關(guān)于透射電鏡和掃描電鏡等的樣品制備

1、5.1 TEM對樣品的基本要求制備原因要求措施放大倍數(shù)100萬倍，銅網(wǎng)直徑3mm脫水、固定時易浸透 取材小樣品取材小樣品電子束打擊樣品易變形樣品結(jié)實固定、包埋固定、包埋高真空（電子束、穿透能力） 樣品在真空狀態(tài)下無揮發(fā)物脫水脫水電子束穿透能力弱樣品切片厚度樣品切片厚度100nm超薄切片超薄切片樣品組成元素原子序數(shù)小、圖像反差小 增加反差重金屬染色重金屬染色 根據(jù)樣品的種類、性質(zhì)和分析要求選用不同的制備方法，有以下三種方法： 支支 持持 膜膜 法法 復(fù)復(fù) 型型 法法 薄薄 膜膜 法法5.2 TEM樣品的制備方法5.2.1支持膜法支持膜法 懸浮液、粉體等細(xì)小試樣懸浮液、粉體等細(xì)小試樣需要撈在覆有薄

2、膜的金屬載網(wǎng)上。經(jīng)干燥后進行觀察。具體操作在銅網(wǎng)上覆蓋支持膜，將經(jīng)過超聲波分散超聲波分散的顆粒懸浮液滴在支持膜上，靜置干燥，或用紅外燈烘烤干燥。 制作載網(wǎng)的材料大多是銅，因此習(xí)慣上將載網(wǎng)稱為銅網(wǎng)，不過制作載網(wǎng)的材料還可以是金、銀、鎳、鋁、鉑及尼龍。載網(wǎng)的大小隨電鏡的需要而不同，一般直徑為3mm。網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、單孔形等，網(wǎng)孔有50、100、200、300及400目等多種規(guī)格。常用一般普通組織超薄切片選用200-300目的載網(wǎng)，對于過小的和過碎的樣品，可選用400目的載網(wǎng)；對于不易查找的樣品，可選用帶字母標(biāo)記的載網(wǎng)。載網(wǎng)類型載網(wǎng)類型 帶字母的載網(wǎng) 400目平行載網(wǎng) 載網(wǎng)的數(shù)目再高也是有空

3、隙的，為了防止極微小的樣品在撈片時漏掉；或切片時在電子束的轟擊下卷曲；或為了加強空隙大的載網(wǎng)的支持作用等，需要在載網(wǎng)上覆蓋上一層支持膜。制作支持膜所選的材料要求透透明明、本身在電鏡下無可見的結(jié)構(gòu)本身在電鏡下無可見的結(jié)構(gòu)以及在電子束轟擊下電子束轟擊下有高度的機械穩(wěn)定性有高度的機械穩(wěn)定性3個基本的條件。 有多種支持膜，較常用的有孚爾瓦膜、碳膜、火棉膠膜等。孚爾瓦膜一般制成20nm左右，它的支持力較強，但制備較復(fù)雜。碳膜只需幾個納米厚，它的特點是分辨力高，化學(xué)性能穩(wěn)定，機械強度也高，常用于加固其它膜?；鹈弈z膜的機械強度較孚爾瓦膜小，但容易制備，所以也較常用。 介紹一下Formvar膜的制法：該膜的化

4、學(xué)成分為聚乙烯醇縮甲醛（Polyvinyl formal，簡稱PVF）。 首先制備02.-0.5%的氯仿（或二氯乙烯）溶液，然后用洗凈的干燥的載玻片伸入到該溶液中停留片刻，平穩(wěn)取出，自然干燥后玻片上形成一層薄膜。 再用刀片沿玻片邊緣將膜劃破，繼將該玻片的一端垂直浸入玻璃平皿的蒸餾水中，待玻片上的薄膜完全漂在水面，把玻片輕輕下壓取出。 再將銅網(wǎng)排列在膜上，用濾紙與銅網(wǎng)完全貼附后，用鑷子夾住濾紙的一角輕輕將其取出放于培養(yǎng)皿中，待自然干燥后就使用了 。Formvar支持膜的制備支持膜的制備 在使用之前，新網(wǎng)和舊網(wǎng)都需要進行清洗，清洗的目的除了使載網(wǎng)清潔之外，還有除去載網(wǎng)的靜電以便撈片的作用。對于新的

5、載網(wǎng)，直接用95的乙醇浸泡一下，再用重蒸水沖洗后自然晾干即可。舊載網(wǎng)的清洗方法有以下兩種： 氯仿法：把舊網(wǎng)放入錐形瓶中，用氯仿浸泡若干天，經(jīng)?；蝿訋椭鷼埓娴臉悠窂妮d網(wǎng)上脫落，接著用重蒸水沖洗數(shù)次，再用100乙醇洗一次后，放在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中自然晾干。 燒灼法：用95的乙醇燒灼片刻后放入其中，最后用重蒸水沖洗數(shù)次，最后一次用100乙醇，撈出后自然晾干。 由于電子束穿透能力很低，因此要求所觀察的樣品很薄，對于常用的75-200kv加速電壓來說，樣品厚度控制在100-200nm為宜。對于那些易起變化或難以制成電子束對于那些易起變化或難以制成電子束透明的薄膜試樣采用復(fù)型法制備樣品透明的薄膜試樣采用復(fù)

6、型法制備樣品。復(fù)型法是用中間媒介物（碳、塑料薄膜）把固體樣品表面微觀形貌浮雕復(fù)制到薄膜上，利用透射電子的質(zhì)厚襯度效應(yīng)，通過對浮雕的觀察，間接地得到材料表面組織形貌。復(fù)型法得到的樣品是一種間接試樣。 它只能用于試樣表面形貌的觀察和研究，而不能用來觀察試樣的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。5.2.2 復(fù)型法 對復(fù)型材料的主要要求： 復(fù)型材料本身必須是“無結(jié)構(gòu)”或非晶態(tài)的； 有足夠的強度和剛度，良好的導(dǎo)電、導(dǎo)熱和耐電子束轟擊性能。復(fù)型的種類復(fù)型的種類 按復(fù)型的制備方法，復(fù)型主要分為： 一級復(fù)型 二級復(fù)型 萃取復(fù)型（半直接樣品） 碳一級復(fù)型 （1）用常規(guī)方法將試樣的表面拋光、腐蝕，其腐蝕深度較一般金相腐蝕略深。斷口最好為新

7、鮮斷口。 （2）在真空鍍膜儀中將試樣表面噴鍍一層碳膜，厚度控制在1020nm。 （3）用刀片或針尖將碳膜表面劃成33mm的小方塊。 （4）將試樣在專用的電解液中進行電解。當(dāng)碳膜的邊角翹起或有個別碳膜脫落時，取出試樣并放到無水乙醇溶液中輕輕晃動，使碳膜脫落。 （5）再用無水乙醇或水將碳膜輕輕漂洗23次，再在溶液中停留幾分鐘，將電解液徹底清除干凈。 （6）用銅網(wǎng)撈出晾干即可。碳一級復(fù)型示意圖二級復(fù)型（1）用常規(guī)方法將試樣表面拋光、腐蝕，其腐蝕深度較一般金相腐蝕略深。（2）配制好0.5%、1%、2%、5%幾種不同濃度的火棉膠醋酸異戊脂溶液。（3）取0.5%的火棉膠溶液均勻地涂于試樣表面，用紅外燈烤干

8、，依次用同樣的方法將1%、2%或5%的火棉膠溶液涂于試樣表面，并烤干。（4）用透明膠帶緊貼火棉膠面，不能有氣泡，小心地將膠帶與復(fù)型膜一同揭下來，讓復(fù)型膜面朝上，將膠帶固定在載玻片上，做好標(biāo)記。（5）用真空鍍膜儀在復(fù)型膜面上蒸發(fā)上1020nm厚的碳膜。（6）用尖刀將想要觀察部分剪成略小于3mm銅網(wǎng)的小方塊，放入二甲苯溶液中，浸泡1小時使膠帶與復(fù)型膜分離。（7）用銅網(wǎng)將與膠帶分離的復(fù)型膜撈到醋酸異戊脂溶液中溶掉火棉膠。（8）待火棉膠完全溶解后，用3mm銅網(wǎng)撈出，晾干。萃取復(fù)型 定義：萃取復(fù)型是樣品制備中最重要的進展之一，其目的在于如實地復(fù)制樣品表面的形貌，同時又把細(xì)小的第二相顆粒（如金屬間化合物、

9、碳化物和非金屬夾雜物等）從腐蝕的金屬表面萃取出來，嵌在復(fù)型中，被萃取的細(xì)小顆粒的分布與它們原來在樣品中的分布完全相同，因而復(fù)型材料就提供了一個與基體結(jié)構(gòu)一樣的復(fù)制品。萃取出來的顆粒具有相當(dāng)好的襯度，而且可以在電鏡下做電子衍射分析。 萃取復(fù)型選擇的腐蝕劑要求能夠腐蝕并顯示基體組織形貌，但不能與萃取相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其腐蝕深度也較普通復(fù)型樣品的腐蝕深度要深些。碳萃取復(fù)型方法 按照一般金相試樣的要求對試樣磨削、拋光。 選擇適當(dāng)?shù)慕g劑進行深腐蝕，這種浸蝕劑既能溶去基體而又不會腐蝕第二相顆粒。 將試樣認(rèn)真清洗以除去腐蝕產(chǎn)物。 將試樣放入真空鍍膜機中噴碳，噴碳時轉(zhuǎn)動試樣以使碳復(fù)型致密地包住析出物或夾雜物。

10、 選擇適當(dāng)?shù)碾娊庖哼M行電解脫膜，電解脫膜時電流密度要適當(dāng)，電流過大形成大量的氣泡會使碳復(fù)型膜碎裂，電流過小則長時間脫不掉碳膜，適當(dāng)?shù)碾娏饕ㄟ^試驗確定。 將脫下的碳膜撈入新鮮電解液中停留10min左右，以溶掉帖在碳膜上的腐蝕產(chǎn)物。 將碳膜撈入酒精中清洗，最后用銅網(wǎng)撈起放到濾紙上干燥待觀察。萃取復(fù)型示意圖5.2.3薄 膜 法 薄薄 膜膜 法法：不僅可得到高分辨率圖像，顯示試樣內(nèi)部十分細(xì)小的組織形貌襯度，還可以獲得許多與試樣晶體結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息（如點陣類型、位向關(guān)系、缺陷組態(tài)等）。A 金屬樣品：雙噴電解減薄法、離子減薄法B 無機非金屬材料和導(dǎo)體礦物質(zhì)：離子減薄法C 高分子材料和生物試樣：超薄切片法5

11、.2.3.1 金屬薄膜樣品的制備 目前較普遍地被采用的金屬薄膜制備過程大體是： 線切割-機械研磨（或化學(xué)拋光）-化學(xué)拋光-電解拋光。具體方法如下：1.線切割線切割：用線切割機床從大塊樣品上切下0.2-0.3mm厚的薄片，一般多切幾片備用。2.機械研磨預(yù)減薄機械研磨預(yù)減?。簷C械研磨方法與金相試樣拋光過程基本一致，其目的是將線切割留下的凹凸不平的表面拋光并預(yù)減薄至100m左右。機械研磨具有快速和易于控制厚度的優(yōu)點，但難免產(chǎn)生應(yīng)變損傷和樣品升溫，因此，減薄厚度不應(yīng)小于100m，否則其損傷層將貫穿薄片的全部深度。 簡單的機械研磨可以產(chǎn)生大面積的薄區(qū)，但卻使樣品過于脆弱，很容易損壞，以我們的經(jīng)驗，一般S

12、i材料可以平磨到50m左右，對于脆性材料可適當(dāng)增加厚度。手工平磨時，應(yīng)采用不斷變換樣品角度，或者沿“8”字軌跡的手法可以避免過早出現(xiàn)樣品邊緣傾角。 如圖示： P1500P20001m金剛石膏金剛石膏 3.化學(xué)拋光預(yù)減薄化學(xué)拋光預(yù)減薄 化學(xué)拋光是一種快速的減薄過程。拋光液一般包括三個基本成分，即硝酸或雙氧水等強氧化劑用以氧化樣品表面。又以另一種酸溶解產(chǎn)生的氧化物層，此外還應(yīng)含有粘滯劑以作為溶解下來的原子進行擴散的介質(zhì)。 4.雙噴電解最終減薄雙噴電解最終減薄 經(jīng)過化學(xué)拋光預(yù)減薄的薄片可以沖成3mm的小試樣，剪成小塊試樣，然后將樣品放入雙噴電解拋光裝置的噴嘴之間進行最終的減薄處理。最后得到的是中心帶

13、有穿透小孔的薄片樣品，將樣品清洗干燥即可以直接在透射電鏡下觀察小孔周圍的透明區(qū)域。電解拋光的拋光液配法很多，最常用的是10高氯酸酒精溶液. 雙噴電解減薄工作原理雙噴電解減薄工作原理：試樣與鉑絲導(dǎo)線保持接觸作為陽極，電解液噴管中的一對鉑絲作為陰極，噴管對準(zhǔn)試樣的中心。電解液通過耐酸泵加壓循環(huán)。樣品中心逐漸減薄，直至穿透。洞口的邊緣為透射電鏡觀察的區(qū)域，厚度小于200nm。一般采用雙噴或者離子減薄。 這種方法主要用于金屬和合金樣品。 離子減薄儀的工作原理離子減薄儀的工作原理：在電場作用下氬氣被電離成帶Ar+的氬離子，帶著一定能量的氬離子從陽極飛向陰極，通過陰極孔，打在接地的樣品表面，使樣品表面濺射

14、，這就是氬離子轟擊的基本原理。 這種方法對于陶瓷、金屬等試樣都可以適用，是一種普適的減薄方法 。雙噴電解拋光裝置原理圖雙噴電解減薄儀離子減薄裝置原理示意圖金屬與非金屬薄膜制備工藝圖金屬與非金屬薄膜制備工藝圖500m80m3mm5m2.5mm5.3 超薄切片的基本操作程序 超薄切片是生物樣品制備方法中最基本、最常用的技術(shù)。制備超薄切片的過程包括兩個大的步驟： 第一步是制備組織包埋塊；第一步是制備組織包埋塊； 第二步是切塊。第二步是切塊。 高分子生物醫(yī)學(xué)材料超薄切片流程圖5.3.1 取材 取材-按“快、冷、小、凈、準(zhǔn)”的原則，在盡可能短的時間內(nèi)將1mm3的樣品放入 固定液。 快快 為了能觀察到盡量

15、接近生活狀態(tài)時的生物組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)，取材越快越好。 冷冷 盡量保持低溫下操作，使酶作用降低，減小對微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響。 小小 取材時，動作要輕巧，刀片要鋒利，組織塊要 1mm3 。否則固定液穿透不良。 凈凈 盡量少帶血液或組織液進入固定液。但切忌用水沖洗，可用緩沖液把表面血液或組織液沖掉。 準(zhǔn)準(zhǔn) 取材的部位要準(zhǔn)確。電子顯微鏡的放大倍率很高，觀察到的視野很小。為了避免由于取材不準(zhǔn)確而造成的一孔之見，要求取材要有一定的形態(tài)學(xué)實驗基礎(chǔ)。 定義定義：指用物理的或化學(xué)的方法手段迅速地殺死細(xì)胞，使組織細(xì)胞的形態(tài)盡可能地保存在接近其生活時的狀態(tài)。 目的：目的： 1.防止組織細(xì)胞離體后變化，防止自溶，以保持組織細(xì)

16、胞的成分和結(jié)構(gòu)與其生活狀態(tài)盡量一致。 2.在固定以后的漂洗、脫水和包埋等樣品處理過程中，保護樣品使其物質(zhì)不致溶解和流失。 3.使組織適當(dāng)?shù)挠不癁闃悠芬院蟮奶幚碜龊脺?zhǔn)備。 方法：方法： 有物理的和化學(xué)的固定法。其中化學(xué)的方法是最常用的固定方法。對于不同的樣品材料，以及不同的實驗?zāi)康膽?yīng)采取不同的固定方法。5.3.2固定 化學(xué)固定，化學(xué)固定，是用化學(xué)試劑使各種結(jié)構(gòu)成分形成不溶物，以免被水溶液與酯溶劑所提取。組織塊切小后，立即浸到大量固定液中。一般使用青霉素小瓶，每瓶放10-20塊組織，固定液2-4ml，置于4攝氏度固定2-4h或更長時間常用雙重固定或多重固定。一般常用的固定劑是戊二醛和鋨酸。一般常用

17、醛類固定液做預(yù)固定，經(jīng)過漂洗后再用四氧化鋨固定液后固定，以提高固定效果。 物理的方法物理的方法指用冷、熱或微波等物理方法對生物組織進行固定，是化學(xué)固定的輔助方法。冷凍固定和微波固定是較為常用的方法。 1.四氧化鋨和四氧化鋨固定液四氧化鋨和四氧化鋨固定液 四氧化鋨也被稱為鋨酸。實際上它既非電解質(zhì)，也不生成鹽，是強氧化劑。市售為安瓿狀的微黃色結(jié)晶，揮發(fā)性強，有強烈的刺激性氣味。該試劑較貴重，0.5g或1g包裝。四氧化鋨的毒性很強，它的蒸汽對眼角膜及鼻、喉粘膜具有毒性作用，使用時要注意防護作用，最好在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。 四氧化鋨固定液一般配置成2%的水溶液保存，臨用時加等量的緩沖液稀釋，使最終濃度為1%

18、，鋨酸不易溶解，配后要1-2天才能使用，而且應(yīng)該避光，貯存在冰箱內(nèi)。水溶液應(yīng)呈無色或淡黃色透明，若變成棕色則不能使用。優(yōu)點優(yōu)點： 它能與不飽和脂肪酸結(jié)合形成脂肪-鋨復(fù)合物固定脂類，與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)，因此能較好的保存組織細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)；雖然四氧化鋨不和單獨的核酸及糖類起反應(yīng)，但當(dāng)核酸糖類與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起時也能被固定，因此它幾乎能和所有的細(xì)胞成分結(jié)合；四氧化鋨電子密度高，能使被固定的組織產(chǎn)生良好的反差，本身起到染色的作用。而其它對緩沖液的要求不高。缺點缺點:1.它不能保護糖原不能固定核酸，對微管固定較差；2.四氧化鋨滲透組織很慢，所以組織塊要切的很小。當(dāng)組織塊大于1mm以上時，不能得到

19、完全固定。3.四氧化鋨不能保存酶的活性，因此不能用作細(xì)胞化學(xué)的固定劑。 2.戊二醛和戊二醛固定液戊二醛和戊二醛固定液戊二醛含有兩個醛基，30以上濃度的戊二醛易聚合，一般商品濃度在25以下，含有較多雜質(zhì)。新處理過的戊二醛為無色或很淡的黃色，貯存久時顏色會變深。由于戊二醛中的醛基易氧化為有機酸，使PH值下降。當(dāng)PH值下降到3.5以下時，就失去固定能力，需要純化。純化的方法有蒸餾及用活性炭處理等方法。醛類固定劑固定后，一般需要四氧化鋨進行二次固定，這就是廣泛應(yīng)用的雙固定方法。戊二醛固定劑具有下列優(yōu)點：1.它與蛋白質(zhì)交聯(lián)的能力是固定劑中最好的，也能固定糖原和核酸，對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如微管等保存也較好，并能保

20、存細(xì)胞內(nèi)一些酶的活性，因此是保存精細(xì)結(jié)構(gòu)最有效的醛；2.戊二醛的滲透速度比四氧化鋨要快些，且反應(yīng)快；3.戊二醛能夠彌補四氧化鋨固定劑的不足，對微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)有較好的固定作用，可以避免四氧化鋨做原始固定劑可能產(chǎn)生的抽提作用；戊二醛較適用于進行超微細(xì)細(xì)胞化學(xué)研究工作。 戊二醛固定的主要缺點為： 1.它不能固定脂質(zhì)，致使其在以后的脫水過程中被有機溶劑溶去，因而不適于作為單獨的電鏡固定劑； 2.戊二醛不像四氧化鋨那樣能提供高反差，因此與四氧化鋨復(fù)合使用，則可發(fā)揮兩種固定劑的長處，互相彌補不足之處； 3.戊二醛固定不影響細(xì)胞的滲透性，因此它對緩沖液及其滲透壓要求較高。 戊二醛通過交聯(lián)作用穩(wěn)定細(xì)胞

21、的結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞膜系統(tǒng)、糖原、核蛋白和細(xì)胞基質(zhì)的固定效果好。固定時溫度允許在4度至10度之間，固定的時間根據(jù)樣品而定。濃度一般用緩沖液配制成2-3%。 3.多聚甲醛和多聚甲醛固定液多聚甲醛和多聚甲醛固定液 多聚甲醛：電鏡樣品固定多用純化的多聚甲醛，為白色粉末。多聚甲醛經(jīng)水解后，解聚為甲醛溶液。多聚甲醛的優(yōu)點是能和蛋白質(zhì)、脂類、核酸等起反應(yīng)，并能保存部分細(xì)胞內(nèi)酶的活性；多聚甲醛的分子很小，因此穿透組織的能力很強，對固定致密的組織以及較大的組織尤其合適。此外，多聚甲醛價格便宜、使用方便。但甲醛只有一個醛基，反應(yīng)速度慢，與組織形成的交聯(lián)數(shù)目比戊二醛固定液少，導(dǎo)致甲醛固定液的微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存和組織反差不如

22、戊二醛固定液。所以，多聚甲醛固定液一般多用于組織化學(xué)或快速固定。在樣品前處理中，一般用多聚甲醛固定液作為前固定，以后再用四氧化鋨做后固定，能取長補短，效果好。也可與戊二醛同時進行混合固定，效果更好。 化學(xué)固定劑通常需用一定的緩沖液配制，緩沖介質(zhì)在固定時所起的作用為：使固定液維持穩(wěn)定的PH，使固定液有適當(dāng)?shù)臐B透壓，不使細(xì)胞收縮或腫脹；提供適當(dāng)?shù)碾x子成分，使細(xì)胞成分不被抽提或成點。用于電鏡固定液的緩沖介質(zhì)有多種，如磷酸緩沖液、二甲砷酸鹽緩沖液等。由于大多數(shù)動物組織的PH值為7.4，因此緩沖液的PH值選擇在7.4左右。緩沖液及其配制 磷酸緩沖液 它的優(yōu)點是便宜，無毒但缺點是久放易產(chǎn)生沉淀易遭到細(xì)菌的

23、污染。磷酸緩沖液的PH會隨溫度的變化而稍有變化，在PH7.5以下，它的緩沖能力很強，控制固定液的PH值比較有效。磷酸緩沖液常用于配制戊二醛固定液。 二甲砷酸鹽緩沖液 此溶液配制比較簡單，也比較穩(wěn)定，能保存，不易被細(xì)菌污染；但有一定毒性，配制時要小心，應(yīng)在防護罩內(nèi)進行配制。盡量不使試劑與皮膚直接接觸，避免呼吸道吸入。常用濃度為0.1mol/L。 醋酸巴比妥緩沖液 醋酸巴比妥液在電鏡技術(shù)的早期用來配制四氧化鋨，固定效果比磷酸緩沖液的效果好。此緩沖液緩沖能力較差，和醛產(chǎn)生作用后減弱緩沖能力，因此不能用來配制醛類固定液。此外，該緩沖液易于被細(xì)菌污染，不能長期保存。 4.影響固定效果的因素：影響固定效果

24、的因素： 固定是一種復(fù)雜的化學(xué)過程。固定液的PH、濃度、離子組成與滲透壓、固定時的溫度、時間與方式以及組織塊的大小等因素都能影響固定的效果。至今還沒發(fā)現(xiàn)一種固定液適合任何一種組織，因此在實際工作中就需要根據(jù)不同的組織選用恰當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汉凸潭l件。 固定液的固定液的PH 蛋白質(zhì)是一種兩性化合物，其相對分子質(zhì)量以及其它理化性質(zhì)與溶液的PH密切相關(guān)。固定液的PH將影響細(xì)胞中原生質(zhì)的組成、膜的選擇性及酶的活性。固定液的PH必須接近固定組織的PH，這樣可以使細(xì)胞避免由固定液所造成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化。固定液的濃度固定液的濃度 一般來說，較低的濃度需要較長的固定時間，這樣就容易引起酶的擴散、細(xì)胞物質(zhì)的抽

25、提及組織的腫脹。過高的固定濃度液是不合適的，因為濃的溶液毀壞酶的活性和細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)。尤其是氧化固定劑，如鋨酸和高錳酸鉀，只有在適當(dāng)?shù)臐舛认?，才是有效的交?lián)劑，較高的濃度就會造成蛋白質(zhì)分子的斷裂。含水較多的組織，一般需要較高的固定濃度。固定液滲透壓及離子組成固定液滲透壓及離子組成。 一般來說，低滲的固定液容易引起組織膨脹，而高滲的固定液容易造成組織的收縮。為了調(diào)節(jié)固定液與組織的滲透壓平衡，固定液中常加入鉀、鈉、鈣鹽等電解質(zhì)或葡萄糖、蔗糖等非電解質(zhì)。固定的溫度和時間固定的溫度和時間 為了降低酶的活性、減少細(xì)胞自溶及胞內(nèi)物質(zhì)的抽提，大部分組織通常是在0-4攝氏度下固定1-4h，但細(xì)胞中的微管與微絲

26、應(yīng)在室溫下固定。由于化學(xué)固定所引起的物質(zhì)的抽提是隨時間逐漸進行的，因此，過度的固定可能丟失更多的物質(zhì)。組織塊的大小組織塊的大小 固定作用通常是不均勻的，從組織塊的表層到深部，存在著固定梯度。表層有高濃度的鋨的沉積，但這一層的機械損傷較大；中心部位無機械損傷但往往固定不足。因此，在這兩層之間的那一部分組織是比較理想的。一般來說，鋨酸的均勻固定大約在0.25mm的深度，因此組織塊的大小最好在0.5mm3左右。固定是標(biāo)本制備過程中及其關(guān)鍵的一步，也是復(fù)雜的化學(xué)過程。其中的每個因素都會影響固定的效果。5.3.3 漂洗與脫水 組織固定后，應(yīng)用漂洗液洗去殘留的固定液，尤其是醛類固定液固定后，一定要充分漂洗

27、干凈，一般需漂洗5次以上，漂洗時間為2h或過夜。這是因為醛會和鋨酸起反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)而致密的顆粒沉淀在樣品中，既影響鋨酸的固定作用，又會造成樣品污染。此外，由于鋨酸亦和乙醇作用，產(chǎn)生沉淀，因而用鋨酸固定后，也應(yīng)把多余的鋨酸固定液漂洗掉，但洗的時間可以短些，10-15min即可。常規(guī)電鏡樣品中所用的漂洗液一般是0.1mol/l磷酸緩沖液，其溫度與固定液溫度一致，為4度。 大多數(shù)生物樣品中水分的比例很高，達(dá)70-80%以上，而水中又有85-90%為游離態(tài)水，再加上包埋劑多為水不溶性物質(zhì)，因此，如果包埋前不徹底除去樣品中的游離態(tài)水將影響包埋塊的質(zhì)量。單純的烘干會使樣品收縮變形，并破壞其超微空間結(jié)構(gòu)，所以

28、要進行脫水。 脫水劑包括甲醇、乙醇、丙酮、乙二醇等，最常用的為乙醇。一般用乙醇脫水時，其梯度濃度為30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%兩次，每部10-15min。另外，70%以前需要在4度操作，80%以后轉(zhuǎn)至室溫。 如果選用環(huán)氧樹脂包埋，用乙醇脫水后，最好再用環(huán)氧丙烷處理20-30分鐘，以置換出樣品中的乙醇。因為乙醇與環(huán)氧樹脂不能很好的混溶，可能會影響包埋塊的質(zhì)量。 脫水l脫水劑的梯度幅度和每步脫水的時間都有講究，梯度過大，速度過快會使樣品樣品收縮收縮，而脫水劑的濃度在70%以前時，每步脫水的時間過長會使樣品膨脹過長會使樣品膨脹；在95%以后每步脫水的時間過長會使樣品收縮；

29、只有在70%時，因為與生物樣品的滲透壓相似，可停留較長時間。l脫水過程中應(yīng)注意兩點：一是脫水要充分，脫水不完全會導(dǎo)致滲透不完全，造成切片困難，還會引起組織和細(xì)胞受損；二是更換脫水劑是動作要快，尤其是換無水乙醇時，不要使樣品干燥，否則樣品內(nèi)易產(chǎn)生小氣泡而影響包埋劑的浸透。 組織塊在脫完水后，要用一種常溫下為液態(tài)、經(jīng)過加溫聚合后有一定硬度的介質(zhì)對其進行處理，使處理后的組織有適當(dāng)?shù)挠捕群土己玫那懈钚阅?。這種介質(zhì)就稱為包埋劑。通過脫水劑稀釋包埋劑，并最終以包埋劑完全取代脫水劑，使其滲透到組織塊中的過程就是浸透。而將浸透好的組織塊放在適當(dāng)磨具中并灌入包埋劑，再加溫聚合成硬塊的過程就是包埋。5.3.4浸透

30、與包埋 浸透的目的和方法：浸透的目的是用包埋劑逐步替代浸入樣品內(nèi)部的脫水劑，以填充樣品超微結(jié)構(gòu)的各個空間。 包埋的目的： 經(jīng)過脫水和浸透的樣品還不能直接進行超薄切片，還需要用某種在一定條件下能聚合成硬塊的單體樹脂，來填充樣品的各個空間，把這一過程稱為包埋。 聚合：有加溫聚合、降溫聚合、快速聚合、或慢速聚合、普通光照聚合或紫外光照聚合。 理想的包埋劑應(yīng)具備以下特征：理想的包埋劑應(yīng)具備以下特征： 處于液態(tài)時粘度小、易滲透； 固化后既不膨脹也不收縮，并有一定的機械強度，有助于保存樣品的超微結(jié)構(gòu)和制備超薄切片。并在電子束的轟擊下性能穩(wěn)定，不升華、變形和斷裂，并且不干擾樣品本身的而超微結(jié)構(gòu)有良好的電子透

31、過性。 常用的包埋劑有環(huán)氧樹脂包埋劑、聚酯樹脂包埋劑和甲基丙烯酸脂包埋劑。國內(nèi)常用的為國產(chǎn)環(huán)氧樹脂618、Epon812及低粘度Spurr環(huán)氧樹脂。 環(huán)氧樹脂為熱塑性樹脂，是淡黃色或蜜黃色的液體。分子中有兩種化學(xué)反應(yīng)基團，即環(huán)氧基和羥基。末端環(huán)氧基易打開，與其它含有活性氫原子的化合物如胺類形成首尾相接的長鏈狀聚合物。 能夠促進末端相接的交聯(lián)劑叫做催化劑或加速劑催化劑或加速劑，它們能催化聚合反應(yīng)，而本身并不加入到樹脂鏈中。 此外，單體中的羥基能和酸酐結(jié)合形成分子間的橫橋連接。這種起橫橋式連接作用的交聯(lián)劑叫做硬化劑或固化硬化劑或固化劑，它們參與交聯(lián)反應(yīng)并被吸收到樹脂鏈中。因此，環(huán)氧樹脂單體、胺類、

32、和酸酐三者按照一定的比例混合，在一定溫度下可形成具有三維空間結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定的抗熱和抗溶的交聯(lián)狀聚合物。浸透和包埋的具體操作(一) 浸透組織塊在用乙醇和無水丙酮或環(huán)氧丙烷脫水后，用包埋劑與與環(huán)氧丙烷按照一定比例混合，逐漸滲透入組織塊，取代乙醇。因為包埋劑的黏度要比脫水劑大得多，所以要用環(huán)氧丙烷與包埋劑配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐漸增加，以提高樣品的質(zhì)量。環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹脂類的包埋劑較好的混溶，也有助于達(dá)到逐級浸透的目的。浸透液的配置和使用方法如下：環(huán)氧丙烷：包埋劑=3：1 （V/V） 3060分鐘環(huán)氧丙烷：包埋劑=1：1 （V/V） 3060分鐘環(huán)氧丙烷：包埋劑=1：3 （V/V） 306

33、0分鐘100%包埋劑 1-2h注：在室溫或是30-35度下浸透，必要時用慢搖床提高浸透的效果。浸透的時間可以靈活的掌握。 浸透完成后就要進行包埋。操作：取要用空心膠囊或特制的錐形塑料囊或多孔橡膠模板作包埋塊的模子。包埋前先將膠囊或模板置于60度溫箱中1-3h烘干；包埋時，先在膠囊中滴一滴包埋劑，再將組織塊用牙簽挑至膠囊中，然后注入包埋劑?；蛳葘⒛z囊注滿包埋劑，再用牙簽挑起組織塊放在膠囊的液面中心，讓組織塊自然沉淀，然后進行聚合。 使用不同的包埋劑，制備不同的樣品，需要的聚合條件不同。有加溫聚合、降溫聚合、快速聚合或慢速聚合、普通光照聚合或紫外光照聚合。環(huán)氧樹脂618、Epon812可置于37度

34、烤箱中12h或過夜，60度36-48h，亦可直接放入60度溫箱中聚合，時間為1-2d；Spurr樹脂放在70度溫箱8h即可?？傊?，要使包埋劑完全聚合，才能有均勻的硬度否則會到導(dǎo)致切片困難。5.3.5包埋及聚合硬化包埋操作中應(yīng)注意以下幾點：(1)所有試劑要防潮，最好存放在干燥器中；(2)所用器皿應(yīng)烘干；(3)配包埋劑時，每加入一種試劑要攪拌均勻；(4)包埋時動作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；(5)皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；(6)盛放過包埋劑的容器要及時用丙酮清洗干凈。 常用包埋模具常用包埋模具5.3.6修塊與半薄切片定位 修塊：是成功切出理想連續(xù)切片的關(guān)鍵。通常采用手工修塊，將已聚合的環(huán)氧樹

35、脂包埋塊放入專用的樣品夾中，在解剖鏡下用單面刀片修去其頂端和組織周圍多余的包埋介質(zhì)，暴露出的表面積小于0.1mm2和低于0.2mm的小方臺，修完后呈金字塔形。 定位:由于超薄切片的面積極小，為了在電鏡觀察時容易找到所希望觀察的部位，進行超薄切片前必須進行定位。半薄切片定位利用超薄切片機切厚度為1m-10m的切片，稱厚切片或半薄切片。將切下的片子用鑷子或吸管轉(zhuǎn)移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經(jīng)甲苯 胺 藍(lán) 染 色 ， 光 學(xué) 顯 微 鏡 觀 察 定 位。標(biāo)本修塊標(biāo)本修塊 半薄切片進行光學(xué)顯微鏡觀察的目的：(1) 定位：通過光學(xué)顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然后保留要

36、用電鏡觀察的部分，修去其余部分。(2)便于對同一組織的同一部位進行光學(xué)顯微鏡和電鏡的對比觀察。半薄切片定位以后，要對包埋塊作進一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形，每邊的長度為0.2mm0.3mm。5.3.7超薄切片 包埋塊修整好后就進入超薄切片階段了。要獲得高質(zhì)量的電鏡照片，切片必須是超薄的，厚度均勻，表面平整，無震顫、無皺褶和破裂，且能耐受高真空和電子束的轟擊。 超薄切片機是用來將已包埋在環(huán)氧樹脂中或已冷凍固定的生物樣品制成納米級厚度薄樣品的專業(yè)機器。超薄切片機從進刀原理構(gòu)成上可以分為兩大類：一類是以熱膨脹為主的切片機，利用金屬桿熱脹或冷縮時產(chǎn)生的微小長度變化來提供

37、推進。一類是以機械推進式為主的切片機，用微動螺旋和微動杠桿微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進。 70年代前生產(chǎn)的為熱膨脹式，80年代開始向機械推進式過度，目前的超薄切片機大多數(shù)為機械推進式。1.熱膨脹式超薄切片機 ：以LKB的系列產(chǎn)品為代表，該類超薄切片機的進刀控制由對熱極為敏感的金屬材料控制，當(dāng)對其進行加熱時，該金屬規(guī)則膨脹，使切片機刀口緩緩向前推進，由于該種超薄切片機對溫度極為敏感，所以在超薄切片的時候，對切片室的溫度穩(wěn)定性要求極高，溫度變化大，易造成切片不穩(wěn)定，切片厚度不易控制。因此在切制50nm以下的生物樣品及用鉆石刀切片時，最好不用。2.機械推進式超薄切片機：以萊卡系列產(chǎn)品為代表，該類

38、型超薄切片機的進刀以機械推進機械推進的方式進行。由于采用了高精度的機械推進裝置，使進刀的穩(wěn)定性大大提高，摒棄了熱膨脹式超薄切片機由于溫度不穩(wěn)定而帶來的切片質(zhì)量不易控制的缺點，如再配合使用鉆石刀，則超薄切片的質(zhì)量能夠達(dá)到理想的程度。目前超薄切片機的類型基本上以機械推進式為主流。Leica EM FC6 冷凍超薄切片機 超薄切片使用的刀有兩種，可選用鉆石刀或玻璃刀。鉆石刀的質(zhì)量好，不用特意制備，市售有多種型號供選擇，經(jīng)久耐用，切片時容易對刀和切出優(yōu)良的連續(xù)切片，特別適宜質(zhì)地硬的樣品。但其價格昂貴。玻璃刀臨用之前制作，刀刃易脆裂，通常一把刀切一個樣品就得廢棄，且適宜質(zhì)地較軟的樣品，但價格相對便宜的得

39、多。這里講的制刀指的是用制刀機制備玻璃刀的方法。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃，厚度為5mm6.5mm。制刀制刀 玻璃刀用制刀機制作。制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有塑料水槽和膠布水槽兩種。塑料水槽有固定的形狀，可反復(fù)使用。膠布水槽是臨時用膠布或?qū)Ｓ盟芰蠗l制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟封固接口，防止漏水。刀槽刀槽刀的檢查和保護刀的檢查和保護：明顯的劣質(zhì)刀是出現(xiàn)雙刀跟（即無刀鋒）、刀緣突起、刀緣凹陷或刀緣上有明顯的裂損等，這樣的刀不能用。為了減少切片時的麻煩，有必要先檢查刀緣是否有用肉眼不易看出的微小的損傷，及時淘汰劣質(zhì)玻璃刀。方法是把刀安放在切片機的刀架上，打

40、開白熾燈，在顯微鏡下觀察刀緣，如果刀緣成一條暗線（尤其是在刀緣的左側(cè)1/3段內(nèi)），說明其鋒利無損。如果刀緣上有許多反光的亮點，說明有小的裂損。用這樣的刀切片，k肯定有劃痕，因此棄之不用。為了保護刀緣，制刀和切片過程中絕對不能用任何異物去碰，并且最好現(xiàn)做現(xiàn)用，以免因放置過久，空氣的氧化作用使刀緣失去鋒利。玻璃刀玻璃刀超薄切片的步驟包括：超薄切片的步驟包括：(1)安裝包埋塊；(2)安裝玻璃刀；(3)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；(4)預(yù)切片；(5)換切片刀重新調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；(6)調(diào)節(jié)切片厚度及切片速度，切片；(7)將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。 由于超薄切片切下的片子很薄，很難測量其厚度，因此，一般

41、利用切片表面反射的光和從切片下面反射光所產(chǎn)生的干涉色來判斷切片厚度，厚度不同的切片在顯微鏡下呈現(xiàn)的干涉色也不同。用樹脂包埋的切片，其干涉色與厚度的關(guān)系如下： 灰色：40-50nm；銀白色：50-70nm；金黃色：70-90nm；紫色：90nm以上。切片中可能出現(xiàn)的問題和解決的方法 產(chǎn)生問題的原因：切片的質(zhì)量往往受到諸多因素的影響，切片中很可能會出現(xiàn)各種各樣的問題，特別是有關(guān)切片質(zhì)量的問題。如：切片開裂、切片過厚（表面的干涉光五顏六色）、切片上有一行行的平行排列的條紋或縱行的劃痕、切片不能連續(xù)成串等。原因有以下幾種，應(yīng)具體分析： A影響包埋塊質(zhì)量的因素-包埋劑是否混合均勻，聚合的時間溫度是否合適

42、、樣品滲透是否充分等 B 切片準(zhǔn)備工作方面的因素-修快是否規(guī)范，刀口是否鋒利，水槽的制作是否規(guī)范等 C 切片過程中的某些因素-刀角的選擇，可能過大或過小，刀和樣品的安裝是否牢固和標(biāo)準(zhǔn)，切速過快過慢，對刀是否規(guī)范等 D 其它方面的因素-附近是否有大型機械振動源，電壓是否穩(wěn)定，室溫是否過高或過低等。 可能出現(xiàn)的問題和相應(yīng)的措施： A 切片上有顫紋：這是切片時最常出現(xiàn)的問題之一，其表現(xiàn)為切片上布滿平行于刀緣的條紋，或粗或細(xì)，疏密不一。這是在切片過程中有震顫引起的。下表介紹了產(chǎn)生震顫的原因和解決的辦法。原因解決的辦法 樣品塊太軟把已修好的樣品放在100度烤箱里再烤1-2h，重新包埋，適當(dāng)加大硬化劑的比

43、例如：MNA，改變聚合條件如：延長時間或提高溫度樣品塊太硬重新包埋，適當(dāng)加大軟化劑比例如：DDSA，改變聚合條件如：縮短時間或降低溫度等?；蚋挠勉@石刀 修塊面積太大重新修塊， 切片面積小于0.1mm3為宜 樣品固定不穩(wěn)檢查并旋緊樣品臂上所有與固定樣品有關(guān)的螺鈕 刀固定不穩(wěn)檢查刀背是否緊貼刀架，檢查并旋緊所有固定刀的螺鈕 切片參數(shù)不適重新調(diào)整刀角和切速等 其它檢查周圍是否有大的震動源如：機械馬達(dá)，人為碰撞切片機臺面等 B 切片破碎：切片破碎是不宜撈取的，不完整的片子在電鏡觀察時往往也得不到良好的圖像。其原因和解決的辦法如下：切片表面凹凸不平-用手動切片重新修塊，直到切下完整的片子為止包埋塊脆-重

44、新包埋，嚴(yán)格按照配方比例，并充分?jǐn)嚢璋駝┖瓦m當(dāng)延長滲透時間。另外，脫水不徹底也會使包埋塊脆并有許多小空洞，有時甚至在修塊時就能看到大大小小的空洞。一般對于這樣的包埋塊就廢棄了，并在重新包埋時注意嚴(yán)格脫水，在攪拌包埋劑時應(yīng)盡量減少氣泡的產(chǎn)生，并靜置一段時間，使氣泡排掉之后再用。C切片不能連成帶：有的研究工作需要觀察連續(xù) 切片，如果切下的片一個一個都散開就無法撈片，其原因可能如下：原因解決的辦法對刀不良重新對刀，使樣品頭上下邊緣和刀緣平行修塊不標(biāo)準(zhǔn)重新修塊，使樣品頭表面至少有兩條對應(yīng)相互平行，并使平面的邊緣整齊筆直 刀鈍換刀緣或換刀，使落片順暢 水槽液面不平用注射器點滴或吸取，調(diào)整過低或過高的液

45、面，使液面與刀緣持平 D切片厚薄不勻：同一張切片有厚有薄的表現(xiàn)是切片的干涉色不一致，即有深有淺或五顏六色，這將直接影響成像的質(zhì)量。切片上有空脂-重新修塊；立體鏡下示透亮的區(qū)域為空脂，即指沒有樣品結(jié)構(gòu)的區(qū)域?？瞻装窠橘|(zhì)與有樣品結(jié)構(gòu)的區(qū)域的硬度是不一致的，因此用同一硬度的刀切片時，會導(dǎo)致切片的厚薄不均，解決的辦法是在重新修塊時去掉空白區(qū)。刀緣的銳度不一致-調(diào)整刀緣或換刀。當(dāng)?shù)毒壍牟煌瑓^(qū)域的銳度不一致時，刀緣銳利的部分切出的片子薄，反之則厚。E其它：切片帶水-指樣品塊頭部和刀背上沾水，使無法正常切片。解決的辦法是用干凈的濾紙條吸掉，但要注意操作時切勿碰刀緣，如果是水槽液面太高引起的，就需要重新調(diào)整

46、一下液面?？涨?切片時只有樣品臂上下運動，卻見不到有片下來的情況稱為空切。引起空切的原因可能是對刀不準(zhǔn)，距樣品太遠(yuǎn)或樣品面與刀緣不平行。也可能是加熱不足或切速過快等。水面干涉色消失-有時在切片過程中，本來已經(jīng)調(diào)好的乳白的干涉色水面會緩緩消失，變成一片片黑影，使無法觀察切片。其原因是水槽的液面下降了，這可能使由于切片過程太長、水分揮發(fā)和連續(xù)撈片損失引起的；也可能使由于水槽漏水引起的。5.3.8 電子染色 生物樣品的化學(xué)成分主要是C、H、O、N等原子序數(shù)低的元素，再加上透射電鏡要求樣品先制成超薄切片（100nm左右），所以生物樣品對電子的散射能力很小，圖像反差很低。為了提高生物樣品的反差，首先要設(shè)

47、法增加其對電子的散射能力。選用重金屬鹽類進行電子染色可以達(dá)到這一目的。 超薄切片的染色指的是用重金屬鹽溶液處理樣品使其與細(xì)胞中某些特定成份結(jié)合或吸附在某些特定的結(jié)構(gòu)上。常用的重金屬：鋨、鎢、鉛、錳等。因它們對生物樣品中的不同組分有不同程度的結(jié)合力，因此樣品中結(jié)合重金屬鹽的區(qū)域?qū)﹄娮拥纳⑸淠芰σ矔煌潭鹊脑鰪?，使電子圖像顯示深淺不一的黑白色。這樣既增強生物樣品的反差，又增加了成像的層次，從而大大提高了電子顯微圖像質(zhì)量。 鈾鹽：常用醋酸雙氧鈾配制電子染色劑。醋酸雙氧鈾為熒光黃色粉末，再15度時飽和溶液的的濃度為7.7，用50或70的乙醇配制可提高溶解度。它能發(fā)射熒光，有微量放射性，所以應(yīng)用時應(yīng)格

48、外小心。染色時需避免強光照射，并且用棕色瓶子壁光保存。它的染色效應(yīng)是通過雙氧鈾離子與樣品中的生物分子基團結(jié)合而實現(xiàn)的。生物分子基團能夠提供一對電子，因而能于金屬離子相結(jié)合，形成金屬復(fù)合物。一個雙氧鈾離子能與一個或多個生物分子基團相結(jié)合，形成不同的金屬復(fù)合物。而雙氧鈾離子與羧基和磷酸基的親和性較強，對富含這樣結(jié)構(gòu)的物質(zhì)有廣泛而明顯的染色效果，如：脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織等。 鉛鹽：常用檸檬酸鉛（枸櫞酸鉛）配制電子染色劑。 其染色原理：與樣品中不同的活性基團的反應(yīng)機制不同，但鉛鹽的染色效應(yīng)是一種離子結(jié)合反應(yīng)，即鉛離子與活性基團的反應(yīng)。染液中的檸檬酸鈉的作用是螯合溶液中的鉛離子，并形成穩(wěn)定的絡(luò)

49、合物。這樣既減少碳酸鉛沉淀的形成，又能將鉛離子帶入樣品。在樣品中鉛與某些陰離子活性基團相結(jié)合，達(dá)到染色的目的。細(xì)胞核與核蛋白顆粒對鉛離子的親和力強，而糖原較差。 染色方法：常規(guī)超薄切片中常用的是醋酸鈾枸櫞酸鉛雙染法。 將1片潔凈的牙科蠟片放在培養(yǎng)皿中，滴一滴過濾的醋酸鈾染液到蠟片上，再將帶有切片的載網(wǎng)覆蓋在染液上，使有切片的一面與染液接觸，染色時間30min，染好后用水將切片洗凈洗干，再覆蓋在用同樣方法的在另一潔凈蠟片上的鉛染液上，有切片的那一面與染液接觸。鉛染色時應(yīng)嚴(yán)格控制染色時間5-7min即可，防止過染。同時應(yīng)盡量減少暴露愛空氣中的時間，并可在培養(yǎng)皿的周圍放些氫氧化鈉結(jié)晶，以免鉛染液與空

50、氣中的二氧化碳形成沉淀，污染切片。超薄切片染色步驟超薄切片染色步驟超薄切片法流程 取材-按“快、小、輕、準(zhǔn)、冷”的原則，在盡可能短 的時 間內(nèi)將1mm3的樣品放入 固定液。 前固定-2 % -5%戊二醛，1小時 4冰箱保存 清洗（1）-磷酸緩沖液 10-15分鐘，3次。 后固定-1%鋨酸1-2小時, 4冰箱保存。 清洗（2）-同清洗（1） 脫水-酒精/丙酮梯度脫水：50%、70%、80%、90%，各10-15分鐘/次，100%，10-15分鐘/2次 。 浸透-包埋劑浸透3小時（可過夜）； 包埋-用包埋劑將樣品包埋在膠囊或包埋板里； 聚合-置烤箱：37，24小時；45，24小時； 60，24小時

51、； 超薄切片-用超薄切片機將樣品切成厚約50nm 的超薄切片； 電子染色-醋酸鈾30-40分鐘，檸檬酸鉛30分鐘； 電鏡觀察透射電鏡樣品制備程序透射電鏡樣品制備程序5.4 冷凍超薄切片冷凍超薄切片技術(shù)是在光學(xué)顯微冷凍切片和電鏡超薄切片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。由于常規(guī)超薄切片技術(shù)中應(yīng)用化學(xué)固定、有機溶劑脫水、樹脂包埋等一系列處理，均可使生物樣品受到物理和化學(xué)性損傷，引起組織和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子變性，大部分可溶性成分及某些生物大分子物質(zhì)被抽提或發(fā)生移位。為了彌補這些缺陷，人們創(chuàng)造了冷凍超薄切片技術(shù)。70年代后，出現(xiàn)商品冷凍超薄切片裝置，使該技術(shù)有了更大發(fā)展。與普通的切片機相比，冷凍超薄切片的樣品更富有真

52、實性，它不會因為脫水而損失某些成分；也不會與包埋劑發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)；更不會因為熱聚合而使超微結(jié)構(gòu)變形。目前，此技術(shù)可在分子水平上研究新鮮生物樣品的超微結(jié)構(gòu)、各種生物大分子和某些元素在細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)，并在細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡、X射線微區(qū)分析及可溶性物質(zhì)放射自顯影研究等方面發(fā)揮巨大作用。 它的特點是用新鮮的材料直接冷凍固定，無需進行脫水、滲透、包埋與聚合等一系列繁瑣的程序。但要在冷凍之前進行預(yù)固定和冷凍保護處理，然后用冷凍超薄切片機進行切片。冷凍超薄技術(shù)的難點是在樣品制備過程中容易造成冷凍損傷和干燥損傷等，大大降低樣品的價值。因此，人們先后研究了多種冷凍保護劑，如：甘油、二甲基亞砜、高濃度的蔗糖等

53、。 一般冷凍超薄切片樣品的制備包括取材、冷凍保護、冷凍固定、冷凍超薄切片、冷凍干燥、染色等。 冰晶損傷是冷凍樣品制備技術(shù)最容易產(chǎn)生的缺陷。它是由樣品中的游離態(tài)水分凍結(jié)而造成的一種樣品結(jié)構(gòu)的損傷，主要是由于冷凍速率不足引起的。一方面，冷凍速率不足時，細(xì)胞外的介質(zhì)先結(jié)冰，形成冰晶（晶核），并以此為中心再吸收周圍的水分，使冰晶逐漸增多。這種吸收作用使細(xì)胞內(nèi)游離態(tài)的水逸出，造成細(xì)胞受損，最終導(dǎo)致結(jié)構(gòu)斷裂變形。另一方面，當(dāng)冷凍速率比前者高些，但仍不足夠高，雖然細(xì)胞外介質(zhì)中的水分與細(xì)胞內(nèi)的游離態(tài)的水都結(jié)冰了，細(xì)胞內(nèi)的游離水不會逸出，但由于冷凍速度不足而形成了冰晶，從而導(dǎo)致細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)斷裂變形。一般冷凍速

54、率不足的主要原因是冷凍的溫度過高。當(dāng)溫度在-140度-70度時，水結(jié)晶的形狀為立方形或六角形結(jié)晶，當(dāng)樣品中存在結(jié)晶狀的冰時，必然導(dǎo)致樣品本身精細(xì)結(jié)構(gòu)的損傷，冰晶損傷就是這樣形成的。解決的辦法是選擇優(yōu)質(zhì)冷凍劑和使用高效冷凍裝置。冷凍保護的意義冷凍保護的意義： 另一個原因是樣品過大，使深層區(qū)的細(xì)胞冷凍速率變慢，因而易遭受冰晶損傷。解決的辦法是盡量減小樣品的體積。最佳的冷凍效果是冷凍速率足夠大（大于冷凍速率足夠大（大于1000度度/秒），冷凍溫度足夠低（秒），冷凍溫度足夠低（-160度以下），使細(xì)度以下），使細(xì)胞中游離態(tài)水迅速形成無定形水，而細(xì)胞中與蛋白質(zhì)胞中游離態(tài)水迅速形成無定形水，而細(xì)胞中與蛋白

55、質(zhì)或脂肪結(jié)合的結(jié)合態(tài)的水卻不結(jié)冰。或脂肪結(jié)合的結(jié)合態(tài)的水卻不結(jié)冰。這樣的冷凍效果既可以保存樣品中超微結(jié)構(gòu)，又可以保存樣品中的許多生物大分子和酶的活性，因而，對細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡、放射自顯影和X射線微區(qū)分析等方面的研究都非常有利。除了用優(yōu)質(zhì)冷凍劑和減小樣品體積之外，防止冰晶損傷的一個有效的方法是在冷凍之前對樣品進行冷凍保護。 用生物樣品做冷凍超薄切片的取材原則是快、準(zhǔn)、小，樣品越新鮮越好。但生物樣品含水量高，如果不經(jīng)冷凍保護，即使樣品塊已足夠小，在冷凍固定和冷凍超薄切片的過程中仍易形成冰晶而破壞樣品的超微結(jié)構(gòu)。有多種保護劑，如：甘油溶液、二甲基亞砜溶液、高濃度蔗糖溶液等，根據(jù)樣品的情況選擇冷凍保

56、護劑。一般組織的含水量越高，所需冷凍保護劑的濃度也越高，因為這樣能保證冷凍固定時達(dá)到“玻璃化”而不產(chǎn)生冰晶。以達(dá)到冷凍保護的目的為前提，用冷凍保護劑處理的時間可依樣品的要求而定，一般從10min到幾個小時不等。其實，冷凍保護的原理是，用高濃度的冷凍保護劑處理生物樣品之后，樣品中所含的游離態(tài)的水與冷凍劑結(jié)合，使樣品中液體的濃度提高，與此同時就降低了樣品的冷凍點，這與鹽水不易凍結(jié)的道理是一樣的，其結(jié)果是防止樣品中形成冰晶。取材與冷凍保護 有時還可以在冷凍保護之前先對樣品進行預(yù)固定，以提高樣品結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。常用醛類做預(yù)固定劑。根據(jù)研究的目的和材料來選擇預(yù)固定劑和固定的條件。一般研究超微形態(tài)學(xué)可以選用

57、2.5的戊二醛溶液，4攝氏度下固定1560分鐘。 直接冷凍固定含水分高的新鮮生物樣品時，即使選擇最佳固定條件，也難使樣品完全達(dá)到玻璃化而無冰晶損傷。一般固定效果理想的區(qū)域只是從樣品表面算起約10微米以內(nèi)深度的那部分。因此，為了提高冷凍固定的質(zhì)量，可先選用金屬鏡冷凍固定法，使樣品的內(nèi)表面平整，再于低溫條件下，用預(yù)冷的修塊刀將樣品平面整修出一個小平面，面積約有0.2mm，然后再進一步冷凍固定。如果樣品需要預(yù)固定，則可以在預(yù)固定的過程中，用鋒利的刀片將樣品的頭部切成方形或梯形，冷凍固定時注意把修好的那面調(diào)節(jié)到切片的位置上，使切片平整且大小適宜?？焖倮鋬龉潭?冷凍超薄切片質(zhì)量的好壞直接決定于快速冷凍效

58、果。常用的快速冷凍方式有二： 一是液氮直接冷凍； 二是金屬接觸冷凍。后一種方法較好，即將銅塊先置于液氮中，待溫度平衡后，將樣品與銅塊接觸510秒鐘，以達(dá)到快速傳導(dǎo)降溫的目的，然后再將樣品置于液氮中待用。 有很多冷凍固定裝置，目前常用的有KF80冷凍固定裝置、KF80.MM80金屬鏡冷凍固定裝置和MM80E金屬鏡冷凍固定裝置。 冷凍樣品的保存：當(dāng)冷凍固定的樣品一時用不完時，可以保存一段時間，保存方法有以下幾種： 將樣品放在冷凍超薄切片機的樣品托上，一同進入液氮罐。 將樣品放入一個微孔小金屬籠中，扣緊蓋，浸入液氮罐中?；\子上系上金屬絲，標(biāo)上樣品名稱，并用蓋壓住金屬絲，需要樣品時提出來即可 將樣品暫

59、存在緩沖液或醛類固定劑中。 用這些方法可以保存樣品若干星期或幾個月。 冷凍超薄切片(1)冷凍超薄切片機：該機是在固有型超薄切片機基礎(chǔ)上附加低溫操作裝置組成的。常用的機型是配以LKBCryoKit冷凍裝置的瑞典LKB型(或型)超薄切片機。該裝置包括：冷凍室、冷凍刀臺、冷凍樣品頭、存放液氮的杜瓦瓶及溫度和液氮水平控制器等。冷凍室是一個具有絕緣性能的塑料箱。它將冷凍刀臺和冷凍樣品頭罩在其內(nèi)。刀臺、樣品頭分別有管道與杜瓦瓶相通，并通過管道不斷向它們輸送液氮；在刀臺和樣品頭內(nèi)有溫度傳感器及加熱裝置，有盛放致冷劑的容器，容器內(nèi)還有致冷劑水平感受器。當(dāng)用液氮作致冷劑時，其樣品頭溫度可控制在-70-170，刀

60、溫控制在-70-150。溫度傳感器是由溫度及液氮水平控制裝置進行自動調(diào)節(jié),其調(diào)節(jié)過程是向刀臺和樣品臺的致冷劑容器中灌滿液氮。若將控制裝置的溫度選擇在-100的位置，刀臺和樣品頭的溫度下降到-100以下，則傳感器即給控制裝置發(fā)出溫度下降的信息，控制裝置即可通過加熱器產(chǎn)生補償?shù)募訜犭娏鳎沟杜_與樣品頭的溫度保持在-100的狀態(tài)。在切片過程中，由于液氮的不斷消耗，致使容器中的致冷劑不斷減少而液面下降，容器中的白金電阻器可感受液氮量的變化。當(dāng)液面低于預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)時，白金電阻器即可引起杜瓦瓶中的加熱器工作以提高瓶中的壓力，使瓶中的液氮向致冷劑容器中流動，直至容器中的液面又恢復(fù)到原來的水平為止。 冷凍超薄切片