轉(zhuǎn)氨基作用 jxPPT精選文檔

1、1實驗：轉(zhuǎn)氨基作用紙 層 析 法生化教研室2驗證肝臟內(nèi)存在具有轉(zhuǎn)氨基作用的酶。驗證肝臟內(nèi)存在具有轉(zhuǎn)氨基作用的酶。初步掌握紙層析的原理和方法初步掌握紙層析的原理和方法【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?. 茚三酮顯色原理茚三酮顯色原理1轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用2層析原理層析原理【實驗原理實驗原理】4轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用 在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，-氨基酸的氨基酸的-NH2-NH2和和-酮酸的酮酸的-C=O-C=O相互轉(zhuǎn)化，生成相應(yīng)的相互轉(zhuǎn)化，生成相應(yīng)的-酮酸和酮酸和氨基酸的過程。氨基酸的過程。磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛【實驗原理實驗原理】5最常見轉(zhuǎn)氨酶：轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)氨基作用GPT 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic

2、 pyruvic transaminase）GOT 谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminade） 所有轉(zhuǎn)氨酶的輔酶都是維生素B6的磷酸酯- 磷酸吡哆醛?！緦嶒炘韺嶒炘怼? （谷丙轉(zhuǎn)氨酶）（丙酮酸） （ 丙氨酸）丙氨酸）R1氨基酸 R2酮酸R1酮酸 R2氨基酸PLP（-酮戊二酸）酮戊二酸）（谷氨酸）（谷氨酸）【實驗原理實驗原理】7 層析技術(shù)是近代生物化學(xué)最常用的分離技術(shù)之一。它是利用層析技術(shù)是近代生物化學(xué)最常用的分離技術(shù)之一。它是利用混合物中各組分的混合物中各組分的理化性質(zhì)理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、分子極（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和

3、力、性、分子親和力、分配系數(shù)分配系數(shù)等）的差異，在兩相運(yùn)動中，不斷地等）的差異，在兩相運(yùn)動中，不斷地進(jìn)行交換、分配、吸附及解吸附等過程，可將各組分間的微小差進(jìn)行交換、分配、吸附及解吸附等過程，可將各組分間的微小差異經(jīng)過相同的重復(fù)過程而達(dá)到分離。異經(jīng)過相同的重復(fù)過程而達(dá)到分離。 無論哪種層析均由無論哪種層析均由固定相固定相和和流動相流動相組成。組成。 8用水飽和的用水飽和的水水濾紙濾紙有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑+結(jié)合水結(jié)合水= 樣品在樣品在固定相固定相中的濃度（中的濃度（C固固）樣品在樣品在流動相流動相中的濃度（中的濃度（C流流）分配系數(shù)分配系數(shù)K固定相固定相流動相流動相OH OH OH OH ：濾紙：

4、有機(jī)溶劑【實驗原理實驗原理】9 B O遷移率遷移率f A點樣點到點樣點到斑點中心斑點中心的距離（的距離（AB）點樣點到點樣點到溶劑前沿溶劑前沿的距離（的距離（AO）【實驗原理實驗原理】10遷移率遷移率RfRf與分配系數(shù)與分配系數(shù)K K的關(guān)系的關(guān)系【實驗原理實驗原理】11 COOHH C CH3 NH2 COOHH C CH2CH2COOH NH2【實驗原理實驗原理】谷氨酸谷氨酸 丙氨酸丙氨酸K KGlu Glu K KAlaAlaRfRfGlu Glu RfKRfKAlaAla12茚三酮茚三酮H2O茚三酮水合物茚三酮水合物茚三酮顯色反應(yīng)茚三酮顯色反應(yīng)藍(lán)紫色化合物藍(lán)紫色化合物【實驗原理實驗原理】

5、13 1、實驗器材、實驗器材 培養(yǎng)皿；濾紙；勻漿器；試管；試管架；恒溫水培養(yǎng)皿；濾紙；勻漿器；試管；試管架；恒溫水浴鍋；毛細(xì)管；移液管；噴霧器；剪刀；鉛筆；格浴鍋；毛細(xì)管；移液管；噴霧器；剪刀；鉛筆；格尺尺 2、實驗試劑、實驗試劑 （1）0.01M pH7.4磷酸緩沖液磷酸緩沖液 （2）0.1M丙氨酸溶液丙氨酸溶液 （3） 0.01M-酮戊二酸溶液酮戊二酸溶液 （4） 0.1M谷氨酸溶液谷氨酸溶液 （5） 0.5茚三酮溶液茚三酮溶液 （6）水飽和的苯酚水飽和的苯酚 【實驗儀器和試劑實驗儀器和試劑】141.1.肝勻漿制備：提供轉(zhuǎn)氨酶肝勻漿制備：提供轉(zhuǎn)氨酶3.3.紙層析紙層析4.4.茚三酮顯色茚三

6、酮顯色2.2.轉(zhuǎn)氨基：丙氨酸轉(zhuǎn)氨基：丙氨酸 谷氨酸谷氨酸【實驗操作實驗操作】151.肝勻漿制備：肝勻漿制備：提供轉(zhuǎn)氨酶提供轉(zhuǎn)氨酶新鮮肝臟新鮮肝臟0.5g4.5ml 0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液磷酸緩沖液充分勻漿至充分勻漿至粉紅色溶液粉紅色溶液充分勻漿充分勻漿食指抵住底部食指抵住底部勻勻漿漿中指、食指中指、食指夾住十字柄部夾住十字柄部16【實驗操作實驗操作】172. 轉(zhuǎn)氨基：轉(zhuǎn)氨基：丙氨酸丙氨酸 谷氨酸谷氨酸測定管測定管對照管對照管肝勻漿液肝勻漿液45水浴箱水浴箱5分鐘分鐘煮沸煮沸10分鐘、冷卻分鐘、冷卻0.5ml0.5ml丙氨酸丙氨酸0.5ml 0.5ml 酮戊二酸酮戊二酸0.5m

7、l 0.5ml PH7.4磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液 0.5ml 0.5ml45 保溫保溫30分鐘分鐘45 保溫保溫30分鐘分鐘183.紙紙 層層 析析畫線畫線點樣點樣打孔打孔做燈芯做燈芯展層展層1.測定管測定管2.丙氨酸丙氨酸3.對照管對照管4.谷氨酸谷氨酸點樣點直徑點樣點直徑 0.5cm, 一般一般 點點3-5 滴滴,前一滴干后前一滴干后, 才可點第二滴才可點第二滴.19 2cm3cm燈芯制作燈芯制作 20打孔時打孔時,不要用油筆不要用油筆,孔不要太大孔不要太大.214.茚三酮顯色茚三酮顯色烘干烘干噴液噴液烘干烘干顯色顯色22 測量點樣原點到各氨基酸測量點樣原點到各氨基酸層析斑點中心的距離，

8、計算各層析斑點中心的距離，計算各氨基酸的氨基酸的f f值。值?！緦嶒灲Y(jié)果實驗結(jié)果】23【實驗結(jié)果實驗結(jié)果】 用鉛筆畫出條帶的邊框，測出表格中的數(shù)值，計算用鉛筆畫出條帶的邊框，測出表格中的數(shù)值，計算R Rf f 值。值。測定參數(shù)測定參數(shù)測定樣品測定樣品谷氨酸谷氨酸丙氨酸丙氨酸對照對照點樣點到斑紋中心點樣點到斑紋中心距離距離 (cm)(cm)點樣點到溶劑前沿點樣點到溶劑前沿距離距離 (cm)(cm)R Rf f 值值 與已知的標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸與已知的標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸R Rf f進(jìn)行對比，指出條帶所對應(yīng)的氨進(jìn)行對比，指出條帶所對應(yīng)的氨基酸，并根據(jù)結(jié)果解釋轉(zhuǎn)氨作用。基酸，并根據(jù)結(jié)果解釋轉(zhuǎn)氨作用。241.1.勻

9、漿器的正確使用勻漿器的正確使用 . . 2.2.對照管的煮沸時間要充分對照管的煮沸時間要充分 . .3.3.手不要在濾紙上亂摸手不要在濾紙上亂摸 . . 4.4.點樣量不可過多，點樣過程中應(yīng)注意不要造成濾點樣量不可過多，點樣過程中應(yīng)注意不要造成濾紙污染（手和唾液都含有氨基酸）。紙污染（手和唾液都含有氨基酸）。點樣點直徑點樣點直徑 0.5cm, 0.5cm, 一般一般 點點3-5 3-5 滴滴, ,前一滴干后前一滴干后, , 才可點第二滴才可點第二滴. .5 5在濾紙上劃線時只需用鉛筆，不可用其它筆在濾紙上劃線時只需用鉛筆，不可用其它筆6 6烘烤時要注意明火。烘烤時要注意明火。7 7點樣時毛細(xì)管不能交叉污染。點樣時毛細(xì)管不能交叉污染。 8. 8. 茚三酮的噴量要適中茚三酮的噴量要適中 . .【注意事項注意事項】251 1如果對照管在沸水中煮的時間不夠充分，如果對照管在沸水中煮的時間