱 子 （ galactoseoperon）在大腸桿菌遺傳圖上位于17分鐘處，包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：異構(gòu)酶（UDP-galactose-4-epimerase，galE），半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶（galactose transferase，galT），半乳糖激酶（galactose kin

22、ase，galK），使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。半乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因是galR，位于遺傳圖上55分鐘處。與 lac 操 縱 子 所 不 同 的 是 ， galR 與galE、T、K及操縱區(qū)O等的距離都很遠(yuǎn)，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。在galR-和galOc突變體中，E、T、K基因得到永久性表達(dá)，gal操縱子的誘導(dǎo)物主要是半乳糖。gal操縱子有兩個(gè)特點(diǎn)：它有兩個(gè)啟動(dòng)子，其mRNA可從兩個(gè)不同的起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄；它有兩個(gè)O區(qū)，一個(gè)在P區(qū)上游-67-73，另一個(gè)在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。1、cAMP-CRP對gal啟動(dòng)子的作用有些細(xì)胞株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水

23、平合成半乳糖代謝酶類（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達(dá)），在另一類細(xì)胞株中，沒有葡萄糖，gal基因不表達(dá)。在gal操縱子P-O區(qū)有兩個(gè)相距僅為5bp的啟動(dòng)子，gal操縱子可以從兩個(gè)啟動(dòng)子分別起始基因轉(zhuǎn)錄，每個(gè)啟動(dòng)子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)S1和S2。從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在無葡萄糖時(shí)才能順利進(jìn)行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CRP和較高濃度的cAMP。當(dāng)腺苷環(huán)化酶突變（cya-）或cAMP受體蛋白突變（crp-）時(shí)，gal操縱子不能從S1起始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CRP時(shí)，轉(zhuǎn)錄從S1開始；當(dāng)無cAMP-CRP時(shí)，轉(zhuǎn)錄從S2開始。2、雙啟動(dòng)子的生理功能為什么gal操縱子需要兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)呢？因

24、為半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細(xì)胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細(xì)胞壁合成的前體，細(xì)胞必須隨時(shí)合成差向異構(gòu)酶，以保證尿苷二磷酸的供應(yīng)。在沒有外源半乳糖的情況下，細(xì)胞通過半乳糖差向異構(gòu)酶（galactose epimerase，galE基因產(chǎn)物）的作用由UDP-葡萄糖合成UDPgal。如果只有S1一個(gè)啟動(dòng)子，由于這個(gè)啟動(dòng)子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)就不能合成異構(gòu)酶。如果S2是唯一的啟動(dòng)子，那么，即使有葡萄糖存在，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，能量被浪費(fèi)。6. 4. 2 阿拉伯糖操縱子araB、araA和araD基因參與阿拉伯糖

25、的降解，它們是一個(gè)基因簇，簡寫為araBAD。araB基因編碼核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶。 araE和araF負(fù)責(zé)將阿拉伯糖運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，它們位于遠(yuǎn)離這個(gè)基因簇的地方，分別編碼一個(gè)膜蛋白和一個(gè)位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的阿拉伯糖結(jié)合蛋白。araBAD具有復(fù)合啟動(dòng)子區(qū)域，兩個(gè)操縱區(qū)（O1，O2）和一個(gè)調(diào)節(jié)基因araC。在lac和gal操縱子中，阻遏蛋白只能作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，而cAMP-CRP蛋白只能是正調(diào)節(jié)因子。 AraC蛋白同時(shí)顯示正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的功能。araBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進(jìn)行的，araBAD基因

26、簇從啟動(dòng)子PBAD開始向右進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而araC基因則是從Pc向左轉(zhuǎn)錄（圖6-27）。圖6-27 ara操縱子上游調(diào)控區(qū)序列與功能分析ara操縱子也是可誘導(dǎo)的，阿拉伯糖本身就是誘導(dǎo)物。在野生型操縱子中，只有阿拉伯糖存在時(shí)才轉(zhuǎn)錄出araBADmRNA，而有葡萄糖存在時(shí)則不轉(zhuǎn)錄。腺苷酸環(huán)化酶缺陷型和crp-突變株也不形成araBAD mRNA，說明從PBAD起始的轉(zhuǎn)錄過程也需要cAMP-CRP。AraC蛋白具有PBAD活性正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的雙重功能。Pr是起阻遏作用的形式，可與類操縱區(qū)位點(diǎn)相結(jié)合，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)。沒有阿拉伯糖時(shí)，Pr形式占優(yōu)勢；一旦有阿拉伯

27、糖存在，它就能夠與AraC蛋白結(jié)合，使平衡趨向于Pi形式。a.沒有AraC蛋白時(shí)，由Pc啟動(dòng)子起始araC基因轉(zhuǎn)錄；b.葡萄糖水平較高時(shí)，AraC蛋白與操縱區(qū)O2以及ara I上半?yún)^(qū)相結(jié)合，形成DNA回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)，araBAD基因不表達(dá)；c.有阿拉伯糖但無葡萄糖存在時(shí)，AraC與阿拉伯糖相結(jié)合，變構(gòu)成為激活蛋白，與araO1和araI區(qū)相結(jié)合，在CRP-cAMP的共同作用下起始結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。a.培養(yǎng)基含有葡萄糖，cAMP-CRP沒有與操縱區(qū)位點(diǎn)相結(jié)合，AraC蛋白處于Pr形式并與操縱區(qū)A位點(diǎn)結(jié)合，RNA聚合酶不能與Pc結(jié)合，araC基因受到抑制，整個(gè)系統(tǒng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)。b.沒有葡萄糖糖，也沒有阿

28、拉伯糖。因?yàn)闆]有誘導(dǎo)物，盡管有cAMP-CRP與操縱區(qū)位點(diǎn)相結(jié)合，AraC蛋白仍以Pr形式為主，無法與操縱區(qū)B位點(diǎn)相結(jié)合，無araBAD mRNA轉(zhuǎn)錄。c.無葡萄糖，有阿拉伯糖。大量araC基因產(chǎn)物以Pi形式存在，并分別與操縱區(qū)B、A位點(diǎn)相結(jié)合，在cAMP-CRP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表達(dá)，操縱子充分激活。6. 4. 3 組氨酸操縱子組氨酸（histidine）能被降解成氨、谷氨酸和甲酰胺，參與基礎(chǔ)能量代謝。與His降解代謝有關(guān)的兩組酶類被稱為hut酶（histidine utilizing enzyme），控制這些酶合成的操縱子被稱為hutoperon。圖6-30是組氨

29、酸降解的代謝途徑，它由一個(gè)多重調(diào)節(jié)的操縱子控制，有兩個(gè)啟動(dòng)子，兩個(gè)操縱區(qū)及兩個(gè)正調(diào)節(jié)蛋白。Hut操縱子共編碼4種酶和一個(gè)阻遏物。4種酶分別由hutG、hutH、hutI及hutU基因編碼，阻遏物則由hutC基因編碼。在產(chǎn)氣克氏菌中，以上基因構(gòu)成兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，hutI、hutG、hutC和hutU、hutH分別被轉(zhuǎn)錄合成兩條mRNA長鏈。（圖6-31）。hut操縱子擁有兩個(gè)不同的正調(diào)節(jié)因子，其中的一個(gè)參與促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞生長環(huán)境中碳、氮來源都受限制時(shí)，hut操縱子負(fù)責(zé)供給細(xì)胞碳和氮。hut操縱子的每一個(gè)啟動(dòng)子上都有cAMP-CRP結(jié)合位點(diǎn)。6. 4. 4 阻遏蛋白LexA

30、的降解與細(xì)菌中的SOS應(yīng)答當(dāng)細(xì)菌DNA遭到破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會啟動(dòng)一個(gè)被稱為SOS的誘導(dǎo)型DNA修復(fù)系統(tǒng)。參與SOS DNA修復(fù)系統(tǒng)的基因都受LexA阻遏蛋白的抑制，SOS體系的誘導(dǎo)表達(dá)過程中LexA阻遏蛋白被移開。圖6-32 大腸桿菌中受LexA蛋白阻遏的SOSDNA損傷修復(fù)系統(tǒng)操縱子的表達(dá)調(diào)控模式。一般情況下，約有1000個(gè)RecA蛋白單體分散在每個(gè)細(xì)胞中。當(dāng)DNA嚴(yán)重受損時(shí)，單鏈DNA缺口數(shù)量增加，RecA與這些缺口處單鏈DNA相結(jié)合，被激活成為蛋白酶，將LexA蛋白切割成沒有阻遏和操縱區(qū)DNA結(jié)合活性的兩個(gè)片段，導(dǎo)致SOS體系（包括recA基因）高效表達(dá)，DNA得到修復(fù) 。6. 4. 5

31、二組分調(diào)控系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最簡單的細(xì)胞信號系統(tǒng)稱為二組分系統(tǒng)（two-component systems），由二種不同的蛋白質(zhì)組成：即位于細(xì)胞質(zhì)膜上的傳感蛋白（sensor protein）及位于細(xì)胞 質(zhì) 中 的 應(yīng) 答 調(diào) 節(jié) 蛋 白 （ responseregulator protein）。圖6-33 細(xì)菌中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的二組分調(diào)控系統(tǒng)傳感激酶常在與膜外環(huán)境的信號反應(yīng)過程中被磷酸化，再將其磷?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白上，磷酸化的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白即成為阻遏或誘導(dǎo)蛋白，通過對操縱子的阻遏或激活作用調(diào)控下游基因表達(dá)。6. 4. 6 多啟動(dòng)子調(diào)控的操縱子1、rRNA操縱子大腸桿菌rRNA操縱子（rrnE）

32、上有兩個(gè)啟動(dòng)子P1和P2。在對數(shù)生長期，P1起始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物比P2起始的產(chǎn)物多35倍。當(dāng)細(xì)菌處于緊急狀態(tài)，細(xì)胞中ppGpp濃度增加，P1的作用被抑制。因?yàn)閞RNA是細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成機(jī)器核糖體的重要組成部分，不能完全停止供應(yīng)，由P2起始rrnE基因轉(zhuǎn)錄。2、核糖體蛋白S1操縱子核糖體蛋白SI操縱子（rpsA）也受應(yīng)急反應(yīng)調(diào)節(jié)。rpsA有4個(gè)啟動(dòng)子，P1、P2是強(qiáng)啟動(dòng)子，平時(shí)主要依靠它們來啟動(dòng)基因的表達(dá)，合成S1蛋白。P3、P4是弱啟動(dòng)子，只有在緊急情況下，P1、P2啟動(dòng)子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的S1蛋白維持了生命的最低需要。3、DnaQ蛋白操縱子DnaQ蛋白是DNA聚合酶全酶的亞

33、基。在細(xì)胞中RNA聚合酶活性較低時(shí)，操縱子的轉(zhuǎn)錄由弱啟動(dòng)子P2控制；而RNA聚合酶活性較高時(shí)，就開始利用強(qiáng)啟動(dòng)子P1。也就是說，在細(xì)胞生命活動(dòng)比較緩慢時(shí)， DnaQ蛋白的合成靠弱啟動(dòng)子P2來維持。當(dāng)細(xì)胞增殖速度加快，RNA聚合酶活性升高時(shí)，P1就被激活。6. 5 固氮基因調(diào)控氮是所有生物的基本組成成分，蛋白質(zhì)、核酸及許多小分子代謝產(chǎn)物都是含氮化合物。地球上的動(dòng)植物共含氮約1.51010噸，而每年通過硝化細(xì)菌以氣態(tài)氮的形式釋放到大氣中的氮就有21085108噸，全世界氮肥廠每年生產(chǎn)的化肥僅含氮約108噸。如果沒有生物固氮，生命很快就不復(fù)存在了。6. 5. 1 根瘤的產(chǎn)生根瘤菌在豆科植物根際的生長

34、以及與寄主植物根毛幼嫩部位的接觸是感染發(fā)生的第一步。通常情況下，根瘤菌特定小種的寄主范圍都是很狹窄的，如Rhizobium trifolii主要感染三葉草，R. phaseoli主要感染菜豆，R. Leguminosarum主要感染豌豆。表6-5 感染各種植物的不同根瘤菌主要類群苜蓿類三葉草類豌豆類菜豆類羽扇豆類大豆類豇豆類根瘤菌名R. melilotiR. trifoliiR.leguminosarumR. phaseoliB. lupiniB. japonicumCowpearhizobia寄主植物苜蓿三葉草豌豆、某些菜豆及扁豆菜豆羽扇豆大豆花生、豇豆、金合歡屬6. 5. 2 固氮酶固氮酶

35、所催化的反應(yīng)：8e-N2+8H+32ATP-2NH3+H2+32ADP+32Pi這個(gè)反應(yīng)包括兩個(gè)組分：組分I由兩個(gè)5.0104的亞基和兩個(gè)6.0104的亞基組成，由nifD和nifK基因編碼。含有4個(gè)4Fe-4S連接橋和兩個(gè)鐵-鉬輔助因子（FeMoCo），常被稱為鐵鉬蛋白（FeMo-protein）。組分II由兩個(gè)完全相同的相對分子質(zhì)量各為3.0104的亞基所組成，由nifH基因編碼，常被稱為鐵蛋白（Fe-protein）。組分II只有一個(gè)4Fe-4S連接橋，位于兩個(gè)亞基之間，一次只可送出一個(gè)電子，是生物固氮反應(yīng)中的“瓶頸”。FeMoCo含有1摩爾 Mo，6摩爾Fe，8摩爾S，可能位于酶-底結(jié)

36、合活性中心附近。分離純化的FeMoCo能被用來活化鐵鉬蛋白。研究認(rèn)為，鐵鉬蛋白亞基第191位谷氨酰胺和第195位組氨酸附近，若分別用賴氨酸取代谷氨酰胺191，用天冬酰胺取代組氨酸195，鐵鉬蛋白的固氮活性明顯下降。表6-6 幾種不同突變體中的固氮酶活性比較株系突變核苷酸序列鐵鉬蛋白相對活性鐵蛋白相對活性野生型CAGTCCCTGGCCACCACATC40.618.7DJ357nifDK：Kmr048.5DJ178-His195AsnCAGTCCCTGGCAACCACATC3.726.3DJ255-Gln191LysCGCGGCGTTTCCAAGTCCCTG1.439.56. 5. 3 與固氮有關(guān)

37、的基因及其調(diào)控實(shí)驗(yàn)證明，nifAL基因控制了整個(gè)固氮酶系統(tǒng)的表達(dá)和活性。若突變nifA基因，那么固氮酶和其他所有已知的nif基因產(chǎn)物都會消失。若再將野生型nifA基因用質(zhì)粒DNA的形式導(dǎo)入上述突變株中，nif操縱子的功能就得到恢復(fù)。nifA和nifL基因產(chǎn)物分別是nif操縱子的正、負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)沒有nifL蛋白質(zhì)時(shí)，nifA基因產(chǎn)物足以激活其他nif基因的表達(dá)，甚至在有NH3和O2存在時(shí)也如此。Nif野生型克氏肺炎桿菌UNF928中固氮酶的活性完全被10mmol/L NH4+所抑制，而UNF714由于帶有突變型nifAL基因，所以固氮酶活性為零。若將帶有nifA質(zhì)粒DNA正向表達(dá)載體pM

38、C73A導(dǎo)入U(xiǎn)NF714中，不但能完全恢復(fù)野生型固氮酶活性，而且在10毫摩爾/升 NH4+中仍有15%30%的活性。表6-7 克氏肺炎桿菌固氮酶活性與nifA質(zhì)粒的關(guān)系株系固氮酶活性 / 相對單位NH4+NH4+UNF928UNF714UNF714+pMC73AUNF714+pMC73BUNF1780(glnA100nif)UNF1780+pMC73AUNF1780+pMC73B10002300.10.051740.0050.0050270.10.075800.005有兩組nif-突變體位于質(zhì)粒上90分鐘處，被稱為ntrB和ntrC（ntr，nitrogenregulation，氮調(diào)控），另有

39、一組位于質(zhì)粒上70分鐘處，稱為ntrA。nifA基因只有在ntrA、ntrC基因產(chǎn)物的共同作用下才能正常工作，激活nif操縱子群，而ntrC基因的活性是直接受NH3影響的。NH3濃度較高時(shí)，ntrC基因產(chǎn)物沒有轉(zhuǎn)錄活性。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)谷氨酰胺：-酮戊二酸的比值較低時(shí)，UMP就在glnD基因產(chǎn)物的作用下被轉(zhuǎn)移到GlnB蛋白上，反之則從GlnB蛋白上脫去UMP。不帶有UMP的GlnB蛋白能與NtrB產(chǎn)物相結(jié)合并導(dǎo)致NtrC基因產(chǎn)物去磷酸化，喪失啟動(dòng)nifAL基因轉(zhuǎn)錄的功能。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)游離氨含量較低時(shí)，GlnB蛋白被尿苷化并與NtrB蛋白分離，使后者蛋白激酶的功能得到發(fā)揮，將NtrC蛋白磷酸化而激活nif操縱子系統(tǒng)（圖6-38）。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)氧濃度一般都在數(shù)百微摩爾左右，而固氮酶只能在幾十納摩爾O2濃度下才能正常工作，固氮菌依靠Lb解決了這對矛盾，因?yàn)長b對O2有極高的親和力，它與大量自由O2相結(jié)合，既大大降低了自由O2濃度，又能將分子氧直接輸送到呼吸鏈。表6-9 大豆根瘤細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化分析類菌體周膜空間含類菌體的寄主細(xì)胞質(zhì)Lb含量Lb氧化程度氧吸附量自由氧濃度吸附氧/自由氧300mol/L0