目的基因的克隆與基因組文庫的建立

1、第三章目的基因的克隆與基因組文庫的建立第1頁，共73頁。第一節(jié)、基因克隆基因克??？第2頁，共73頁。基因克??；經(jīng)無性繁殖獲得基因許多相同基因拷貝的過程第3頁，共73頁。第4頁，共73頁。抽取抽取DNA切下鼠切下鼠DNA切開質(zhì)粒切開質(zhì)粒DNA將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞混合、連接混合、連接 第5頁，共73頁。培養(yǎng)基中加抗生素培養(yǎng)基中加抗生素培養(yǎng)培養(yǎng)裂解細(xì)胞釋放裂解細(xì)胞釋放DNA分子分子雜交雜交分離擴(kuò)增目的克隆分離擴(kuò)增目的克隆第6頁，共73頁。第7頁，共73頁。第8頁，共73頁。基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟 1、目的基因的取得目的基因的取得 2、 載體的選擇載體的選擇 3、

2、目的基因與載體、目的基因與載體DNA的體外重組的體外重組 4、重組載體引入受體細(xì)胞、重組載體引入受體細(xì)胞 5、表達(dá)篩選、表達(dá)篩選第9頁，共73頁。第10頁，共73頁?；蚩寺∨c基因表達(dá)產(chǎn)物有何不同？第11頁，共73頁。第12頁，共73頁。（一）DNA片段的獲得 1、從基因所在的生物體直接取得限制性內(nèi)切酶（restriction enzymes） 2、人工合成DNA片段（DNA合成儀） 3、PCR反應(yīng)合成DNA 4、 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA5、用機(jī)械的方法超聲波、第13頁，共73頁。 M 1 2 3 Kb. 23.1 9.46.5 4.3 2.32.0 圖3 不同酶切時間電泳圖 M Hindm

3、arkers 1 酶切10分鐘 2 酶切20分鐘 3 酶切5分鐘 回收回收2-7Kb DNA 2-7Kb DNA 第14頁，共73頁。(二）、載體的選擇二）、載體的選擇 第15頁，共73頁。載體的種類：載體的種類：1 1、質(zhì)粒載體、質(zhì)粒載體2 2、入噬菌體載體、入噬菌體載體3 3、柯斯質(zhì)粒載體、柯斯質(zhì)粒載體4 4、M13M13噬菌體載體噬菌體載體5 5、真核細(xì)胞的克隆載體：、真核細(xì)胞的克隆載體：酶母質(zhì)粒載體、病毒載體酶母質(zhì)粒載體、病毒載體6 6、人工染色體、人工染色體第16頁，共73頁。切第17頁，共73頁。（三）、目的基因與載體（三）、目的基因與載體DNA的體外重組的體外重組用用DNA連接酶

4、將含有外源基因的連接酶將含有外源基因的DNA片斷接片斷接到載體上，形成到載體上，形成DNA重組分子；重組分子；第18頁，共73頁。第19頁，共73頁。（四）、重組載體引入受體細(xì)胞（四）、重組載體引入受體細(xì)胞 重組載體引入受體細(xì)胞，使基因擴(kuò)重組載體引入受體細(xì)胞，使基因擴(kuò)增和表達(dá)出供體基因所提供的部分遺傳增和表達(dá)出供體基因所提供的部分遺傳性狀性狀。第20頁，共73頁。轉(zhuǎn)第21頁，共73頁。第22頁，共73頁。第23頁，共73頁。50-100mmol/LCaCl2 第24頁，共73頁。第25頁，共73頁。篩第26頁，共73頁。第27頁，共73頁。pBR322AmpTet第28頁，共73頁。AmN2H

5、第29頁，共73頁。第30頁，共73頁。第31頁，共73頁。第32頁，共73頁。第33頁，共73頁。濾膜（固定抗體）+第34頁，共73頁。ACTGAAGGCT第35頁，共73頁。 第二節(jié)第二節(jié) 基因文庫的建立基因文庫的建立 真核生物基因組真核生物基因組DNA十分龐大，其復(fù)雜程度是十分龐大，其復(fù)雜程度是蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和mRNA的的100倍左右倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列。，而且含有大量的重復(fù)序列。 采用采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。 在生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體

6、的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫 。第36頁，共73頁?；蛭膸旎蛭膸?gene library) 指某個生物的基因組 DNA 或 cDNA 片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合。按照外源 DNA 片段的來源，可將基因文庫分為： 基因組文庫基因組文庫(genomic library) （含有全部基因） cDNA文庫文庫(complementary DNA library) （含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）

7、 第37頁，共73頁?；蛭膸斓耐陚湫源硇院碗S機(jī)性代表性和隨機(jī)性代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的 DNA 片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段 DNA 。代表性是衡量文庫質(zhì)量的一個很重要的指標(biāo)。在文庫的構(gòu)建過程中引用了兩個策略，一是采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來消化染色體 DNA ，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段 DNA 在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；二是提高文庫所含基因組 DNA 的總?cè)萘浚ǔＳ酶采w基因組的倍數(shù)來衡量。第38頁，共73頁。為預(yù)測一個完整基因組文庫應(yīng)包含克隆的數(shù)目， Clark 和 Carbon 于 1975 年提出如下的計算公式： N = ln ( 1

8、 P ) / ln ( 1 f )N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )N：代表一個完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個數(shù)P = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 第39頁，共73頁。例如，人的單倍體DNA總長為2.9 x 109 9 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克??；而當(dāng)完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆第40頁，共73頁?；蛭膸斓馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減

9、輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選第41頁，共73頁。一、基因組 DNA 文庫1.基因組 DNA 文庫：指將某生物體的全部基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的 DNA 片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落。2、目、目 的：的： a）分離有用的目的基因）分離有用的目的基因 b）保存某種生物的全部基因）保存某種生物的全部基因第42頁，共73頁。3、相對于、相對于cDNAcDNA文庫，基因組文庫的優(yōu)點(diǎn)：

10、文庫，基因組文庫的優(yōu)點(diǎn)：cDNAcDNA克隆只能反映著克隆只能反映著mRNAmRNA的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的分子結(jié)構(gòu)，沒有包括基因組的間隔序列。的間隔序列。 cDNAcDNA文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著文庫中，不同克隆的分布狀態(tài)總是反映著mRNAmRNA的分的分布狀態(tài)，即：高豐度布狀態(tài)，即：高豐度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，所占比例較高克隆，所占比例較高，分離基因容易；低豐度，分離基因容易；低豐度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，所占比例較克隆，所占比例較低，分離基因困難；低，分離基因困難； 從從cDNAcDNA克隆中，不能克隆到基因組克隆中，不能克隆到基因組

11、DNA DNA 中的非轉(zhuǎn)錄中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)段的序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)的調(diào)控區(qū)段的序列，不能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。序列的結(jié)構(gòu)與功能。第43頁，共73頁。 基因組文庫 cDNA文庫信息供體 DNA mRNA載體 噬菌體，黏粒，人工染色體 質(zhì)粒，噬菌體連接前 部分酶切，分級分離 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈 連接 粘端連接，人工接頭 同聚物加尾，人工接頭篩選 核酸探針 核酸探針，免疫探針基因組文庫和cDNA文庫的比較第44頁，共73頁。4.基因文庫的構(gòu)建流程組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分酶解DNADNA長度分級雙鏈cDNADNA與載體連接 引入宿主細(xì)胞鑒定文

12、庫的完備性擴(kuò)增后供長期儲存篩選出所需要的克隆第45頁，共73頁?；蚪M文庫的構(gòu)建流程 載體的選擇和制備； 高純度、大分子量基因組 DNA 的提??； 基因組 DNA 的部分酶切與分級分離； 載體與DNA片段的連接； 轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。 第46頁，共73頁?；蚪MDNA文庫限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝第47頁，共73頁。載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒或

13、l-DNA上述幾種載體的最大裝載量如下：第48頁，共73頁。質(zhì)粒 15kbl-DNA 25kbCosmid 45kbBAC 300kbYAC 400kb 載體的制備要求兩點(diǎn)，一是純度高；二是去磷酸化好。用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第49頁，共73頁?；蚪MDNA的制備 為了最大限度保證基因在克隆過程中的完整性， DNA在分離純化操作中應(yīng)避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，文庫的重組率和完備性也就越高。 一般所提取的 DNA 分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的 35 倍。 實踐表明，提取的基因組 DNA 分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。第50頁，共

14、73頁。 用常規(guī)方法制備的染色體 DNA的長度一般在100 kb左右 如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNaseA的緩沖液中浸泡，可獲得 100 kb大小的DNA片段第51頁，共73頁。 基因組DNA的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切,其目的是： 第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證DNA片段大小均一 超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭 部分酶切法一般選用4 堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：SauA或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控, 連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的D

15、NA片段隨機(jī)連為一體！第52頁，共73頁。 載體與載體與DNA片段的連接片段的連接 在基因組文庫的構(gòu)建過程中，大量體系連接前先使用小體系連接來尋找最佳比例！ 方法一：粘末端連接 方法二：人工接頭法第53頁，共73頁。文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)量穩(wěn)定的進(jìn)口包裝蛋白！研究表明對連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。另外，對于電轉(zhuǎn)化而言，選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對不同插入片段的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率也有所不同。第54頁，共73頁。第55頁，共73頁。構(gòu)建基因組文庫應(yīng)注意的問題1、構(gòu)建一個文庫，插入DNA和載體DNA的

16、質(zhì)量是成功與否的關(guān)鍵?；蚪MDNA應(yīng)當(dāng)非常純以適應(yīng)DNA的酶解，而且基因組DNA也應(yīng)足夠大（最好超過200kb）以獲得兩個末端的消化產(chǎn)物。 2、不論是載體DNA還是靶DNA不含外源片段是一個基本條件。污染少量探針順序或載體的基因組DNA將引起很大麻煩，這是因為在篩選過程中它們將被鑒定為所要的克隆。 第56頁，共73頁。3、部分消化產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是一組覆蓋整個基因組的隨機(jī)片段。識別4個堿基的限制酶要比識別6個堿基酶能產(chǎn)生更隨機(jī)的插入片段。部分消化所產(chǎn)生的片段應(yīng)能連接到設(shè)定的載體上。限制酶和部分消化過程應(yīng)事先檢查。一些批次的酶質(zhì)量不夠高而導(dǎo)致產(chǎn)生的DNA片段末端不能有效地連接。如果預(yù)期結(jié)果沒有出現(xiàn)，檢查

17、限制酶和DNA濃度及純度。 第57頁，共73頁。4、在考慮把噬菌體臂和插入DNA片段連接過程中有兩個重要參數(shù)：噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因組DNA的濃度和純度。大約10pg噬菌臂和4gDNA能產(chǎn)生有效地包裝。對一個典型的基因組，要產(chǎn)生一個可表達(dá)文庫，重組子數(shù)一般要大于11066l06。 第58頁，共73頁。5、包裝抽提物的包裝效率貯存于液氮中可保持1年多。而在-70中只能保存幾星期，而且包裝效率還會降低。由于包裝抽提物的質(zhì)量是一個關(guān)鍵性因素，商業(yè)性包裝抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。這種包裝提取物質(zhì)量高，且在體外包裝噬菌體DNA和插入片段過程能產(chǎn)生大量的噬

18、菌斑。第59頁，共73頁。二、cDNA文庫的構(gòu)建流程 細(xì)胞總 RNA 的提取和 mRNA 分離； 第一鏈 cDNA 合成； 第二鏈 cDNA 合成； 雙鏈 cDNA 克隆到載體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中繁殖。 第60頁，共73頁。第61頁，共73頁。cDNA文庫的標(biāo)準(zhǔn)流程 Total RNA的提取 mRNA的分離 cDNA雙鏈的合成 載體的制備 cDNA雙鏈和載體的連接 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 快速鑒定pBlueScript cDNA庫擴(kuò)增第62頁，共73頁。（一）、 RNA 的分離mRNA 的完整性 mRNA 的豐度 （豐度高用質(zhì)粒，豐度低用噬菌體）mRNA 的富集 第63頁，共73頁。（二）、cDNA 第一鏈的

19、合成 反轉(zhuǎn)錄酶：AMV （來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒）和 MMLV （來自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和隨機(jī)引物 Oligo（dT）引導(dǎo)的 cDNA 合成是指 Oligo（dT）引物與 mRNA 3 末端的 poly（A）配對，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以 mRNA 為模板合成第一鏈 cDNA 。 這種 cDNA 合成的方法在 cDNA 文庫構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點(diǎn)是由于 cDNA 末端存在較長的 poly（A）而影響 cDNA 測序。 第64頁，共73頁。 隨機(jī)引物引導(dǎo)的 cDNA 合成是采用 610 個隨機(jī)堿基的寡核苷酸短片段來錨定 mRNA 并作為反轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。 由于隨機(jī)引物

20、可能在一條 mRNA 鏈上有多個結(jié)合位點(diǎn)而從多個位點(diǎn)同時發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長的 mRNA 分子的 5端序列。 隨機(jī)引物 cDNA 合成的方法不適合構(gòu)建 cDNA 文庫，一般用于克隆特定 mRNA 的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。第65頁，共73頁。（三）、cDNA 第二鏈的合成 自身引導(dǎo)法置換合成法引導(dǎo)合成法第66頁，共73頁。煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1第67頁，共73頁。DNApol dNTPsRNaseH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會有幾對堿基缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 55 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55A