DNA的生物合成和損傷修復(fù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1DNA的生物合成和損傷修復(fù)的生物合成和損傷修復(fù)第一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。DNA生物合成生物合成DNA復(fù)制復(fù)制 （DNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA合成合成）逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 ( (逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA合成合成)校正復(fù)制中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤，并修復(fù)受到損傷的校正復(fù)制中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤，并修復(fù)受到損傷的DNA細(xì)胞中酶促修復(fù)系統(tǒng)細(xì)胞中酶促修復(fù)系統(tǒng)自然界自然界DNADNA重組和基因轉(zhuǎn)移的基本方式重組和基因轉(zhuǎn)移的基本方式第1頁(yè)/共146頁(yè)第二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分?；蚪M復(fù)制的主要特點(diǎn)基因組復(fù)制的主要特點(diǎn)The General features of Genome Re

2、plication 第一節(jié)第一節(jié)第2頁(yè)/共146頁(yè)第三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第3頁(yè)/共146頁(yè)第四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第4頁(yè)/共146頁(yè)第五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。復(fù)制起點(diǎn)（復(fù)制起點(diǎn)（origin）：指：指DNA復(fù)制所必需的一段特殊復(fù)制所必需的一段特殊的的DNA序列。序列。第5頁(yè)/共146頁(yè)第六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。雙螺旋雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長(zhǎng)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長(zhǎng)點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈呈Y形或叉形，稱之為形或叉形，稱之為復(fù)制叉。復(fù)制叉。（二）復(fù)制過(guò)程中形成復(fù)制泡和復(fù)制叉（二）復(fù)制過(guò)程中形成復(fù)制泡和復(fù)制叉目目 錄錄第6頁(yè)/共146頁(yè)第七頁(yè)，編輯于

3、星期六：六點(diǎn) 二十二分。從一個(gè)從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)起始的復(fù)制起點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)域，它復(fù)制區(qū)域，它是一個(gè)獨(dú)立復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)。是一個(gè)獨(dú)立復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)。 復(fù)制子（復(fù)制子（replicon）（三）復(fù)制的基本單位稱為復(fù)制子（三）復(fù)制的基本單位稱為復(fù)制子 第7頁(yè)/共146頁(yè)第八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 （四）半保留復(fù)制方式保證遺傳信息的忠實(shí)傳遞（四）半保留復(fù)制方式保證遺傳信息的忠實(shí)傳遞（1）全保留式（全保留式（conservative），即恢復(fù)原來(lái)的，即恢復(fù)原來(lái)的DNA雙螺旋，并產(chǎn)生一個(gè)新的子代雙螺旋，并產(chǎn)生一個(gè)新的子代DNA雙雙螺旋；螺旋；（2）半保留式（半保

4、留式（semiconservative），即新老搭配，即新老搭配，由一條新合成的，由一條新合成的DNA鏈和一條復(fù)制模板鏈鏈和一條復(fù)制模板鏈配對(duì)產(chǎn)生子代雙螺旋配對(duì)產(chǎn)生子代雙螺旋DNA；（3）散布式（散布式（dispersive），），即復(fù)制模板鏈被分成許即復(fù)制模板鏈被分成許多小片段，散布于子代多小片段，散布于子代DNA中。中。兩條新合成的兩條新合成的DNADNA鏈和兩條原來(lái)的復(fù)制模板鏈和兩條原來(lái)的復(fù)制模板鏈之間的結(jié)合方式可能性：鏈之間的結(jié)合方式可能性：第8頁(yè)/共146頁(yè)第九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 密度梯度實(shí)驗(yàn)密度梯度實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制半保留復(fù)制方式方式含重氮含重

5、氮-DNA的細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)于普通培于普通培養(yǎng)液養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果第9頁(yè)/共146頁(yè)第十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。前導(dǎo)鏈（前導(dǎo)鏈（leading strand）: DNA復(fù)制時(shí)，一條鏈的復(fù)制時(shí)，一條鏈的合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制合成的新合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制合成的新鏈。鏈。后隨鏈（后隨鏈（lagging strand）:另一條鏈的合成方向另一條鏈的合成方向與復(fù)制叉前進(jìn)方向相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成若與復(fù)制叉前進(jìn)方向相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成若干小片段分別合成，然后連接

6、起來(lái)形成新鏈。后隨鏈干小片段分別合成，然后連接起來(lái)形成新鏈。后隨鏈中的小片段稱為中的小片段稱為岡崎片段（岡崎片段（Okazaki fragments) )。（五）半不連續(xù)復(fù)制克服了（五）半不連續(xù)復(fù)制克服了DNA空間結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu) 對(duì)對(duì)DNA新鏈合成的制約新鏈合成的制約前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，即前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，即DNA半不連半不連續(xù)續(xù)復(fù)制復(fù)制。第10頁(yè)/共146頁(yè)第十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第11頁(yè)/共146頁(yè)第十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。E.coli 復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn) oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCT

7、CTTATTAG 1 13 17 29 32 1 13 17 29 32 44 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 同向重復(fù)序列同向重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 第12頁(yè)/共146頁(yè)第十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。酵母復(fù)制起點(diǎn)為酵母復(fù)制起點(diǎn)為自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色體含有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。酵母染色體含有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)

8、。 元件元件A(富含富含A/T的共有序列的共有序列)：結(jié)合一個(gè)特異的蛋白質(zhì)復(fù)：結(jié)合一個(gè)特異的蛋白質(zhì)復(fù)合物合物復(fù)制起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物復(fù)制起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物(ORC)。 3個(gè)序列個(gè)序列(B1、B2和和B3)可以增加復(fù)制起點(diǎn)的效率，其中可以增加復(fù)制起點(diǎn)的效率，其中B2的的9個(gè)堿基與上述個(gè)堿基與上述ARS共有序列相同。共有序列相同。酵母復(fù)制起始點(diǎn)酵母復(fù)制起始點(diǎn)第13頁(yè)/共146頁(yè)第十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 DNA聚合酶不能從聚合酶不能從游離的核苷酸游離的核苷酸開(kāi)始合成開(kāi)始合成DNA鏈，必須由引物（鏈，必須由引物（primer）提供自由的）提供自由的3 -OH末端末端，通過(guò)加入核苷酸使之不斷延伸。

9、，通過(guò)加入核苷酸使之不斷延伸。 所有細(xì)胞和多數(shù)病毒的所有細(xì)胞和多數(shù)病毒的DNA復(fù)制，首先利用復(fù)制，首先利用模板模板合成一段合成一段RNA引物引物，這一過(guò)程為，這一過(guò)程為引發(fā)（引發(fā)（priming）。 RNA引物引物5 端的第一個(gè)核苷酸通常是端的第一個(gè)核苷酸通常是pppA（個(gè)別（個(gè)別為為pppG）。）。1.1.多數(shù)多數(shù)DNA復(fù)制使用復(fù)制使用RNA引物引物第14頁(yè)/共146頁(yè)第十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 174等噬菌體等噬菌體以雙鏈以雙鏈環(huán)形環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口的一條鏈上產(chǎn)生切口處的處的3 -OH為引物；為引物； 腺病毒及某些線性腺病毒及某些線性DNA病毒病毒以結(jié)合于病毒以結(jié)合

10、于病毒DNA的的5 端磷酸基團(tuán)的末端蛋白上的端磷酸基團(tuán)的末端蛋白上的dCTP的的3 -OH為引物開(kāi)為引物開(kāi)始復(fù)制。始復(fù)制。2.個(gè)別個(gè)別DNA復(fù)制以復(fù)制以DNA或核苷酸為引物或核苷酸為引物第15頁(yè)/共146頁(yè)第十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。制方式制方式第16頁(yè)/共146頁(yè)第十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第17頁(yè)/共146頁(yè)第十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 DNA復(fù)制過(guò)程復(fù)制過(guò)程 Process of DNA Replication第二節(jié)第二節(jié)第18頁(yè)/共146頁(yè)第十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第19頁(yè)/共146頁(yè)第二十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。DnaA、D

11、naB、DnaC、HU、促旋酶（促旋酶（gyrase，即拓?fù)洚悩?gòu)酶，即拓?fù)洚悩?gòu)酶）、）、單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(single strand binding protein, SSB)DNA復(fù)制需要復(fù)制需要6種蛋白因子：種蛋白因子：第20頁(yè)/共146頁(yè)第二十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 DNA復(fù)制起始復(fù)制起始 第21頁(yè)/共146頁(yè)第二十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 結(jié)合結(jié)合oriC的的4個(gè)個(gè)9bp反向重復(fù)序列形成反向重復(fù)序列形成復(fù)制起始復(fù)制起始復(fù)合物復(fù)合物。 作用于作用于oriC的的3個(gè)個(gè)13bp正向重復(fù)序列，正向重復(fù)序列，DNA在這在這3個(gè)位點(diǎn)解鏈，形成個(gè)位點(diǎn)解鏈，形成

12、開(kāi)放型復(fù)合物（開(kāi)放型復(fù)合物（open complex）。DnaA蛋白蛋白第22頁(yè)/共146頁(yè)第二十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 53 解旋酶作用產(chǎn)生兩條復(fù)制模板鏈解旋酶作用產(chǎn)生兩條復(fù)制模板鏈 激活引發(fā)酶激活引發(fā)酶DnaG蛋白蛋白 DnaB蛋白與引發(fā)酶結(jié)合，形成引發(fā)體蛋白與引發(fā)酶結(jié)合，形成引發(fā)體DnaB蛋白蛋白第23頁(yè)/共146頁(yè)第二十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 使一條使一條DNA鏈圍繞著另一條旋轉(zhuǎn)，消除解鏈圍繞著另一條旋轉(zhuǎn)，消除解旋產(chǎn)生的張力。旋產(chǎn)生的張力。促旋酶促旋酶SSBSSB蛋白蛋白HUHU蛋白蛋白 穩(wěn)定解旋后的單鏈穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA構(gòu)象，有助于解旋。構(gòu)象，有助于解

13、旋。 DNA結(jié)合蛋白，對(duì)復(fù)制起促進(jìn)作用。結(jié)合蛋白，對(duì)復(fù)制起促進(jìn)作用。 HU蛋白能夠使蛋白能夠使DNA發(fā)生折疊。發(fā)生折疊。第24頁(yè)/共146頁(yè)第二十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。E.coli 中中DnaB結(jié)合引發(fā)酶結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成，催化合成RNA引物，其序列始于引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列，模板鏈序列3 -GTC-5 ，引物長(zhǎng)度一般，引物長(zhǎng)度一般1112個(gè)堿基。個(gè)堿基。（二）引發(fā)酶合成（二）引發(fā)酶合成RNA引物引物第25頁(yè)/共146頁(yè)第二十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。負(fù)責(zé)切除負(fù)責(zé)切除RNA引物。引物。（三）復(fù)制時(shí)聚合酶（三）復(fù)制時(shí)聚合酶催化催化DNA合成而合成

14、而 聚合酶聚合酶切除引物切除引物DNA聚合酶聚合酶可利用損傷尚未修復(fù)的可利用損傷尚未修復(fù)的DNA鏈作鏈作為模板合成為模板合成DNA，但不能修復(fù)損，但不能修復(fù)損傷。傷。負(fù)責(zé)合成負(fù)責(zé)合成DNA。DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶第26頁(yè)/共146頁(yè)第二十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。TLS1 Rev 1TLS，體細(xì)胞高變，體細(xì)胞高變1Pol 相對(duì)準(zhǔn)確的相對(duì)準(zhǔn)確的TLS（穿越環(huán)丁烷二聚體）（穿越環(huán)丁烷二聚體）1Pol TLS1Pol 體細(xì)胞高變（體細(xì)胞高變（somatic hypermutation）1Pol 減數(shù)分裂相關(guān)的減數(shù)分裂相關(guān)的DNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)1Pol TLS1Pol DNA

15、交聯(lián)損傷修復(fù)交聯(lián)損傷修復(fù)1Pol DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)4Pol DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)23Pol 線粒體線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)復(fù)制和損傷修復(fù)3Pol 堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)1Pol 合成引物合成引物4Pol 功能功能亞基數(shù)目亞基數(shù)目真核生物真核生物TLS（translesion synthesis）3Pol (UmuC, UmuD)DNA損傷修復(fù)，穿越損傷合成（損傷修復(fù)，穿越損傷合成（TLS）1Pol (Din B)染色體染色體DNA復(fù)制復(fù)制9Pol 全酶全酶染色體染色體DNA復(fù)制復(fù)

16、制3Pol 核心酶核心酶DNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)1Pol 去除去除RNA引物，引物，DNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)1Pol 功能功能亞基數(shù)目亞基數(shù)目原核生物（原核生物（E.coli）原核、真核細(xì)胞原核、真核細(xì)胞DNADNA聚合酶的類型和功能聚合酶的類型和功能目目 錄錄第27頁(yè)/共146頁(yè)第二十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。個(gè)核心酶?jìng)€(gè)核心酶1個(gè)個(gè) -復(fù)合物（復(fù)合物（ 、 、 、 、 、 6種亞種亞基）基）可滑動(dòng)的可滑動(dòng)的DNA夾子夾子（含（含1對(duì)對(duì) -亞基）亞基）DNA聚合酶聚合酶全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：全酶結(jié)構(gòu)包括：第28頁(yè)/共146頁(yè)第二十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 亞基亞基（1

17、30 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亞基亞基具有具有35 外切酶活性（校正功能）外切酶活性（校正功能） 亞基可增強(qiáng)其活性亞基可增強(qiáng)其活性 亞基亞基可能起組裝作用可能起組裝作用核心酶由核心酶由 、 和和 亞基組成：亞基組成：第29頁(yè)/共146頁(yè)第三十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。2個(gè)個(gè) -亞基亞基分別和分別和1個(gè)核心酶相互作用，其柔個(gè)核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉1個(gè)全酶分子的個(gè)全酶分子的2個(gè)核心個(gè)核心酶能夠相對(duì)獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，分別負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨酶能夠相對(duì)獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，分別負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。鏈。功能：功能： -復(fù)合物是復(fù)合物是DNA夾子

18、加載蛋白，負(fù)責(zé)將可夾子加載蛋白，負(fù)責(zé)將可沿沿DNA鏈滑動(dòng)的一對(duì)鏈滑動(dòng)的一對(duì) -亞基（亞基（DNA夾子夾子）加載于）加載于DNA，使，使DNA聚合酶聚合酶具有具有持續(xù)合成能力。持續(xù)合成能力。 -復(fù)合物由復(fù)合物由6種亞基組成：種亞基組成： 、 、 、 、 、 第30頁(yè)/共146頁(yè)第三十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈第31頁(yè)/共146頁(yè)第三十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。3 5 3 5 3 5 3 5 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)解鏈方向解鏈方向?qū)槠螌槠? 5

19、 第32頁(yè)/共146頁(yè)第三十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第33頁(yè)/共146頁(yè)第三十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 53 外切酶：外切酶：去除去除RNA引物引物 35 外切酶：外切酶：起校正作用起校正作用 DNA聚合酶活性：聚合酶活性：填補(bǔ)兩個(gè)岡崎片段之間的缺口填補(bǔ)兩個(gè)岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶聚合酶有有3個(gè)酶促活性結(jié)構(gòu)域個(gè)酶促活性結(jié)構(gòu)域:第34頁(yè)/共146頁(yè)第三十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。323個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段：大片段：Klenow 片段片段 604個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外

20、切酶活性N 端端C 端端枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶DNA-pol 第35頁(yè)/共146頁(yè)第三十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。Tus蛋白具有蛋白具有反解旋酶（反解旋酶（contra-helicase）活性活性，識(shí)別并結(jié)合識(shí)別并結(jié)合ter序列中共有序列，阻止序列中共有序列，阻止Dna B蛋白的解旋作用，從而蛋白的解旋作用，從而抑制復(fù)制叉前進(jìn)抑制復(fù)制叉前進(jìn)。Tus蛋白除了使復(fù)制叉停止運(yùn)動(dòng)以外，還可能蛋白除了使復(fù)制叉停止運(yùn)動(dòng)以外，還可能造成造成復(fù)制體解體復(fù)制體解體。(四四) Tus蛋白識(shí)別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止蛋白識(shí)別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約100kb處各有一個(gè)處各

21、有一個(gè)終止區(qū)（終止區(qū)（ter D/A和和ter C/B）。）。第36頁(yè)/共146頁(yè)第三十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。當(dāng)當(dāng)oriC處于處于半甲基化狀態(tài)半甲基化狀態(tài)時(shí)，時(shí)，SeqA蛋白迅速結(jié)合半蛋白迅速結(jié)合半甲基化的甲基化的GATC，阻止，阻止Dam甲基化酶與之結(jié)合，使復(fù)甲基化酶與之結(jié)合，使復(fù)制起點(diǎn)不能被完全甲基化，同時(shí)制起點(diǎn)不能被完全甲基化，同時(shí)阻止阻止DnaA蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合oriC。oriC的的GATC被完全甲基化被完全甲基化，DnaA蛋白就能與之結(jié)蛋白就能與之結(jié)合合，開(kāi)始新的一輪復(fù)制，開(kāi)始新的一輪復(fù)制。(五五) DNA甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個(gè)復(fù)制周期中甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個(gè)復(fù)制周

22、期中僅起一次作用僅起一次作用復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)oriC含有含有11個(gè)拷貝個(gè)拷貝GATC，這一回文序列中的，這一回文序列中的A是是Dam甲基化酶的靶位點(diǎn)甲基化酶的靶位點(diǎn)。第37頁(yè)/共146頁(yè)第三十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 在復(fù)制過(guò)程中，在復(fù)制過(guò)程中，DNA每復(fù)制每復(fù)制10bp，復(fù)制叉前方的模，復(fù)制叉前方的模板板DNA雙螺旋就要繞其長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生雙螺旋就要繞其長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生正超螺旋正超螺旋。 拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價(jià)結(jié)合拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價(jià)結(jié)合DNA分子上的磷酸基團(tuán)，分子上的磷酸基團(tuán)，切斷磷酸二酯鍵切斷磷酸二酯鍵。(六六) DNA復(fù)制需要兩類復(fù)

23、制需要兩類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶第38頁(yè)/共146頁(yè)第三十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。 維持、噬菌體和質(zhì)粒維持、噬菌體和質(zhì)粒DNA復(fù)制起始模板復(fù)制起始模板DNA負(fù)負(fù)超螺旋狀態(tài)。超螺旋狀態(tài)。 環(huán)形染色體復(fù)制后產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體連環(huán)體解連環(huán)環(huán)形染色體復(fù)制后產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體連環(huán)體解連環(huán)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶功能：拓?fù)洚悩?gòu)酶功能：第39頁(yè)/共146頁(yè)第四十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。的的Topo只作用于負(fù)只作用于負(fù)超螺旋超螺旋DNA，消除負(fù)超，消除負(fù)超螺旋。螺旋。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能：的功能：第40

24、頁(yè)/共146頁(yè)第四十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。的的Topo將前方將前方產(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。變?yōu)樨?fù)超螺旋。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能的功能第41頁(yè)/共146頁(yè)第四十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 的的Topo功能是將復(fù)功能是將復(fù)制產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體制產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體從連環(huán)體中分離出來(lái)，從連環(huán)體中分離出來(lái)，催化連環(huán)和去連環(huán)過(guò)程催化連環(huán)和去連環(huán)過(guò)程 。第42頁(yè)/共146頁(yè)第四十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢等；速度慢等； DNA復(fù)制從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生復(fù)制

25、從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生DNA聚聚合酶合酶 / 轉(zhuǎn)換；轉(zhuǎn)換； 切除岡崎片段切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶引物的是核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。 二、真核生物二、真核生物DNA復(fù)制和原核生物相似復(fù)制和原核生物相似但更為復(fù)雜但更為復(fù)雜真核生物與原核生物真核生物與原核生物DNA復(fù)制的差異：復(fù)制的差異：第43頁(yè)/共146頁(yè)第四十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。( (一一) )常見(jiàn)的真核細(xì)胞常見(jiàn)的真核細(xì)胞DNA聚合酶有聚合酶有5種種A家族家族與大腸桿菌與大腸桿菌Pol同源，包括同源，包括Pol 和和Pol B家族家族與大腸桿菌與大腸桿菌Pol 同源，包括同源，包括Pol 、 、 和和C家族

26、家族與大腸桿菌與大腸桿菌Pol 同源，僅在真菌中發(fā)現(xiàn)同源，僅在真菌中發(fā)現(xiàn)X家族家族與大腸桿菌與大腸桿菌DNA聚合酶并無(wú)同源性，卻與末端聚合酶并無(wú)同源性，卻與末端轉(zhuǎn)移酶同源，成員包括轉(zhuǎn)移酶同源，成員包括Pol 、 、 Y家族家族（ UmuC/DinB超家族），近年發(fā)現(xiàn)一個(gè)特殊的超家族），近年發(fā)現(xiàn)一個(gè)特殊的真核及原核真核及原核DNA聚合酶家族，成員包括聚合酶家族，成員包括Pol 、 、 和和Rev1第44頁(yè)/共146頁(yè)第四十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。Pol 負(fù)責(zé)合成引物負(fù)責(zé)合成引物Pol 負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)Pol 的功能與的

27、功能與Pol 相似（其確切功能尚待定）相似（其確切功能尚待定）Pol 可能和堿基切除修復(fù)有關(guān)可能和堿基切除修復(fù)有關(guān)Pol 負(fù)責(zé)線粒體負(fù)責(zé)線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)復(fù)制和損傷修復(fù)常見(jiàn)的真核常見(jiàn)的真核DNA聚合酶有聚合酶有5種：種：第45頁(yè)/共146頁(yè)第四十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋正超螺旋Tol和和TolDNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體DNA解旋酶解旋酶連接岡崎片段連接岡崎片段DNA連接酶連接酶核酸酶，切除核酸酶，切除RN

28、A引物引物RNAse H核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物FEN1DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)Pol / 合成合成RNA-DNA引物引物Pol /引發(fā)酶引發(fā)酶有依賴有依賴DNA的的ATPase活性，結(jié)合于引物活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活模板鏈，激活DNA聚合酶，聚合酶， 促使促使PCNA結(jié)合于引物結(jié)合于引物-模板鏈模板鏈RFC激活激活DNA聚合酶和聚合酶和RFC的的ATPase活性活性PCNA單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白，激活結(jié)合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合DNARPA功功 能能蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)真核真核DNA復(fù)制叉主

29、要蛋白質(zhì)的功能復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能( (二二) )真核真核DNADNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能與原核基本相似與原核基本相似第46頁(yè)/共146頁(yè)第四十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。DNA聚合酶聚合酶 （Pol ）分子含有）分子含有4個(gè)亞基：個(gè)亞基：1. DNA聚合酶聚合酶 /引發(fā)酶復(fù)合物合成引發(fā)酶復(fù)合物合成RNA-DNA引物引物 p180：催化亞基：催化亞基 p48：具有引發(fā)酶活性：具有引發(fā)酶活性p58：p48的穩(wěn)定性和活性所必需的的穩(wěn)定性和活性所必需的p70：與組裝引發(fā)體有關(guān)：與組裝引發(fā)體有關(guān)第47頁(yè)/共146頁(yè)第四十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。

30、功能：功能：合成合成RNA引物引物反應(yīng)過(guò)程反應(yīng)過(guò)程：調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)：磷酸化的調(diào)節(jié)作用磷酸化的調(diào)節(jié)作用Pol /引發(fā)酶復(fù)合物引發(fā)酶復(fù)合物首先，合成首先，合成RNA引物；引物；其次，利用其次，利用DNA聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成）短序列，形成RNA-DNA引物；引物；最后，最后，Pol /引發(fā)酶脫離模板鏈引發(fā)酶脫離模板鏈DNA，發(fā)生，發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)聚合酶轉(zhuǎn)換（換（switch）。）。第48頁(yè)/共146頁(yè)第四十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)： p70、p34和和p11組成異源三聚體組成異源三聚

31、體功能：功能： 2. RPA的功能與的的功能與的SSB相似相似復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白A（replication protein A，RPA）結(jié)合單鏈結(jié)合單鏈DNA促使雙螺旋促使雙螺旋DNA解旋解旋激活激活Pol /引發(fā)酶活性引發(fā)酶活性為為Pol 依賴復(fù)制因子依賴復(fù)制因子C（RFC）和增殖細(xì)胞核抗原（）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）合成合成DNA所必需所必需RPA三聚體與三聚體與SV40 T抗原結(jié)合，組裝引發(fā)體復(fù)合物所必需抗原結(jié)合，組裝引發(fā)體復(fù)合物所必需RPA參與參與DNA重組和修復(fù)重組和修復(fù)第49頁(yè)/共146頁(yè)第五十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 p140 結(jié)合結(jié)合PCNA p40、p37和和p3

32、6組成穩(wěn)定的核心復(fù)合物，具有依組成穩(wěn)定的核心復(fù)合物，具有依賴賴DNA的的ATPase活性活性 p38可能在可能在p140和核心復(fù)合物之間起連接作用和核心復(fù)合物之間起連接作用3. RFC與與E.coli DNA聚合酶聚合酶的的 -復(fù)合物功能相似復(fù)合物功能相似復(fù)制因子復(fù)制因子C（replication factor C，RFC）結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：有有p140，p40，p38，p37、p36 5個(gè)亞基個(gè)亞基第50頁(yè)/共146頁(yè)第五十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。促使可滑動(dòng)的促使可滑動(dòng)的DNA夾子夾子PCNA結(jié)合于引物結(jié)合于引物-模模板鏈，是板鏈，是Pol 在模板在模板DNA鏈上組裝并形成具有持續(xù)鏈上

33、組裝并形成具有持續(xù)合成能力全酶所必需的。合成能力全酶所必需的。RFC的功能：的功能：第51頁(yè)/共146頁(yè)第五十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 PCNA是是Pol 的進(jìn)行性因子，使的進(jìn)行性因子，使Pol 獲得持續(xù)合成能力。獲得持續(xù)合成能力。 PCNA是協(xié)調(diào)是協(xié)調(diào)DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、表觀遺傳和細(xì)胞周期調(diào)復(fù)制、損傷修復(fù)、表觀遺傳和細(xì)胞周期調(diào)控的核心因子?？氐暮诵囊蜃印?PCNA水平是檢測(cè)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。水平是檢測(cè)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。 PCNA能激活能激活Pol 。4. PCNA是可滑動(dòng)的是可滑動(dòng)的DNA夾子夾子增殖細(xì)胞核抗原增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nucle

34、ar antigen，PCNA）結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：功能：功能：同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)同源三聚體，可形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNADNA夾子。夾子。第52頁(yè)/共146頁(yè)第五十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。p125：催化亞基，具有：催化亞基，具有DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35 核酸外切酶核酸外切酶活性，其活性，其N端區(qū)與端區(qū)與PCNA相互作用相互作用p50：輔助：輔助PCNA激活激活p1255. DNA聚合酶聚合酶 合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：Pol 分子是異源二聚體（分子是異源二聚體（p125和和p50）功能：功能：Pol 合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈DN

35、A聚合酶聚合酶 第53頁(yè)/共146頁(yè)第五十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸內(nèi)切酶和）具有核酸內(nèi)切酶和53 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 FEN1參與去除岡崎片段參與去除岡崎片段5 端的端的RNA引物。引物。6. FEN1和和RNAse H切除切除RNA引物引物第54頁(yè)/共146頁(yè)第五十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。RNAse H是是核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶，參與岡崎片段成熟，參與岡崎片段成熟時(shí)時(shí)切除切除5 端端RNA引物引物，底物，底物RNA連接在連接在DNA鏈的鏈的5 端端，切割后在，切割后在DNA鏈的鏈的5 端殘留一個(gè)核

36、糖核苷酸，這端殘留一個(gè)核糖核苷酸，這個(gè)核苷酸再被個(gè)核苷酸再被FEN1切除。切除。第55頁(yè)/共146頁(yè)第五十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。DNA復(fù)制需要復(fù)制需要DNA解旋酶打開(kāi)解旋酶打開(kāi)DNA雙螺旋雙螺旋，使復(fù)制模板鏈得以暴露，使復(fù)制模板鏈得以暴露。7. DNA解旋酶打開(kāi)雙螺旋以暴露復(fù)制模板解旋酶打開(kāi)雙螺旋以暴露復(fù)制模板第56頁(yè)/共146頁(yè)第五十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。8. 真核復(fù)制叉有真核復(fù)制叉有1個(gè)個(gè)Pol 和和2個(gè)個(gè)Pol 復(fù)合物復(fù)合物真核真核DNA復(fù)制叉模型復(fù)制叉模型第57頁(yè)/共146頁(yè)第五十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。Pol /引發(fā)酶引發(fā)酶合成合成RNA-DN

37、A引物引物Pol 合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈RFC 識(shí)別引物識(shí)別引物iDNA的的3 端并驅(qū)除端并驅(qū)除Pol /引發(fā)酶引發(fā)酶PCNA 結(jié)合結(jié)合DNA并引入并引入Pol RNAse H I/FEN1 切除岡崎片段切除岡崎片段5 端的端的RNA引物引物真核生物復(fù)制過(guò)程中酶及功能真核生物復(fù)制過(guò)程中酶及功能第58頁(yè)/共146頁(yè)第五十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。Pol （或（或Pol ）填補(bǔ)岡崎片段之間的空隙填補(bǔ)岡崎片段之間的空隙DNA連接酶連接酶 封口封口RPA 穩(wěn)定解旋后的單鏈穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA解旋酶解旋酶 復(fù)制叉的形成和移動(dòng)必不可少?gòu)?fù)制叉的形成和移動(dòng)必不可少拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶

38、 釋放復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力釋放復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力第59頁(yè)/共146頁(yè)第六十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。(三三) 引發(fā)和延伸發(fā)生引發(fā)和延伸發(fā)生DNA聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換識(shí)別染色體識(shí)別染色體DNA復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)和DNA局部解旋后，局部解旋后，Pol /引發(fā)酶復(fù)合物結(jié)合于復(fù)制起點(diǎn)，這一步叫做引發(fā)酶復(fù)合物結(jié)合于復(fù)制起點(diǎn)，這一步叫做引發(fā)體組裝引發(fā)體組裝。 引發(fā)體組裝引發(fā)體組裝包括包括DNA解旋酶解旋酶與與Pol /引發(fā)酶引發(fā)酶相互相互作用。作用。1. 解旋酶與解旋酶與Pol /引發(fā)酶相互作用組裝引發(fā)體引發(fā)酶相互作用組裝引發(fā)體第60頁(yè)/共146頁(yè)第六十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn)

39、 二十二分。 前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期前導(dǎo)鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期 后隨鏈：發(fā)生于每個(gè)岡崎片段合成之際后隨鏈：發(fā)生于每個(gè)岡崎片段合成之際 發(fā)生發(fā)生DNA聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換的原因是轉(zhuǎn)換的原因是Pol 不具備持不具備持續(xù)合成能力續(xù)合成能力 DNA聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白是關(guān)鍵蛋白是RFC2. DNA聚合酶聚合酶 / 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換第61頁(yè)/共146頁(yè)第六十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。真核真核DNA聚聚合酶轉(zhuǎn)換和合酶轉(zhuǎn)換和后隨鏈合成后隨鏈合成第62頁(yè)/共146頁(yè)第六十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。首先首先RNAse H利用核酸內(nèi)切酶活性切割連接在岡崎利用核酸內(nèi)切酶活性切割連接在岡崎

40、片段片段5 端的端的RNA片段，在片段，在RNA-DNA引物連接點(diǎn)旁留下引物連接點(diǎn)旁留下1個(gè)核糖個(gè)核糖核苷酸；核苷酸；然后然后FEN1利用利用53 核酸外切酶活性切除這最后一核酸外切酶活性切除這最后一個(gè)核糖核苷酸。個(gè)核糖核苷酸。(四四) 切除切除RNA引物有兩種機(jī)制引物有兩種機(jī)制解旋酶解旋酶Dna2具有依賴具有依賴DNA的的ATPase和和35 解旋酶活解旋酶活性，其解旋作用可以使前一個(gè)岡崎片段的性，其解旋作用可以使前一個(gè)岡崎片段的5 端引物形成端引物形成“蓋子蓋子”結(jié)構(gòu)，再由結(jié)構(gòu)，再由FEN1的內(nèi)切酶活性切除引物。的內(nèi)切酶活性切除引物。 依賴依賴RNAse H/FEN1切除方式：切除方式：

41、依賴依賴Dna2/FEN1切除方式：切除方式：第63頁(yè)/共146頁(yè)第六十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。切除切除RNA引物的兩種機(jī)制引物的兩種機(jī)制RNAse H/FEN1Dna2/FEN1第64頁(yè)/共146頁(yè)第六十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。真核所有染色體真核所有染色體DNA復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞周期的周期的S期期，而且只能復(fù)制一次。，而且只能復(fù)制一次。( (五五) ) 真核染色體在每個(gè)細(xì)胞周期中只能復(fù)制真核染色體在每個(gè)細(xì)胞周期中只能復(fù)制一次一次第65頁(yè)/共146頁(yè)第六十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。1. 前復(fù)制復(fù)合物在前復(fù)制復(fù)合物在G1期形成而在期形成而在S期

42、被激活期被激活真核細(xì)胞真核細(xì)胞DNA復(fù)制的起始分兩步進(jìn)行，即復(fù)制的起始分兩步進(jìn)行，即復(fù)復(fù)制基因的選擇制基因的選擇和和復(fù)制起點(diǎn)的激活。復(fù)制起點(diǎn)的激活。復(fù)制基因（復(fù)制基因（replicator）是指是指DNA復(fù)制起始復(fù)制起始所所必需的必需的全部全部DNA序列序列。第66頁(yè)/共146頁(yè)第六十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 復(fù)制基因的選擇復(fù)制基因的選擇出現(xiàn)于出現(xiàn)于G1期期，基因組的每個(gè)復(fù)，基因組的每個(gè)復(fù)制基因位點(diǎn)均組裝制基因位點(diǎn)均組裝前復(fù)制復(fù)合物（前復(fù)制復(fù)合物（pre-replicative complex，pre-RC）。 復(fù)制起點(diǎn)的激活復(fù)制起點(diǎn)的激活出現(xiàn)于細(xì)胞進(jìn)入出現(xiàn)于細(xì)胞進(jìn)入S期期以后，這

43、一階以后，這一階段將段將激活激活pre-RC，募集若干復(fù)制基因結(jié)合蛋白，募集若干復(fù)制基因結(jié)合蛋白和和DNA聚合酶，并起始聚合酶，并起始DNA解旋。解旋。在原核細(xì)胞中，復(fù)制基因的識(shí)別與在原核細(xì)胞中，復(fù)制基因的識(shí)別與DNA解旋、解旋、募集募集DNA聚合酶偶聯(lián)進(jìn)行。而在真核細(xì)胞中，這兩聚合酶偶聯(lián)進(jìn)行。而在真核細(xì)胞中，這兩個(gè)階段相分離可以確保每個(gè)染色體在每個(gè)細(xì)胞周期個(gè)階段相分離可以確保每個(gè)染色體在每個(gè)細(xì)胞周期中僅復(fù)制一次。中僅復(fù)制一次。第67頁(yè)/共146頁(yè)第六十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。ORC至少募集兩種解旋酶加載至少募集兩種解旋酶加載蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1。復(fù)制起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（復(fù)制起

44、點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（originrecognition complex，ORC）識(shí)別）識(shí)別并結(jié)合復(fù)制基因。并結(jié)合復(fù)制基因。三種蛋白質(zhì)一起募集真核細(xì)胞三種蛋白質(zhì)一起募集真核細(xì)胞解旋酶解旋酶Mcm2-7。前復(fù)制復(fù)合物（前復(fù)制復(fù)合物（pre-RC）的形成）的形成第68頁(yè)/共146頁(yè)第六十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 pre-RC磷酸化導(dǎo)致在復(fù)制起點(diǎn)組裝其他復(fù)制因子并起磷酸化導(dǎo)致在復(fù)制起點(diǎn)組裝其他復(fù)制因子并起始復(fù)制，復(fù)制因子包括始復(fù)制，復(fù)制因子包括3種種DNA聚合酶。聚合酶。 DNA聚合酶在復(fù)制起點(diǎn)按一定順序組裝：首先聚合酶在復(fù)制起點(diǎn)按一定順序組裝：首先Pol 和和Pol 結(jié)合，然后是結(jié)合，然后是P

45、ol /引發(fā)酶。引發(fā)酶。在在S期期，pre-RC被蛋白激酶（被蛋白激酶（Ddk和和Cdk）磷）磷酸化，從而被激活。酸化，從而被激活。第69頁(yè)/共146頁(yè)第七十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。pre-RC的激活的激活和組裝真核和組裝真核DNA復(fù)制叉復(fù)制叉第70頁(yè)/共146頁(yè)第七十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。（1）激活）激活pre-RC，以起始，以起始DNA復(fù)制；復(fù)制；（2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-RC。2. Cdk控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活真核細(xì)胞通過(guò)依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激真核細(xì)胞通過(guò)依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶（酶（cyclin-dependent kin

46、ases，CDK）嚴(yán)格控制）嚴(yán)格控制pre-RC的形成和激活。的形成和激活。Cdk功能：功能：第71頁(yè)/共146頁(yè)第七十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。在每個(gè)細(xì)胞周期過(guò)程中，僅有一次機(jī)會(huì)形在每個(gè)細(xì)胞周期過(guò)程中，僅有一次機(jī)會(huì)形成成pre-RC，也僅有一次機(jī)會(huì)激活，也僅有一次機(jī)會(huì)激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解體，所暴露的復(fù)制基在被激活后即解體，所暴露的復(fù)制基因可形成新的因可形成新的pre-RC并迅速結(jié)合并迅速結(jié)合ORC。但在。但在S、G2和和M期，高活性的期，高活性的Cdk抑制抑制pre-RC的其他組分結(jié)合的其他組分結(jié)合ORC。只有當(dāng)染色體分離和細(xì)胞分裂完成時(shí)，。只有當(dāng)染色體分離

47、和細(xì)胞分裂完成時(shí)，Cdk的的活性消失，新的活性消失，新的pre-RC才能形成。才能形成。第72頁(yè)/共146頁(yè)第七十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。( (六六) )端粒酶確保染色體末端復(fù)制完整端粒酶確保染色體末端復(fù)制完整 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈產(chǎn)生產(chǎn)生完整完整的子染色單體。的子染色單體。后隨鏈后隨鏈3 3 端留下縮端留下縮短的短的未復(fù)制的未復(fù)制的ssDNA區(qū)區(qū)。第73頁(yè)/共146頁(yè)第七十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 端粒（端粒（telomeres）由富含由富含TG的重復(fù)序列組成。的重復(fù)序列組成。 人的端粒重復(fù)序列為人的端粒重復(fù)序列為5-TTAGGG-3 。 這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個(gè)染色體的

48、這些重復(fù)序列多為雙鏈，但每個(gè)染色體的3端比端比5 端端長(zhǎng)，形成單鏈長(zhǎng)，形成單鏈ssDNA。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決染色體。這一特殊結(jié)構(gòu)可解決染色體末端復(fù)制問(wèn)題。末端復(fù)制問(wèn)題。第74頁(yè)/共146頁(yè)第七十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 端粒酶（端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白（是一種核糖核蛋白（RNP），由），由RNA和蛋白質(zhì)組成。和蛋白質(zhì)組成。 端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA組分作為模板，以染色體的組分作為模板，以染色體的3 端端ssDNA（后隨鏈模板）（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加于為引物，將端粒序列添加于染色體的染色體的3 端。這些新合成的端。這些新合成的DNA為單鏈

49、為單鏈。第75頁(yè)/共146頁(yè)第七十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第76頁(yè)/共146頁(yè)第七十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。第77頁(yè)/共146頁(yè)第七十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。DNA聚合酶聚合酶 ：催化合成催化合成DNA DNA解旋酶（解旋酶（helicase）：）：解開(kāi)解開(kāi)DNA雙螺旋，暴露雙螺旋，暴露復(fù)制模板鏈復(fù)制模板鏈 引發(fā)酶引發(fā)酶 ：引發(fā)，即合成引發(fā)，即合成RNA引物，利用引物引物，利用引物3-OH開(kāi)始延伸開(kāi)始延伸DNA連接酶：連接酶：連結(jié)岡崎片段連結(jié)岡崎片段其他酶和蛋白因子其他酶和蛋白因子小結(jié)：小結(jié)：DNA復(fù)制需要多種酶參與復(fù)制需要多種酶參與如：起穩(wěn)定作用的單鏈如：

50、起穩(wěn)定作用的單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白（SSB）和改變）和改變DNA超螺超螺旋狀態(tài)的旋狀態(tài)的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）等）等第78頁(yè)/共146頁(yè)第七十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 DNA聚合酶的聚合酶的合成前誤差控制合成前誤差控制(presynthetic error control)和和校正控制校正控制(proofreading control)功能。功能。 細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)是是DNA復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。復(fù)制高度忠實(shí)性的重要因素。 復(fù)制起始利用引物復(fù)制起始利用引物也是確保也是確保DNA復(fù)制忠實(shí)性的重要機(jī)復(fù)制忠實(shí)性的重要機(jī)制之一。制之一。DN

51、A復(fù)制具有高度忠實(shí)性復(fù)制具有高度忠實(shí)性第79頁(yè)/共146頁(yè)第八十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 DNA復(fù)制是雙向復(fù)制復(fù)制是雙向復(fù)制 一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。一個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)復(fù)制叉，雙向復(fù)制。 兩個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，單向復(fù)制。兩個(gè)起點(diǎn)，兩個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，單向復(fù)制。 一個(gè)起點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制叉，單向復(fù)制。一個(gè)起點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制叉，單向復(fù)制。DNA鏈的合成鏈的合成3種方式：種方式：第80頁(yè)/共146頁(yè)第八十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。線粒體線粒體DNA的的D環(huán)（環(huán)（D-loop）復(fù)制）復(fù)制噬菌體的滾環(huán)（噬菌體的滾環(huán)（rolling circle）復(fù)制）復(fù)制 三、線粒體和噬菌體三、線粒體和噬菌體DN

52、A復(fù)制具有特殊方式復(fù)制具有特殊方式第81頁(yè)/共146頁(yè)第八十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。（一）（一）線粒體線粒體DNA按按D環(huán)方式復(fù)制環(huán)方式復(fù)制環(huán)形、雙螺旋環(huán)形、雙螺旋DNA分子分子兩條鏈一條為重鏈（兩條鏈一條為重鏈（H鏈），另一條為輕鏈（鏈），另一條為輕鏈（L鏈）鏈）dNTPDNA-pol 線粒體線粒體DNA分子特點(diǎn)：分子特點(diǎn)：第82頁(yè)/共146頁(yè)第八十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。l有特異的復(fù)制起點(diǎn)；有特異的復(fù)制起點(diǎn)；l環(huán)形線粒體環(huán)形線粒體DNA兩條鏈（兩條鏈（H和和L）的復(fù)制不同步）的復(fù)制不同步D環(huán)或取代環(huán)（環(huán)或取代環(huán)（displacement loop）：線粒體）：線粒體

53、DNA復(fù)復(fù)制開(kāi)始以制開(kāi)始以H鏈作為模板合成新的鏈作為模板合成新的L鏈，取代原來(lái)的鏈，取代原來(lái)的L鏈并和鏈并和H鏈互補(bǔ)，而原來(lái)的鏈互補(bǔ)，而原來(lái)的L鏈則保持單鏈狀態(tài)鏈則保持單鏈狀態(tài)，形成類似英文字母，形成類似英文字母D的區(qū)域；的區(qū)域；l兩條鏈具有不同的復(fù)制起點(diǎn)和相反的合成方向；兩條鏈具有不同的復(fù)制起點(diǎn)和相反的合成方向；l線粒體線粒體DNA復(fù)制也需要復(fù)制也需要RNA引物引物。線粒體線粒體DNA復(fù)制特點(diǎn)：復(fù)制特點(diǎn)：第83頁(yè)/共146頁(yè)第八十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。（二）噬菌體（二）噬菌體DNA按滾環(huán)方式復(fù)制按滾環(huán)方式復(fù)制 環(huán)形雙螺旋環(huán)形雙螺旋DNA分子分子 一條為模板鏈，另一條為非模板一條

54、為模板鏈，另一條為非模板鏈鏈E.coli 噬菌體噬菌體DNA的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 僅以一條鏈作為模板合成若干環(huán)形僅以一條鏈作為模板合成若干環(huán)形DNA分子拷貝分子拷貝 噬菌體噬菌體DNA復(fù)制的方式是滾環(huán)復(fù)制復(fù)制的方式是滾環(huán)復(fù)制噬菌體噬菌體DNA復(fù)制特點(diǎn)：復(fù)制特點(diǎn)： 第84頁(yè)/共146頁(yè)第八十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。噬菌體噬菌體DNA復(fù)制首先由它自己編碼的復(fù)制首先由它自己編碼的A蛋蛋白在白在非模板鏈非模板鏈上造成缺口，再以所產(chǎn)生的游離上造成缺口，再以所產(chǎn)生的游離3 端羥基作為引物，并在宿主細(xì)胞的端羥基作為引物，并在宿主細(xì)胞的DNA聚合聚合酶、解旋酶和酶、解旋酶和SSB蛋白等

55、作用下合成新鏈，新鏈蛋白等作用下合成新鏈，新鏈和模板鏈互補(bǔ)并取代了原來(lái)的非模板鏈。這種復(fù)和模板鏈互補(bǔ)并取代了原來(lái)的非模板鏈。這種復(fù)制方式稱為滾環(huán)復(fù)制制方式稱為滾環(huán)復(fù)制 。滾環(huán)復(fù)制：滾環(huán)復(fù)制：第85頁(yè)/共146頁(yè)第八十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制5 5 3 3 5 第86頁(yè)/共146頁(yè)第八十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 雙螺旋雙螺旋DNA在復(fù)制起點(diǎn)解鏈不一定導(dǎo)致兩條鏈在復(fù)制起點(diǎn)解鏈不一定導(dǎo)致兩條鏈同時(shí)復(fù)制，也可能利用一條鏈作為模板起始同時(shí)復(fù)制，也可能利用一條鏈作為模板起始DNA合成。合成。 雙螺旋雙螺旋DNA的兩條的

56、兩條DNA鏈的復(fù)制起點(diǎn)也可能處鏈的復(fù)制起點(diǎn)也可能處于不同的位置。于不同的位置。滾環(huán)復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)不對(duì)稱復(fù)制的存在說(shuō)明：環(huán)不對(duì)稱復(fù)制的存在說(shuō)明：第87頁(yè)/共146頁(yè)第八十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。DNADNA的反轉(zhuǎn)錄合成的反轉(zhuǎn)錄合成Reverse transcription第三節(jié)第三節(jié)第88頁(yè)/共146頁(yè)第八十九頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。RNA腫瘤病毒腫瘤病毒 DNA原病毒（或前病毒）原病毒（或前病毒） RNA腫瘤病毒腫瘤病毒Temin等提出，原病毒（等提出，原病毒（provirus）DNA是是RNA腫瘤病毒在復(fù)制過(guò)程中的中間物。腫瘤病毒在復(fù)制過(guò)程中的中間物。*反轉(zhuǎn)錄的發(fā)

57、現(xiàn)發(fā)展了中心法則反轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則第89頁(yè)/共146頁(yè)第九十頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。DNA中間模板分子（中間模板分子（mRNA）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)中心法則：中心法則：反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則第90頁(yè)/共146頁(yè)第九十一頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒（retroviruses ）： RNA病毒，病毒，含有反轉(zhuǎn)含有反轉(zhuǎn)錄酶錄酶反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄：在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成為模板合成DNA的過(guò)程。的過(guò)程。第91頁(yè)/共146頁(yè)第九十二頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 RNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；聚合

58、酶活性； DNA指導(dǎo)的指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； RNAse H的活性是指它能夠從的活性是指它能夠從53 和和35 兩個(gè)兩個(gè)方向水解方向水解DNA-RNA雜合分子中的雜合分子中的RNA。一、一、反轉(zhuǎn)錄酶以反轉(zhuǎn)錄酶以tRNA為引物合成雙鏈為引物合成雙鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄酶有反轉(zhuǎn)錄酶有3種酶的活性：種酶的活性：第92頁(yè)/共146頁(yè)第九十三頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)第93頁(yè)/共146頁(yè)第九十四頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組和原病毒基因組和原病毒第94頁(yè)/共146頁(yè)第九十五頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病

59、毒RNA基因組轉(zhuǎn)基因組轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈變?yōu)殡p鏈cDNA的途徑的途徑第95頁(yè)/共146頁(yè)第九十六頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。二、反轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的主要活動(dòng)二、反轉(zhuǎn)錄病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的主要活動(dòng)（一）（一）反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA（二）（二）雙鏈雙鏈cDNA插入宿主染色體形成原病毒插入宿主染色體形成原病毒原病毒或前病毒：原病毒或前病毒：存在于真核染色體中和反轉(zhuǎn)存在于真核染色體中和反轉(zhuǎn)錄病毒錄病毒RNA基因組相對(duì)基因組相對(duì)應(yīng)的雙鏈應(yīng)的雙鏈DNA序列。序列。第96頁(yè)/共146頁(yè)第九十七頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。 gag基因基因編碼幾種病毒核心蛋白（衣殼蛋白）編碼幾種病毒核心蛋白

60、（衣殼蛋白）; pol基因基因編碼編碼3種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶種酶：反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶; env基因基因編碼插入病毒外膜磷脂雙層中的糖蛋白。編碼插入病毒外膜磷脂雙層中的糖蛋白。（三）原病毒（三）原病毒DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA具有自我復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含具有自我復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有有3個(gè)基因：個(gè)基因：第97頁(yè)/共146頁(yè)第九十八頁(yè)，編輯于星期六：六點(diǎn) 二十二分。直接翻譯產(chǎn)生多蛋白直接翻譯產(chǎn)生多蛋白Gag和和Gag-Pol。含有包裝信號(hào)，因此構(gòu)成完整的病毒基因組。含有包裝信號(hào)，因此構(gòu)成完整的病毒基因組。大約一半初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)剪接加工形成大約一半初級(jí)轉(zhuǎn)錄