試驗四_人毛囊DNA的快速提取及PCR檢測性別M

1、實驗四實驗四 人毛囊人毛囊DNA的快速提取的快速提取及及PCR方法檢測方法檢測SRY基因判斷性別基因判斷性別實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握毛囊掌握毛囊DNA的快速提取方法及其原理的快速提取方法及其原理 掌握掌握DNA的電泳檢測技術(shù)的電泳檢測技術(shù) 學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)PCR擴增擴增DNA的原理，掌握的原理，掌握PCR操作操作步驟步驟 掌握利用掌握利用PCR技術(shù)擴增技術(shù)擴增SRY基因判斷性別基因判斷性別的原理的原理試驗內(nèi)容一一 毛囊毛囊DNA的的快速提取快速提取與檢測與檢測二二 PCR擴增進(jìn)行性別鑒定擴增進(jìn)行性別鑒定前期準(zhǔn)備前期準(zhǔn)備 前期處理：前期處理： 挑出毛發(fā)挑出毛發(fā)10根，盡量剪短至只剩下毛囊，根，盡量剪短至只

2、剩下毛囊，去除毛根，放入干凈的去除毛根，放入干凈的EP管中。管中。 加入加入PH8.0的滅菌水清洗的滅菌水清洗1-2次，離心后吸次，離心后吸出水出水PCR擴增進(jìn)行性別鑒定擴增進(jìn)行性別鑒定PCR試驗原理試驗原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是當(dāng)今現(xiàn)代分子生物學(xué)的是當(dāng)今現(xiàn)代分子生物學(xué)的三大主流技術(shù)之一。三大主流技術(shù)之一。PCR擴增產(chǎn)物檢測 用濃度為用濃度為1-2%的瓊脂糖凝膠對的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物（產(chǎn)物（DNA）進(jìn)行電泳分離。）進(jìn)行電泳分離。 瓊脂糖凝膠中有很多小孔隙，瓊脂糖凝膠中有很多小孔隙，起一個分子篩的作用，起一個分子篩的作用，

3、DNA在電在電場的作用下由負(fù)極往正極移動穿場的作用下由負(fù)極往正極移動穿過這些孔隙，過這些孔隙，DNA遷移速率與電遷移速率與電場強度成正比，與場強度成正比，與DNA分子量大分子量大小成反比。從而將大小不同的小成反比。從而將大小不同的DNA片段分離開來。片段分離開來。SRY PCR產(chǎn)物大?。寒a(chǎn)物大?。?01 bpGAPDH PCR產(chǎn)物大?。寒a(chǎn)物大?。?65 bpPCR擴增體系擴增體系 10ul總體系：H2O 7 10 = 70Buffer 1.0 10Primer-F 0.3 3Primer-R 0.3 3dNTP 0.3 3Taq 0.1 1Template(毛囊DNA) 1.0 ul PCR擴

4、增程序擴增程序 95 , 4min; 94 , 30s; 60 , 30s; 72 , 30s; Go to 2 30循環(huán)循環(huán) 72 , 5min; 4 , 5min.方法一方法一 酚仿抽提法酚仿抽提法 試劑：試劑： 10% SDS、蛋白酶、蛋白酶K(20mg/ml)、苯酚、氯仿、苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇異戊醇、乙醇 TE 10mmol/L Tris-Hcl, PH=8.0; 1mmol/L EDTA, PH=8.0 步驟步驟酚仿抽提法酚仿抽提法 優(yōu)缺點：優(yōu)缺點： 該方法提取的該方法提取的DNA濃度不是很高，中間濃度不是很高，中間步驟過多會損失大量的步驟過多會損失大量的DNA，所以如果是，所以

5、如果是很細(xì)小的毛，并且量不多，不建議使用此很細(xì)小的毛，并且量不多，不建議使用此方法。但是此方法提取的方法。但是此方法提取的DNA質(zhì)量較好，質(zhì)量較好，擴增效果好。擴增效果好。 酚仿抽提法酚仿抽提法 圖圖1. 酚仿抽提法檢測結(jié)果酚仿抽提法檢測結(jié)果方法二、堿裂解法方法二、堿裂解法于裝有毛囊的于裝有毛囊的EP管中加入管中加入0.2mol/L 的的NaOH溶液溶液 50L，煮沸，煮沸15min后，瞬時后，瞬時離心，吸取上清液至另外一只干凈的離心離心，吸取上清液至另外一只干凈的離心管中管中加入加入PH=6 左右的左右的Tris HCl 50L，13000r離心離心2min將上清液轉(zhuǎn)移到另外一只將上清液轉(zhuǎn)移

6、到另外一只EP管中即可。管中即可。方法二、堿裂解法方法二、堿裂解法 優(yōu)缺點：優(yōu)缺點： 該方法提取步驟較簡單，提取周期短，并該方法提取步驟較簡單，提取周期短，并且且DNA損失量較少，提取效率高。損失量較少，提取效率高。 但但 PH值不容易調(diào)節(jié)以至于會影響到后續(xù)值不容易調(diào)節(jié)以至于會影響到后續(xù)PCR擴增。因此如果擴增。因此如果PCR擴增效率不高的擴增效率不高的引物，不建議用該方法提取。引物，不建議用該方法提取。 方法三、方法三、PCR擴增法擴增法 l 試劑：試劑：10PCR緩沖液、緩沖液、Mg2+、蛋白酶、蛋白酶K(20mg/ml)l 實驗步驟：實驗步驟：l 按以下體系配制毛囊裂解液：按以下體系配制

7、毛囊裂解液： 10PCR緩沖液緩沖液 100L Mg2+ 80L 蛋白酶蛋白酶K(20mg/ml) 1L ddH2O 819L方法三、方法三、PCR擴增法擴增法加入上述裂解液加入上述裂解液15L于放有毛囊的于放有毛囊的EP管中管中在在PCR 儀上設(shè)置一個單循環(huán)程序儀上設(shè)置一個單循環(huán)程序: 65 30 min , 95 15 min , 4 10min。將上一步驟中的將上一步驟中的PCR 試管放入預(yù)熱好的試管放入預(yù)熱好的PCR 儀中儀中,運行該程序；運行該程序；吸取上清液于干凈的吸取上清液于干凈的EP管中即可；管中即可； 方法三、方法三、PCR擴增法擴增法 優(yōu)缺點：該方法提取優(yōu)缺點：該方法提取D

8、NA的效率較高，可的效率較高，可獲得較多的獲得較多的DNA，并且需要的毛囊量較少。，并且需要的毛囊量較少。較細(xì)且少量的毛囊建議用此方法提取較細(xì)且少量的毛囊建議用此方法提取DNA。 但是該方法抽提的但是該方法抽提的DNA質(zhì)量不是很好，擴質(zhì)量不是很好，擴增的時候需加大增的時候需加大DNA加入量，并且擴增的加入量，并且擴增的結(jié)果中可能會有大量雜帶。結(jié)果中可能會有大量雜帶。 圖圖2： PCR法抽提檢測結(jié)果法抽提檢測結(jié)果 電泳檢測電泳檢測 制備制備1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測 DNA具有結(jié)合具有結(jié)合EB分子的能力，在紫外燈下分子的能力，在紫外燈下產(chǎn)生熒光的信號產(chǎn)生熒光的信號二二 PCR擴增進(jìn)行性別鑒定擴增進(jìn)行性別鑒定 性別鑒定原理性別鑒定原理 人類男性的性染色體組成是人類男性的性染色體組成是XY，女性的，女性的性染色體組成是性染色體組成是XX，因而通過對一些在，因而通過對一些在Y染色體上所特有的基因（如染色體上所特有的基因（如SRY基因）進(jìn)基因）進(jìn)行行PCR擴增分析，即可對性別進(jìn)行鑒定。擴增分析，即可對性別進(jìn)行鑒定。 本試驗通過對毛囊本試驗通過對毛囊DNA中的中的SRY基因進(jìn)基因進(jìn)行行PCR擴增分析進(jìn)行性別鑒定，擴增呈陽擴增分析進(jìn)行性別鑒定，擴增呈陽性的為男性，擴增呈陰性的為女