生物制藥工藝學思考題及答案

1、抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1 .青霉素發(fā)酵工藝的建立對抗生素工業(yè)有何意義？青霉素是發(fā)現(xiàn)最早,最卓越的一種B-內(nèi)酰胺類抗生素,它是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品,青霉素是各種半合成抗生素的原料.青霉素的缺點是對酸不穩(wěn)定,不能口服,排泄快,對革蘭氏陰性菌無效.青霉素經(jīng)過擴環(huán)后,形成頭抱菌素母核,成為半合成頭抱菌素的原料.2 .如何根據(jù)青霉素生產(chǎn)菌特性進行發(fā)酵過程限制？青霉素在深層培養(yǎng)條件下,經(jīng)歷7個不同的時期,每個時期有其菌體形態(tài)特性,在規(guī)定時間取樣,通過顯鏡檢查這些形態(tài)變化,用于工程限制.第一期：分生抱子萌發(fā),形成芽管,原生質(zhì)未分化,具有小泡.第二期：菌絲繁殖,原生質(zhì)體具有嗜堿性,類脂肪小顆粒.第三期：形成脂肪包

2、含體,積累儲蓄物,沒有空洞,嗜堿性很強.第四期：脂肪包含體形成小滴并減少,中小空泡,原生質(zhì)體嗜堿性減弱,開始產(chǎn)生抗生素.第五期：形成大空泡,有中性染色大顆粒,菌絲呈桶狀.脂肪包含體消失,青霉素產(chǎn)量提升.第六期：出現(xiàn)個別自溶細胞,細胞內(nèi)無顆粒,仍然桶狀,釋放游離氨,pH上升.第七期：菌絲完全自溶,僅有空細胞壁.一到四期為菌絲生長期,三期的菌體適宜為種子.四到五期為生產(chǎn)期,生產(chǎn)水平最強,通過工藝舉措,延長此期,獲得高產(chǎn).在第六期到來之前發(fā)束發(fā)酵.3 .青霉素發(fā)酵工程的限制原理及其關鍵點是什么？限制原理：發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖,硫酸錢以及前提物質(zhì)苯乙酸鹽,補糖率是最關鍵的限制指標,不同時期分段限制

3、.在青霉素的生產(chǎn)中,及時調(diào)節(jié)各個因素減少對產(chǎn)量的影響,如培養(yǎng)基,補充碳源,氮源,無機鹽流加限制,添加前體等；限制適宜的溫度和ph,菌體濃度.最后要注意消沫,影響呼吸代謝.4 .青霉素提煉工藝中采用了哪些單元操作？青霉素不穩(wěn)定,發(fā)酵液預處理、提取和精制過程要條件溫和、快速,預防降解.提煉工藝包括如下單元操作：預處理與過濾：在于濃縮青霉素,除去大局部雜質(zhì),改變發(fā)酵液的流變學特征,便于后續(xù)的別離純化過程.萃取：其原理是青霉素游離酸易溶于有機溶劑,而青霉素易溶于水.脫色：萃取液中添加活性炭,除去色素,熱源,過濾,除去活性炭.結(jié)晶：青霉素鉀鹽在乙酸丁酯中溶解度很小,在乙酸丁酯萃取液中參加乙酸鉀-乙醇溶液

4、,青霉素鉀鹽可直接結(jié)晶析出.氨基酸發(fā)酵工藝1 .如何對谷氨酸發(fā)酵工藝過程進行調(diào)控？發(fā)酵過程流加錢鹽、尿素、氨水等氮源,補充NH4+;生物素適量限制在2-5閔/L;pH限制在中性或微堿性；供氧充足；磷酸鹽適量.2 .氨基酸生產(chǎn)菌有什么特性,為什么？L-谷氨酸發(fā)酵微生物的優(yōu)良菌株多在棒狀桿菌屬、小短桿菌屬、節(jié)桿菌屬和短桿菌屬中.具有下述共同特性：細胞形態(tài)為短桿至棒狀；無鞭毛,不運動；不形成芽抱；革蘭氏陽性；生物素缺陷型；三竣酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑突變；在通氣培養(yǎng)條件下產(chǎn)生大量L-谷氨酸.3 .生物素在谷氨酸發(fā)酵過程中的作用是什么？生物素是不飽和脂肪酸合成過程中所需的乙酰CoA的輔酶.生物素缺陷型菌種

5、因不能合成生物素,從而抑制了不飽和脂肪酸的合成.而不飽和脂肪酸是磷脂的組成成分之一.因此,磷脂的合成量也相應減少,這就會導致細胞膜結(jié)構(gòu)不完整,提升細胞膜對谷氨酸的通透性,解除其對谷氨酸脫氫酶的抑制,源源不斷生產(chǎn)谷氨酸.維生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1 .比擬分析現(xiàn)行維生素C的兩種生產(chǎn)工藝過程及本質(zhì)區(qū)別,有什么優(yōu)勢？現(xiàn)行的維生素c生產(chǎn)工藝過程有：萊氏化學合成法和兩步發(fā)酵法.萊氏化學合成法：D-葡萄糖為原料,進過催化氫化生成D-山梨醇,然后生物氧化轉(zhuǎn)變?yōu)長-山梨糖,酸性液中丙酮化,對a-3二仲醇進行保護.L-山梨糖高鎰酸鉀在堿性溶液中氧化為二丙酮-2-酮-L-古龍酸,除去丙酮,內(nèi)酯化和烯醇化得到L-抗壞血酸.

6、整個合成過程必須保持第4位碳原子的構(gòu)型不變.兩部發(fā)酵法：催化氫化：催化氫化D-葡萄糖,限制壓力,在氫做復原劑、饃做催化劑的條件下,將醛基復原成醇基,從而制備D-山梨醇.第一部發(fā)酵：D-山梨醇C2位羥基氧化為玻基,其他基團不變,微生物轉(zhuǎn)化得L-山梨糖.第二部發(fā)酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸需要將C1位醇基氧化為竣基,保持其他基團不發(fā)生變化.其中兩步發(fā)酵法更具有優(yōu)勢.原因如下：以生物氧化代替化學氧化簡化了生產(chǎn)工藝.省略了丙酮化反響步驟,節(jié)省了丙酮、硫酸等大量化工原料和其防爆設備,節(jié)約了本錢,有利于平安生產(chǎn).三廢和污染較小.提升了生產(chǎn)水平.2 .維生素C的生產(chǎn)工藝中,手性中央是如何實現(xiàn)的？維生

7、素C分子中含有兩個手性碳原子,故有四個光學異構(gòu)體.其中L(+)-抗壞血酸括性最高,D(-)-異抗壞血酸活性僅為其20%,工業(yè)上將其作為食品抗氧劑.D(-)-抗壞血酸和L(+)-異抗壞血酸幾乎無活性.3 .在未來,一步發(fā)酵能取代兩部發(fā)酵,成為維生素生產(chǎn)的主流工藝嗎,為什么？一步法發(fā)酵對工業(yè)菌株的山梨醇/糖旁路代謝途徑進行敲除.與原始菌株比擬,發(fā)現(xiàn)單菌發(fā)酵24h后,培養(yǎng)基中剩余的山梨醇糖含量根本保持恒定,NSR缺失株相對于原始菌株殘?zhí)橇刻嵘?5.9%.基因工程制藥工藝1 .工程菌與宿主菌對培養(yǎng)基要求有何不同,為什么？碳源：大腸桿菌以蛋白月東等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；酵母利用葡萄糖、半乳糖等單糖類

8、物質(zhì)為碳源.氮源：不同工程菌對氮源利用水平差異大,具有很高的選擇性.大腸桿菌利用酵母粉等大分子有機氮源；酵母利用氨基酸為氮源.選擇劑：基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因,抗生素作為選擇劑；基因工程酵母菌常用氨基酸營養(yǎng)缺陷型.2 .影響工程菌培養(yǎng)工藝的主要參數(shù)是什么？如何優(yōu)化限制？溫度：生長與生產(chǎn)溫度不一致.較高溫度表達量大,易形成包涵體.策略：較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì).對于熱敏感的蛋白質(zhì),高溫會降解破壞.策略：生產(chǎn)期可采用先高溫,然后低溫,變溫表達,預防蛋白質(zhì)降解.pH:了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后,進一步設法限制pH在適宜的范圍內(nèi).分階段限制pH:根據(jù)試驗結(jié)果來確定生長最適p

9、H和產(chǎn)物最適pH,以到達最正確生產(chǎn).溶解氧：從供給量和需要量菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累二個方面考慮,使之需氧不超過設備的供氧水平,在臨界溶解氧濃度之上.3 .誘導物對生長和產(chǎn)物合成有何影響,為什么？誘導物用來誘導表達型工程菌.在細胞生長到一定階段,必需添加誘導物,以解除目標基因的抑制狀態(tài),活化基因,進行轉(zhuǎn)錄和譯,生成產(chǎn)物.適宜的誘導時間非常重要.誘導物的濃度及其發(fā)酵溫度會影響表達量和產(chǎn)物存在形式.化學誘導型啟動子：lzc、tac、T7等,誘導時間為對數(shù)生長期.溫度誘導型啟動子：Pl、Pr等,誘導時間為對數(shù)期或稍后一些.基因工程制藥工藝1 .什么是基因工程菌,工程菌構(gòu)建的根本過程和各階段的主

10、要任務是什么,所涉及基因工程原理是什么？將目的基因?qū)爰毦w內(nèi)使其表達,產(chǎn)生所需要的蛋白的細菌稱為基因工程菌.工程菌構(gòu)建的根本過程如下：目標基因克隆PCR、文庫篩選、化學合成一表達載體構(gòu)建酶切、鏈接一遺傳轉(zhuǎn)化與篩選外源基因?qū)肱c培養(yǎng)一工程菌獲得新形狀、功能、產(chǎn)生物質(zhì)酶切：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂,產(chǎn)生相應的限制性片段.DNA+緩沖液+限制性內(nèi)切酶；37C,1小時；加熱、力口EDTA終止；電泳檢查酶切完整性鏈接：DNA雙鏈上相鄰的3羥基和5磷酸基團共價結(jié)合形成3-5磷酸二酯鍵,使原來斷開的DNA缺口重新連接起來.載體片段和基因片段,緩沖液,連接酶；16-26C,數(shù)小時；70c加熱10

11、min終止反響轉(zhuǎn)化：把外源基因?qū)胨拗骷毎倪^程.氯化鈣法向大腸桿菌導入外源基因2 .目標基因克隆的主要方法有哪些？分析其特點及其適用范圍PCR擴增.優(yōu)點：簡便快速,高效,數(shù)kb單基因克隆.缺點：DNA聚合酶活性和保真性限制.94C變性一55C退火一72c延伸一94c變性文庫篩選.優(yōu)點：長片段,無堿基錯誤,位置序列基因克隆.缺點：繁瑣,過程復雜,耗時,昂貴.化學合成：簡便,準確,序列基因克隆,引物合成.缺點：受合成儀性能限制,長度很短.3 .大腸桿菌中高效表達蛋白藥物著重設計哪幾個方面？為了保證工程菌構(gòu)建的有效性,必須遵循GMP及其有關生物制品研究技術指導原那么,做好菌種的記錄和治理.表達載體

12、,詳細記錄表達載體,包括基因的來源、克隆和鑒定,表達載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性.宿主細胞：詳細記錄宿主細胞的資料,包括細胞株系名稱、來源、傳代歷史、鑒定結(jié)果及根本生物學特性等.目標基因序列：目標基因的序列包括插入基因和表達載體兩端限制區(qū)的核甘酸序列,以及所有與表達有關的序列,做到序列清楚.重組人干擾素生產(chǎn)工藝1 .重組人干擾素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條,有何缺點？體外誘生干擾素制備工藝：仙臺病毒誘導人白細胞：血漿一人白細胞病毒誘導一別離純化一人白干擾素.缺點：產(chǎn)量低,1gIFN需要105L人血白細胞,來源困難,工藝復雜,收率低,價格昂貴,潛在的血源性病毒污染的可能性.Namaka細胞培養(yǎng)病毒培養(yǎng)一合

13、成干擾素一別離純化一多壓型混合干擾素.優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn),用細胞培養(yǎng)8000Lo缺點：活性低,退出臨床應用.工程菌構(gòu)建一發(fā)酵培養(yǎng)一包涵體一復性一重組人干擾素.工藝特點：發(fā)酵過程,隨后變性、復性過程.缺點：生物合成、純化及制劑階段均使用了一些動物或人血液提取成分,仍然沒有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險.工程CHO細胞系構(gòu)建一細胞培養(yǎng)一收集培養(yǎng)液一別離純化一重組人干擾素.工藝特點:分泌表達,產(chǎn)量低,本錢高,過程限制嚴格.可以做到無血清培養(yǎng).基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝.工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時,無需變性、復性過程,獲得有活性產(chǎn)品,純化過程：淘汰抗體親和層析,制劑中采用非人血清白

14、蛋白新型保護劑,使得整個制造過程中不使用任何血液提取成分.2 .重組人干擾素發(fā)酵工段的關鍵限制點是什么,如何實現(xiàn)最優(yōu)化過程限制？搖瓶培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)：30C,pH7.0,250rpm,16-20h;種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐,接種量10%培養(yǎng)：30C,pH7.0限制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速.3 .干擾素純化工藝的原理是什么？基于蛋白質(zhì)的電荷性除去雜質(zhì),準確限制緩沖液和上樣液的pH及電導值,純化干擾素4 .干擾素純化工藝過程中各工段的目的是什么？溶解粗干擾素：配置緩沖液超純水,pH7.5磷酸緩沖液,0.45pm濾器和10ku超濾系統(tǒng),百級層流下收集,冷卻至2-10Co在均漿器中完全溶解粗

15、干擾素.等點沉淀與疏水層析：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0,沉淀雜蛋白,離心收集上清液含有人干擾素.用NaOH調(diào)節(jié)上清液pH7.0,并用5MNaCl調(diào)節(jié)溶液電導值180ms/cm,上樣,進行疏水層析,利用干擾素的疏水性進行吸附.在2-10C下,用0.025M磷酸緩沖液pH7.0+1.6MNaCl進行洗滌,除去非疏水性蛋白.用0.01M磷酸緩沖液pH8.0進行洗脫,收集洗脫液,干擾素.或等電點沉淀與鹽析：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5,調(diào)節(jié)電導值40ms/cm,2-10C靜置過夜,除雜蛋白.1000ku超濾膜過濾,除去大蛋白.調(diào)整溶液pH8.0,10ku超濾膜,0.005M緩沖液.陰離子交換層析與濃縮：0.01M磷酸

16、緩沖液pH8.0平衡樹脂,鹽濃度線性梯度550ms/cm進行洗脫,2-10C,配合SDS-PAGE收集干擾素峰.把目標微分合并,調(diào)整溶液pH和電導值,10ku超濾膜,0.05M醋酸緩沖液5.0中透析.陽離子交換層析與濃縮：用0.1M醋酸緩沖液pH0.5平衡樹脂.上樣,相同緩沖液沖洗.鹽濃度線性梯度5-50ms/cm進行洗脫,配合SDS-PAGE收集干擾素峰.合并儲分,10ku超濾膜系統(tǒng).凝膠過濾層析：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液pH7.0清洗系統(tǒng)和樹脂.上樣,相同洗脫液進行洗脫.合并干擾素局部.無菌過濾分裝：0.22口膜過濾干擾素溶液,分裝,-20C以下的冰箱中保存.動物細胞培養(yǎng)制

17、藥工藝1 .離體動物細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的代謝特征是什么？蛋白質(zhì)的合成、修飾、分泌功能與制藥有何關系？葡萄糖代謝：糖酵解為主,生成丙酮酸和乳酸.丙酮酸經(jīng)TCA循環(huán),氧化產(chǎn)生CO2和水,釋放能量.葡萄糖一小局部進入PPP途徑,生成4、5、7碳糖和NADPH.谷氨酰胺：作為氮源,轉(zhuǎn)氨、脫氨為主,合成非必需氨基酸.大多數(shù)谷氨酰胺通過脫氨生成谷氨酸,并釋放錢離子.小局部谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他喋吟、喀咤和氨基糖等合成代謝的前體.氨基酸在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體上,以mRNA為模板,進行密碼譯,生成蛋白質(zhì)的多肽鏈.在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和高爾基體內(nèi)加工修飾形成糖基化蛋白質(zhì).糖基結(jié)構(gòu)易變化,不同細胞系糖基化特征不同

18、,要根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)選擇適宜細胞系.2 .制藥動物細胞系的種類和特點有哪些？有限細胞系：是生長和壽命有限的細胞,經(jīng)過假設干傳代培養(yǎng)后失去增殖水平,老化死亡.有限生長,無致瘤性,有接觸抑制性.e.g.2BS.壽命取決于細胞來源的物種和年齡、器官.胚成纖維細胞人50代,雞胚30代,小鼠8代無限細胞系：壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細胞系,可連續(xù)培養(yǎng).也稱為永久細胞系或連續(xù)細胞系.沒有接觸抑制現(xiàn)象,對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求低,倍增時間短,非常適合于制藥工業(yè)生產(chǎn).人源細胞系：Namalwa,WI-38,MRC-5哺乳動物細胞系：CHO,貼壁或懸浮培養(yǎng),對剪切力和滲透壓有較高的忍受水平.BHK-21,C1

19、27,Vero雜交瘤細胞系：脾臟B細胞與骨髓瘤細胞通過原生質(zhì)體融合,獲得的雜交細胞.無血清培養(yǎng),高密度懸浮生長,容易轉(zhuǎn)染和生長,大量分泌和高效表達3 .與大腸桿菌和酵母系統(tǒng)相比,哺乳動物源細胞系統(tǒng)制藥的優(yōu)缺點,如何選擇？CHO細胞：Chinesehamsterovary,中國倉鼠卵巢,亞二倍體核型,2n=22.特點:貼壁型生長,也可懸浮培養(yǎng),對剪切力和滲透壓有較高的忍受水平.最為普遍和成熟表達糖基化蛋白藥物的細胞.多種衍生突變株,高表達.BHK-21細胞：成纖維樣細胞,非整倍體,2n=44.用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白.C127細胞,貼壁生長,適合于牛乳頭病毒DNA載體的轉(zhuǎn)化.Vero細胞

20、：多倍體核型,貼壁依賴性.Vero6最為常用,增至病毒,生產(chǎn)疫苗.4.工程動物細胞系的建立：根本過程,表達載體設計,轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)方案篩選和鑒定方法.它們與基因工程微生物的異同是什么?大腸桿菌動物細胞系載體表達載體穿梭表達載體啟動子、終止子噬菌體T7,PLLac,Tae,Trac病毒：SV40,CMV;動物：BGHI藥物基因密碼優(yōu)化密碼優(yōu)化細胞定位染色體外染色體整合表達方式誘導型組成型大桿菌動物細胞系基因克隆PCR及其相關方法PCR及其相關方法表達或體篩選酶切、連接.轉(zhuǎn)化通用菌,抗生素;酶切、連接.轉(zhuǎn)化通用菌,抗生素彳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染宿主菌熱擊,電轉(zhuǎn)細胞電轉(zhuǎn),脂質(zhì)體表達篩選杭生素.Amp.表達量,活性結(jié)構(gòu)

21、G418,MTX,表達量,活性結(jié)構(gòu)建庫QC形態(tài),遺傳穩(wěn)定性,生化,恚達核型,穩(wěn)定性,生產(chǎn)水平5.動物細胞培養(yǎng)基組成成分及其作用是什么？與微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基相比,有何特殊性？動物細胞培養(yǎng)基的成分主要有糖類、氨基酸、維生素與無機鹽、激素及附加成分.作用:糖類提供細胞生長的碳源和能源.分解后釋放出能量ATP.氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?間接提供能量.維生素既不是細胞的物質(zhì)根底,也不是能量物質(zhì),對代謝和生長起調(diào)節(jié)和限制作用.無機鹽是細胞代謝所需酶的輔基,同時保持細胞的滲透壓和緩沖PH的變化.激素對細胞的生長有刺激作用.貼附因子的作用是讓細胞的貼壁生長.工程微生物動物細胞噗源多傍單蟹荀萄

22、糖*谷氨酰胺氮源蛋白質(zhì)-無機氮氨基酸無機鹽大量元素大量,微晶元素生長因子一般不加維生素激素、附加成分水合格地下水純潔水其他消沫劑、前體.促進劑)剪切保護劑.醐紅.生長基質(zhì)6.生產(chǎn)用最適動物細胞培養(yǎng)基應該選擇哪種,為什么?合成培養(yǎng)基,組分穩(wěn)定,容易配置.已有幾十種合成培養(yǎng)基,大局部已商品化7.如何限制動物細胞培養(yǎng)基的質(zhì)量?培養(yǎng)用水質(zhì)：必須根據(jù)GMP要求進行制備,除去普通水中的各類元素、有毒或有害物質(zhì)及微生物和熱源,到達純水標準.緩沖?H2CO3/NaCHO3；NaH2PONazHPO4；恒定pH.平衡鹽溶液：BBS,由NaCl、無機鹽和葡萄糖、緩沖劑、指示劑組成.滿足細胞對鹽離子、碳營養(yǎng)要求；p

23、H和滲透壓要求；直觀觀察pH.磷酸鹽緩沖液：PBS,KCl、KH2P.4、NaCl、NaHPO4.培養(yǎng)物、器皿的洗滌液.氨基酸配置：50倍濃縮液.使用L型氨基酸,對于DL混合型氨基酸,使用量應該加倍.谷氨酰胺不穩(wěn)定,需單獨配置100倍濃縮液,-20C保存.8 .基質(zhì)依賴性與非依賴性細胞系對培養(yǎng)條件的要求有什么不同？如何滿足？貼壁依賴性細胞：依賴于生長基質(zhì),并在外表才能生長的細胞.只能貼壁生長.多數(shù)天然細胞.非貼壁依賴性細胞：不依賴于生長基質(zhì),可懸浮生長.淋巴細胞、雜交瘤細胞、腫瘤細胞.生長基質(zhì)：改變介質(zhì)外表特性,支撐、促進動物細胞貼附的物質(zhì).為支持介質(zhì)外表提供適量帶正電荷,細胞被吸附在介質(zhì)上.

24、9 .細胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種方法,有何特點,如何選擇應用？單層貼壁培養(yǎng).單層貼壁培養(yǎng)是指把細胞貼附于一定的固體支持外表上,生長形成單層細胞的培養(yǎng)方法,適合于貼壁依賴性細胞培養(yǎng).懸浮培養(yǎng).懸浮培養(yǎng)是指細胞在細胞反響器內(nèi)游離懸浮生長的培養(yǎng)過程,主要對于非貼壁性依賴性細胞,如雜交瘤細胞.微囊培養(yǎng).把動物細胞包埋在微載體內(nèi)或膠囊內(nèi)固定化后,進行懸浮培養(yǎng),適合于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞.微載體培養(yǎng).微載體是三維培養(yǎng)系統(tǒng),有很大的比外表積,細胞貼附于載體上增值,再懸浮于細胞液中,兼具有貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點.10.比擬微生物發(fā)酵限制過程的異同動物細胞微生物溫度在線,恒溫,水套層,電熱片,加溫二基點,發(fā)

25、酵熱對生長和生產(chǎn)影響,變溫限制,降溫攪拌,泡沫低轉(zhuǎn)速,加剪切保護劑,消沫劑基于供氧與混合,化學消沫劑與分散劑,機械消沫溶解氧臨界氧濃度供氧與耗氧的平衡,臨界氧濃度之上CO2需要通入,調(diào)下pH尾氣,呼吸強度PH恒定,緩沖劑,通氣,補料,綜合限制f點,變pH,加酸/堿；緩沖劑,補料代謝檢測與分析底物消耗,副產(chǎn)物生成,胞內(nèi)代謝,分泌底物消耗,產(chǎn)物的生成,生物化學變化補料補充營養(yǎng),限制代謝過程解除底物抑制,增加前體放料解除副廣物,收獲產(chǎn)物解除產(chǎn)物抑制重組人紅細胞生成素的生產(chǎn)工藝1.比擬各種表達系統(tǒng)生產(chǎn)rhEPO的優(yōu)缺點.SV40病毒啟動子的表達載體,在COS-1中瞬時表達hEPO.昆蟲SF9細胞中桿狀

26、病毒載體表達rhEPO.產(chǎn)率有所改善,糖基化程度較小.家蠶系統(tǒng)表達,糖基化簡單,藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題.大腸桿菌表達,僅具體外抗原結(jié)合活性.干擾素-“基因啟動子的rhEPO表達載體,BALL-1細胞,產(chǎn)生較高量的rhEPO.CHO、BHK細胞中穩(wěn)定表達,rhEPO與天然EPO結(jié)構(gòu)、活性相似.2. CHO培養(yǎng)生產(chǎn)rhEPO的根本工藝過程及其限制點是什么,為什么？復蘇：液氮凍存的CHO細胞系在37c中水浴快速融化.無菌離心,棄上清.培養(yǎng)：加適量DMEM10%小牛血清,37C、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),連續(xù)傳三代.消化：用胰蛋白酶消化貼壁細胞后,制成細胞濃度約為2.5X10孫/ml.用于接種.

27、反響器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液,高壓滅菌.接種：排出PBS緩沖液,加DMEM培養(yǎng)基含10%血清,接入種子細胞.貼壁培養(yǎng)：pH7,50r/min,37C,DO50-80%.擴增培養(yǎng)：80100r/min.pH7,37C.灌流培養(yǎng)：限制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件,進行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng).收獲培養(yǎng)物：連續(xù)收獲,4C8c保存.限制點：攪拌限制：接種后,攪拌速度緩慢,使細胞貼附于載體上,隨著細胞數(shù)量的增加逐漸提升攪拌速度.溫度限制：較為嚴格,恒定37CpH值限制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定.溶解氧限制：在50-80%的范圍內(nèi),通入氧氣、空氣、氫氣或氮氣的

28、比例混合氣體.葡萄糖限制：流加補料代謝廢物限制：監(jiān)測俊、乳酸鹽類等,維持較低濃度,減少對細胞損害.3. rhEPO別離純化工藝中使用了哪些操作單元,為什么？收獲培養(yǎng)液、透析、過濾、DEAE離子交換、凝膠過濾.三廢處理工藝1 .簡述制藥企業(yè)清潔生產(chǎn)的途徑資源綜合利用一一原料資源的綜合利用、水資源的綜合利用、二次資源綜合利用、廢物綜合利用；改革工藝和裝備一一原料處理工藝的改革、產(chǎn)品制造工藝的全過程統(tǒng)籌、裝備技術的更新；改良操作和增強治理；必要的末端處理.2 .簡述制藥工業(yè)的末端污染特點制藥廠排出的污染物通常具有毒性、刺激性和腐蝕性.化學制藥廠的污染物還具有數(shù)量少、組分多、變化大、間歇排放、pH不穩(wěn)

29、定、COD高等特點.這些特點與防治舉措的選擇有直接關系.3 .制藥廢水分為哪幾種類型？有何特點？如何治理？含懸浮物或膠體的廢水.廢水中所含的懸浮物一般可通過沉淀、過濾或氣浮等方法除去.是廢水的常規(guī)預處理程序.氣浮法的原理：利用高度分散的微小氣泡作為載體去粘附廢水中的懸浮物,使其密度小于水相對密度1而上浮到水面,從而實現(xiàn)固液別離.對于懸浮物質(zhì)：用沉淀、氣浮、過濾等方法去除.對于樹脂狀物：由于不易上浮和沉淀,須采用輔助手段如通入壓縮空氣、直接蒸汽加熱、參加無機鹽等使懸浮物聚集起來沉淀或氣浮別離.對于極小膠體：可用混凝法或吸附法處理.含酸堿性廢水.化學制藥過程中常排出各種含酸或堿的廢水,其中以酸性廢水居多.含酸濃度高的廢水一一應考慮盡量回收利用及綜合利用,如利用廢硫酸制作磷肥等.含酸堿1%以下而沒有經(jīng)濟價值的廢水一一經(jīng)中和后才能排放,以免腐蝕排水管道,危害水中生物.中和時,盡量采用廢堿或廢酸,也可考慮用氨水中和,然后用于灌溉.假設中和后