微生物的生長及其控制

1、第六章 微生物的生長及其控制要點：微生物生長的測定：測定微生物的生長情況，可選用微生物的細(xì)胞數(shù)目或生長量等作為指標(biāo)。 測定細(xì)胞數(shù)目常用直接計數(shù)法、間接計數(shù)法以及其他計數(shù)法（比濁法和膜過濾等）；測定微生物的生長量常用測體積、稱重量的直接法以及測含氮量、DNA含量和其他生理指標(biāo)的間接法。同步生長：通過同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)，稱為同步生長。獲得微生物同步生長的方法主要有選擇法和誘導(dǎo)法兩大類。典型生長曲線：單細(xì)胞微生物在分批培養(yǎng)時，其生長規(guī)律可用典型生長曲線描述，通?？煞譃樗膫€時期：延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。研究和運用微生物生長規(guī)律對基礎(chǔ)理論研究和指導(dǎo)生產(chǎn)實

2、踐都有重要的意義，連續(xù)培養(yǎng)的產(chǎn)生就是一例。影響微生物生長的因素：影響微生物生長的環(huán)境因素主要是溫度、氧氣和pH。根據(jù)最適生長溫度的不同可將微生物分為三類：嗜冷菌、嗜溫菌和嗜熱菌。根據(jù)微生物和氧的關(guān)系，可把它們分為專性好氧菌、兼性厭氧菌、微好氧菌、耐氧菌和（專性）厭氧菌五大類。不同微生物有其生長的最適pH范圍；微生物生長會改變環(huán)境的pH并導(dǎo)致對自身生長的不利狀態(tài)，為此，在實驗室或生產(chǎn)實踐中就應(yīng)采用相應(yīng)措施調(diào)整微生物培養(yǎng)物的pH。微生物培養(yǎng)法：實驗室和生產(chǎn)實踐中培養(yǎng)微生物的方法和裝置很多。在實際工作中通常根據(jù)微生物的種類和培養(yǎng)目的等方面的不同進(jìn)行選擇。微生物生長的控制：微生物研究或生產(chǎn)實踐中，常常

3、需要控制所不期望的微生物的生長。任何殺死或抑制微生物的方法都可以達(dá)到控制微生物生長的目的，它們包括加熱、低溫、干燥、輻射、過濾等物理方法和消毒劑、防腐劑、化學(xué)治療劑等化學(xué)方法兩大類。滅菌：利用強烈的理化因素殺死物體中所有微生物的措施稱為滅菌。消毒：采用溫和的理化因素殺死物體中所有病原微生物的措施稱為消毒。防腐：利用某種理化因素抑制微生物生長的措施稱為防腐。化療：利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病原微生物或病變細(xì)胞的治療措施稱為化療。微生物在適宜的環(huán)境條件下，不斷吸收營養(yǎng)物質(zhì)，按其自身方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化（合成）作用的速度超過了異化（分解）作用，則其原生質(zhì)的總量(重量、體積、大小

4、)就不斷增加，于是出現(xiàn)了個體細(xì)胞的生長；如果這是一種平衡生長，即各種細(xì)胞組分是按恰當(dāng)比例增長時，則達(dá)到一定程度后就會引起個體數(shù)目的增加，對單細(xì)胞的微生物來說，這就是繁殖，不久，原有的個體就發(fā)展成為一個群體。隨著群體中各個個體的進(jìn)一步生長、繁殖，就引起了這一群體的生長。群體的生長可用其重量、體積、個體濃度或密度等作指標(biāo)來測定。所以個體和群體間有以下關(guān)系：個體生長 個體繁殖 群體生長群體生長 個體生長 個體繁殖除了特定的目的以外，在微生物的研究和應(yīng)用中，只有群體的生長才有意義，因此，在微生物學(xué)中，凡提到“生長”時，一般均指群體生長，這一點與研究大型生物時有所不同。第一節(jié) 微生物生長的測定測定不同種

5、類、不同生長狀態(tài)微生物的生長情況，需要選用不同的指標(biāo)。通常對單細(xì)胞微生物來說，既可測定細(xì)胞數(shù)目，又可測定生長量；而對多細(xì)胞(尤其是絲狀真菌)，則常以菌絲生長的長度等作為生長指標(biāo)。測定微生物生長的方法多種多樣，在實際工作中，可根據(jù)研究對象或要解決的問題加以選擇。一、微生物細(xì)胞數(shù)目的測定測定微生物細(xì)胞數(shù)目的方法很多，但它們都只適用于測定處于單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌，而對于放線菌和霉菌等絲狀生長的微生物而言，則只能測定其孢子數(shù)。（一）直接計數(shù)法指用計數(shù)板（如血球計數(shù)板、細(xì)菌計數(shù)板）在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)的方法。此法十分常用，但所得的數(shù)目是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。為解決這一矛盾，已有用特殊染

6、料作活菌染色后再用光學(xué)顯微鏡計數(shù)的方法，例如用美藍(lán)液對酵母菌染色后，其活細(xì)胞為無色，而死細(xì)胞則為藍(lán)色，故可作分別計數(shù)；又如，細(xì)菌經(jīng)吖啶橙染色后，在紫外光顯微鏡下可觀察到活細(xì)胞發(fā)出橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)出綠色熒光，因而也可作活菌和總菌計數(shù)。（二）間接計數(shù)法是一種活菌計數(shù)法，主要依據(jù)活菌在液體培養(yǎng)基中會使其變混或在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的原理而設(shè)計的。1平板菌落計數(shù)法此法適用于各種好氧或厭氧微生物。其主要操作（圖6-1）是把稀釋后的一定量菌樣通過澆注或涂布的方法，讓其內(nèi)的微生物單細(xì)胞一一分散在瓊脂平板上（內(nèi)），待培養(yǎng)后，每一活細(xì)胞就形成一個單菌落，此即“菌落形成單位”（cfu），根據(jù)每皿上形成

7、的cfu數(shù)乘上稀釋度就可推算出菌樣的含菌數(shù)。此法最為常用，但操作較煩瑣且要求操作者技術(shù)熟練。為克服此缺點，國外已出現(xiàn)多種微型、快速、商品化的用于菌落計數(shù)的小型紙片或密封瓊脂板。其主要原理是利用加在培養(yǎng)基中的活菌指示劑TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)，它可使菌落在很微小時就染成易于辨認(rèn)的玫瑰紅色。圖6-1 平板菌落計數(shù)法的一般步驟2. 液體稀釋法對未知菌樣作連續(xù)的10倍梯度稀釋。根據(jù)估計數(shù)，從最適宜的3個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5ml試樣，接種到3組共15支裝有培養(yǎng)液的試管中(每管接入1ml)。經(jīng)培養(yǎng)后，記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查MPN（最大可能數(shù)）表，再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)就可

8、計算出其中的活菌含量。 （三）其他計數(shù)法1. 比濁法這是測定無色菌懸液中總細(xì)胞數(shù)的快速方法。其原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度（O.D.）成正比，可借助于分光光度計在一定波長（450nm650nm）下測量菌懸液的光密度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出菌液濃度。此法雖然靈敏度較差，然而卻具有簡便、快速、不干擾或不破壞樣品的優(yōu)點。由于可使用側(cè)臂三角瓶在不同的培養(yǎng)時間重復(fù)測定樣品的濁度，因而被廣泛地用作微生物生長速率的測定。2. 膜過濾法此法常用于測定量大、含菌濃度低的流樣樣品（如水、空氣等）。其主要操作是將定量的樣品通過膜過濾器，菌體便被阻留在濾膜上，然后將濾膜放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

9、計算其上的菌落數(shù)，求出樣品中的含菌數(shù)。二、微生物生長量的測定微生物生長的測定也可以不測定細(xì)胞的數(shù)目，而代之以測定細(xì)胞的生長量以及與生長量相平行的生理指標(biāo)。此類方法適用于一切微生物。（一）直接法1. 測體積法這是一種粗放的方法，用于初步比較。例如把待測培養(yǎng)液放在刻度離心管中作自然沉降或進(jìn)行一定時間的離心，然后觀察其體積。2. 稱重法包括濕重法和干重法。將微生物培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞沉淀物然后稱重的方法稱為濕重法；將離心得到的細(xì)胞沉淀物置于100105的烘箱中干燥過夜至恒重后稱重的方法稱為干重法。微生物的干重一般為其濕重的1020。此法適用于菌體濃度較高的樣品，并要求除盡雜質(zhì)。（二）間接法1. 含氮

10、量測定法一般微生物細(xì)胞的含氮量比較穩(wěn)定，故可用凱氏定氮法等測其總氮量，再乘以系數(shù)625即為粗蛋白含量。蛋白含量越高，說明菌體數(shù)和細(xì)胞物質(zhì)量越高。2. DNA含量測定法微生物細(xì)胞的DNA含量較穩(wěn)定，故可采用適當(dāng)?shù)臒晒庵甘緞┗蛉旧珓┡c菌體DNA作用，利用熒光比色或分光光度計法測得DNA的含量。3. 其他生理指標(biāo)法如測定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸) 等的含量。此外，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、耗氧、粘度和產(chǎn)熱等指標(biāo)，有時也應(yīng)用于生長量的測定。三、絲狀微生物菌絲長度的測定對于絲狀微生物，特別是絲狀真菌，通常是通過測定其菌絲的長度變化來反映它們的生長速率。方法有：（一）培養(yǎng)基表面菌體生長速率測定法主要

11、測定一定時間內(nèi)在瓊脂培養(yǎng)基表面的菌落直徑的增加值。（二）培養(yǎng)料中菌體速率測定法主要測定一定時間內(nèi)在固體培養(yǎng)料(如栽培食用菌的棉籽殼麩皮培養(yǎng)料)中菌絲體向前延伸的距離。 （三）單個菌絲頂端生長速率測定法可在顯微鏡下借助目鏡測微尺測定在一定時間內(nèi)單個菌絲的伸長長度。為了維持菌絲生長，可在載玻片上先用雙面膠做一個小室，內(nèi)盛培養(yǎng)液，將菌絲置于小室后，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察測定。 第二節(jié) 微生物的生長規(guī)律一、微生物的個體生長和同步生長微生物的細(xì)胞是極其微小的，但是，它與一切其他細(xì)胞和個體(病毒例外)一樣，也有一個自小到大的生長過程。在整個生長過程中，微小的細(xì)胞內(nèi)同樣發(fā)生著階段性的極其復(fù)雜的生物化學(xué)變

12、化和細(xì)胞學(xué)變化?？墒?，要研究某一細(xì)胞的這類變化，在技術(shù)上是極為困難的。目前能使用的方法，一是用電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超薄切片，二是使用同步培養(yǎng)技術(shù)，即設(shè)法使某一群體中的所有個體細(xì)胞盡可能都處于同樣細(xì)胞生長和分裂周期中，然后通過分析此群體在各階段的生物化學(xué)特性變化，來間接了解單個細(xì)胞的相應(yīng)變化規(guī)律。這種通過同步培養(yǎng)的手段而使細(xì)胞群體中各個體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)，稱為同步生長。獲得微生物同步生長的方法主要有選擇法和誘導(dǎo)法兩類。1. 選擇法這是一類根據(jù)微生物細(xì)胞在不同生長階段體積與重量不完全相同的原理設(shè)計的方法，其中以膜洗脫法較有效和常用。（1）離心分離法 將不同步的細(xì)胞懸浮在不被該菌利用的蔗糖

13、溶液或葡聚糖液中，通過密度梯度離心將大小不同的細(xì)胞分成不同區(qū)帶，分別取出培養(yǎng)，便可得到同步生長細(xì)胞。（2）過濾分離法 利用孔徑不同的微孔濾膜可將大小不同的細(xì)胞分開。選用適當(dāng)孔徑的微孔濾膜只允許個體較小的剛分裂的細(xì)胞通過濾膜，收集后培養(yǎng)即可獲得同步培養(yǎng)物。（3）膜洗脫法 將異步生長的菌液通過墊有硝酸纖維薄膜的濾器，不同生長階段的細(xì)菌均吸附于膜上，然后翻轉(zhuǎn)濾膜，用無菌的新鮮培養(yǎng)液慢速洗脫，最初流出的是未吸附的細(xì)胞，不久，膜上細(xì)胞開始分裂，分裂后的子細(xì)胞有的不與膜接觸易隨培養(yǎng)液流下。若濾膜面積足夠大，只要收集剛滴下的子細(xì)胞培養(yǎng)液即可獲得滿意的同步生長的細(xì)胞。2. 誘導(dǎo)法主要是通過控制環(huán)境條件如溫度、

14、營養(yǎng)物或能夠影響周期中主要功能的代謝抑制劑等誘導(dǎo)細(xì)胞同步生長。主要有：（1）控制溫度 通過最適生長溫度與允許生長的亞適溫度交替處理可使不同步生長細(xì)胞轉(zhuǎn)為同步分裂的細(xì)胞。在亞適溫度下細(xì)胞物質(zhì)合成照常進(jìn)行，但細(xì)胞不能分裂，使群體中分裂準(zhǔn)備較慢的個體趕上其他細(xì)胞，再換到最適溫度時所有細(xì)胞都同步分裂。（2）控制培養(yǎng)基成分 將不同步生長營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞在缺少主要生長因子的培養(yǎng)基中饑餓一段時間，細(xì)胞都不能分裂，再轉(zhuǎn)到完全培養(yǎng)基中就能獲得同步生長細(xì)胞。如大腸桿菌胸腺嘧啶缺陷型菌株在缺少胸腺嘧啶時DNA合成停止，但RNA和蛋白質(zhì)合成不受影響，30 min后加入胸腺嘧啶，DNA合成立即恢復(fù)，40 min后幾乎所有

15、細(xì)胞都進(jìn)行分裂。也可將不同步菌液在有一定濃度抑制劑(如氯霉素)的培養(yǎng)基里培養(yǎng)一段時間后再接到另一完全培養(yǎng)基中，獲得同步生長細(xì)胞。應(yīng)該明確，保持同步生長的時間因菌種和條件而變化。由于同步群體內(nèi)細(xì)胞個體的差異，同步生長最多只能維持23代，又逐漸變?yōu)殡S機(jī)生長。二、單細(xì)胞微生物的典型生長曲線定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線，稱為生長曲線(growth curve)。當(dāng)把少量純種單細(xì)胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。如以細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間作橫坐標(biāo)，就可畫出一條由延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段組成

16、的曲線，這就是微生物的典型生長曲線。說其“典型”，是因為它只適合單細(xì)胞微生物如細(xì)菌和酵母菌，而對絲狀生長的真菌或放線菌而言，只能畫出一條非“典型”的生長曲線，例如，真菌的生長曲線大致可分為3個時期，即生長延滯期、快速生長期和生長衰退期。典型的生長曲線與非典型的絲狀菌生長曲線兩者的差別是后者缺乏指數(shù)生長期，與此期相當(dāng)?shù)闹皇桥囵B(yǎng)時間與菌絲體干重的立方根成直線關(guān)系的一段快速生長時期。根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)，即每小時分裂次數(shù)（R）的不同，一般可把典型生長曲線粗分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等4個時期（圖6-2）。圖6-2 微生物的典型生長曲線.延滯期，.指數(shù)期，.穩(wěn)定期，.衰亡期（一）延滯期（l

17、ag phase）延滯期又稱停滯期、調(diào)整期或適應(yīng)期。指少量單細(xì)胞微生物接種到新鮮培養(yǎng)液中，在開始培養(yǎng)的一段時間內(nèi)，因代謝系統(tǒng)適應(yīng)新環(huán)境的需要，細(xì)胞數(shù)目沒有增加的一段時間。該期的特點為：生長速率常數(shù)為零；細(xì)胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌可長成絲狀，如巨大芽孢桿菌在接種時，細(xì)胞僅長3.4m，而培養(yǎng)至3h時其長為9.1m ，至5.5h時，竟可達(dá)19.8m；細(xì)胞內(nèi)的RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性；合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加速，易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶； 對外界不良條件如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等理、化因素反應(yīng)敏感。延滯期的長短與菌種的遺傳性、接種齡、接種量及移種前后所處的環(huán)

18、境條件等因素有關(guān)，短的幾分鐘，長的可達(dá)幾小時。采取措施縮短延滯期在發(fā)酵工業(yè)上有重要意義，增加培養(yǎng)基營養(yǎng)、采用最適種齡的健壯菌種(處于指數(shù)期的菌種)接種、加大接種量都可縮短延滯期和發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率。出現(xiàn)延滯期的原因，是由于接種到新鮮培養(yǎng)液中的種子細(xì)胞，一時還缺乏分解或催化有關(guān)底物的酶或輔酶，或是缺乏充足的中間代謝物。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成有關(guān)的中間代謝物，就需要有一段用于適應(yīng)的時間，此即延滯期。（二）指數(shù)期（exponential phase）指數(shù)期又稱對數(shù)期（logarithmic phase），指在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時期。該期的特點是：生長速率常數(shù)R最大

19、，因而細(xì)胞每分裂一次所需的時間代時（generation time，G，又稱世代時間或增代時間）或原生質(zhì)增加一倍所需的倍增時間最短；細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，故菌體各部分的成分十分均勻；酶系活躍，代謝旺盛。在指數(shù)期中，有3個重要參數(shù)，其相互關(guān)系及計算方法為： 設(shè)對數(shù)期t1時刻的菌數(shù)為x1，經(jīng)過n次分裂后，t2時刻的菌數(shù)為x2。（1）繁殖代數(shù)（n） x2 x1 ·2n以對數(shù)表示：lgx2 lgx1 nlg2因此n （lgx2 lgx2）/ lg2 3.322（lgx2 lgx2）（2）生長速率常數(shù)（R） 按前述生長速率常數(shù)的定義可知： R n / ( t2 t1) 3.322（lgx2 lgx

20、2）/( t2 t1)（3）代時（G） 按前述平均代時的定義可知： G 1/R ( t2 t1) /3.322（lgx2 lgx2）不同菌種指數(shù)期的代時不同，同一菌種在不同培養(yǎng)條件下，代時也不同。培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，培養(yǎng)溫度適宜，代時較短；反之則長。指數(shù)期的微生物具有整個群體的生理特性較一致、細(xì)胞各成分平衡增長和生長速率恒定等優(yōu)點，是用作代謝、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌體的最適宿主，也是發(fā)酵工業(yè)中用作種子的最佳材料。（三）穩(wěn)定期（stationary phase）穩(wěn)定期又稱恒定期或最高生長期。其特點是生長速率常數(shù)R等于零，即處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，或正生長與負(fù)生長相等的動態(tài)平衡

21、之中。此期活菌數(shù)達(dá)到最高峰，且保持相對穩(wěn)定。進(jìn)入穩(wěn)定期時，細(xì)胞內(nèi)開始積累糖原、異染顆粒和脂肪等內(nèi)含物；芽孢桿菌一般在這時開始形成芽孢；有的微生物在這時開始以初生代謝物作前體，通過復(fù)雜的次生代謝途徑合成抗生素等對人類有用的各種次生代謝物。穩(wěn)定期到來的原因是：營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡；營養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如CN比不合適等；酸、醇、毒素或H202等有害代謝產(chǎn)物的累積；pH、氧化還原勢等物理化學(xué)條件越來越不適宜；等等。穩(wěn)定期的生長規(guī)律對生產(chǎn)實踐有著重要的指導(dǎo)意義，例如，對以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物（SCP、乳酸等）為目的的某些發(fā)酵生產(chǎn)來說，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期；對維生素、堿基、氨

22、基酸等物質(zhì)進(jìn)行生物測定來說，穩(wěn)定期是最佳測定時期；此外，通過對穩(wěn)定期到來原因的研究，還促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建。（四）衰亡期（decline phase或death phase）在衰亡期中，微生物個體的死亡速度超過新生速度，整個群體呈現(xiàn)負(fù)生長狀態(tài)（R為負(fù)值）。這時，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生多形化，例如會發(fā)生膨大或不規(guī)則的退化形態(tài)；有的微生物因蛋白水解酶活力的增強而發(fā)生自溶；有的微生物在這期會進(jìn)一步合成或釋放對人類有益的抗生素等次生代謝物；而在芽孢桿菌中，往往在此期釋放芽孢；等等。產(chǎn)生衰亡期的原因主要是外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝明顯超過合成代謝繼而導(dǎo)致大量菌體死

23、亡。三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)又稱開放培養(yǎng)，是相對于上述繪制典型生長曲線時采用的那種分批培養(yǎng)或密閉培養(yǎng)而言的。連續(xù)培養(yǎng)是在研究典型生長曲線的基礎(chǔ)上，通過深刻認(rèn)識穩(wěn)定期到來的原因，并采取相應(yīng)的防止措施而實現(xiàn)的。具體地說，當(dāng)微生物以分批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)到指數(shù)期的后期時，一方面以一定速度連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基和通入無菌空氣，并立即攪拌均勻；另一方面，利用溢流的方式，以同樣的流速不斷流出培養(yǎng)物。于是容器內(nèi)的培養(yǎng)物就可達(dá)到動態(tài)平衡，其中的微生物可長期保持在指數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和恒定的生長速率上，于是形成了連續(xù)生長（圖6-3）。圖6-3 連續(xù)培養(yǎng)裝置構(gòu)造示意圖培養(yǎng)液儲備瓶，其上有過濾器（a）和培養(yǎng)基進(jìn)口（b）

24、；蠕動泵； 恒化器，其上有培養(yǎng)基入口（c）、攪拌器（d）、空氣過濾裝置（e）和取樣口（f）；收集瓶，其上有過濾器（g）連續(xù)培養(yǎng)裝置主要有恒濁器和恒化器兩類（表6-1）。恒濁器是根據(jù)培養(yǎng)液細(xì)胞密度調(diào)節(jié)培養(yǎng)液流入的速率，使裝置內(nèi)細(xì)胞密度保持恒定。細(xì)胞密度通過光電控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)。恒化器通過控制某種限制性營養(yǎng)物質(zhì)（生長限制因子）的濃度調(diào)節(jié)微生物的生長及其細(xì)胞密度，使裝置內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定。表6-1 恒濁器與恒化器的比較裝 置控制對象生長限制因子*培養(yǎng)液流速生長速度產(chǎn) 物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無不恒定最高生長速度大量菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)液流速（外控制）有恒定低于最高

25、生長速度不同生長速度的菌體實驗室為主*生長限制因子：凡處于較低濃度內(nèi)可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的某營養(yǎng)物就稱為生長限制因子。連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點是微生物能在比較恒定的環(huán)境中以恒定的速率生長，有利于研究生長速率(或營養(yǎng)物質(zhì))對細(xì)胞形態(tài)、組成和代謝活動的影響，可篩選出新的突變株；連續(xù)培養(yǎng)在生產(chǎn)上可縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)備利用率，提高發(fā)酵工業(yè)的效益，便于自動化生產(chǎn)，減輕勞動強度，已成為當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)的方向。其不足之處是營養(yǎng)物質(zhì)利用率低，雜菌易污染，菌種易退化。第三節(jié) 影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的外界因素很多，除第四章已介紹過的營養(yǎng)條件外，還有許多物理、化學(xué)因素。限于篇幅，以下僅闡述其中最主要的溫度、

26、氧氣和pH 3項。一、溫度由于微生物的生命活動都是由一系列生物化學(xué)反應(yīng)組成的，而這些反應(yīng)受溫度影響又極其明顯，故溫度是影響微生物生長繁殖的最重要因素之一。與其他生物一樣，任何微生物的生長溫度范圍盡管有寬有窄，但總有最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度這3個重要指標(biāo)，這就是生長溫度的三基點。如果把微生物作為一個整體來看，其生長溫度范圍則很廣，可在1095范圍內(nèi)生長。根據(jù)最適生長溫度的不同可將微生物分為三類：嗜冷菌、嗜溫菌和嗜熱菌（表6-2）。表6-2 微生物的生長溫度類型微生物類型生長溫度范圍分布區(qū)域最 低最 適最 高嗜冷菌專性嗜冷型105151520海洋深處、南北極、冰窖兼性嗜冷型5010

27、202530海洋、冷泉、冷藏食品嗜溫菌室溫型102020354045腐生環(huán)境體溫型102035404045寄生環(huán)境嗜熱菌254550607095溫泉、堆肥、土壤對某一具體微生物而言，其生長溫度范圍的寬窄與它們長期進(jìn)化過程中所處的生存環(huán)境溫度有關(guān)。例如，一些生活在土壤中的芽孢桿菌，它們屬寬溫微生物（1565）；大腸桿菌既可在人或動物體的腸道中生活，也可在體外環(huán)境中生活，故也是寬溫微生物（1047.5）；而專性寄生在人體泌尿生殖道中的淋病奈瑟氏球菌則是窄溫微生物（3640）。最適生長溫度經(jīng)常簡稱為“最適溫度”，其涵義為某種微生物分裂代時最短或生長速率最高時的培養(yǎng)溫度。必須強調(diào)指出，對同一種微生物來

28、說，最適生長溫度并非一切生理過程的最適溫度，也就是說，最適溫度并不等于生長得率最高時的培養(yǎng)溫度，也不等于發(fā)酵速率或累積代謝產(chǎn)物最高時的培養(yǎng)溫度，更不等于累積某一代謝產(chǎn)物最高時的培養(yǎng)溫度，例如粘質(zhì)賽氏桿菌的生長最適溫度為37，而其合成靈桿菌素的最適溫度為2025；黑曲霉生長最適溫度為37，而產(chǎn)糖化酶的最適溫度則為3234。這一規(guī)律對指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)有著重要的意義。例如，國外曾報道在產(chǎn)黃青霉總共165 h的青霉素發(fā)酵過程中，運用了上述規(guī)律，即根據(jù)其不同生理代謝過程有不同最適溫度的特點，分成4段進(jìn)行不同溫度培養(yǎng)。具體做法是：接種后在30下培養(yǎng)5h，將溫度降至25培養(yǎng)35h，再下降至20培養(yǎng)85h，最后又

29、升溫至25培養(yǎng)40h后放罐。結(jié)果，其青霉素產(chǎn)量比常規(guī)的自始至終進(jìn)行30恒溫培養(yǎng)的對照組竟提高了14.7。二、氧氣微生物對氧的需要和耐受能力在不同的類群中差別很大，根據(jù)它們和氧的關(guān)系，可把它們粗分成好氧微生物(好氧菌，aerobes)和厭氧微生物(厭氧菌，anaerobes)兩大類，并可進(jìn)一步細(xì)分為5類（圖6-4）。（一）好氧菌好氧菌又可分為專性好氧菌、兼性厭氧菌和微好氧菌3類。1. 專性好氧菌必須在較高濃度分子氧的條件下才能生長，它們有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，具有超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶，絕大多數(shù)真菌和多數(shù)細(xì)菌、放線菌都是專性好氧菌，例如醋桿菌屬、固氮菌屬、銅綠假單胞

30、菌和白喉棒桿菌等。振蕩、通氣、攪拌都是實驗室和工業(yè)生產(chǎn)中常用的供氧方法。2. 兼性厭氧菌以在有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長的微生物，有時也稱“兼性好氧菌”。它們在有氧時靠呼吸產(chǎn)能，無氧時則借發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細(xì)胞含SOD和過氧化氫酶。它們在有氧條件下比在無氧條件下生長得更好。許多酵母菌和不少細(xì)菌都是兼性厭氧菌。例如釀酒酵母、地衣芽孢桿菌以及腸桿菌科的各種常見細(xì)菌，包括大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和普通變形桿菌等。3. 微好氧菌只能在較低的氧分壓下才能正常生長的微生物。也是通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。霍亂弧菌、氫單胞菌屬、發(fā)酵單胞菌屬和彎曲菌屬等都屬于這類微生物。圖6-4 5類對氧

31、關(guān)系不同的微生物在半固體瓊脂柱中的生長狀態(tài)（模式圖）（二）厭氧菌厭氧菌又可分為耐氧菌和（專性）厭氧菌。1. 耐氧菌即耐氧性厭氧菌的簡稱。是一類可在分子氧存在下進(jìn)行發(fā)酵性厭氧生活的厭氧菌。它們的生長不需要任何氧，但分子氧對它們也無害。它們不具有呼吸鏈，僅依靠專性發(fā)酵和底物水平磷酸化而獲得能量。耐氧的機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶（但缺乏過氧化氫酶）。通常的乳酸菌多為耐氧菌，例如乳酸乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳鏈球菌和糞腸球菌等；非乳酸菌類耐氧菌如雷氏丁酸桿菌等。2.厭氧菌有一般厭氧菌與嚴(yán)格厭氧菌（專性厭氧菌）之分。該類微生物的特點是：分子氧對它們有毒，即使短期接觸也會抑制甚至致死；在空氣或含10

32、CO2的空氣中，它們在固體或半固體培養(yǎng)基表面不能生長，只有在其深層無氧處或在低氧化還原勢的環(huán)境下才能生長；生命活動所需能量是通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵等提供；細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。常見的厭氧菌有梭菌屬、擬桿菌屬、梭桿菌屬、雙歧桿菌屬以及各種光合細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌等。其中產(chǎn)甲烷菌屬于古生菌類，它們都屬于極端厭氧菌。三、pH微生物作為一個整體來說，其生長的pH范圍極廣（2 10），有少數(shù)種類還可超出這一范圍。但絕大多數(shù)微生物的生長pH都在59之間。與溫度的三基點相似，不同微生物的生長pH也存在最低、最適與最高3個數(shù)值。除不同種類微生物有其最適生長p

33、H外，即使同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生理、生化過程，也有不同的最適pH要求。研究其中的規(guī)律，對發(fā)酵生產(chǎn)中pH的控制尤為重要。例如，黑曲霉在pH為2.02.5時，有利于合成檸檬酸， pH在2.56.5范圍內(nèi)時，就以菌體生長為主，而pH在7左右時，則大量合成草酸。又如，丙酮丁醇梭菌在pH為5.57.0時，以菌體的生長繁殖為主，而pH在4.35.3范圍內(nèi)才進(jìn)行丙酮、丁醇發(fā)酵。此外，許多抗生素的生產(chǎn)菌都有同樣的情況。利用上述規(guī)律對提高發(fā)酵生產(chǎn)效率十分重要。雖然微生物外環(huán)境的pH變化很大，但細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的pH卻相當(dāng)穩(wěn)定，一般都接近中性。這就免除了DNA、ATP、菌綠素和葉綠素等重要成分被酸破

34、壞，或RNA、磷脂類等被堿破壞的可能性。與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的中性pH相適應(yīng)的是，胞內(nèi)酶的最適pH一般都接近中性，而位于周質(zhì)空間的酶和分泌到細(xì)胞外的胞外酶的最適pH則接近環(huán)境的pH。 pH除了對細(xì)胞發(fā)生直接影響之外，還對細(xì)胞產(chǎn)生種種間接的影響。例如，可影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性，以及影響代謝反應(yīng)中各種酶的活性等。微生物在其生命活動過程中也會能動地改變外界環(huán)境的pH，這就是通常遇到的培養(yǎng)基的原始pH值會在培養(yǎng)微生物的過程中時時發(fā)生改變的原因。其中發(fā)生pH改變的可能反應(yīng)有以下數(shù)種：在一般微生物的培養(yǎng)中變酸往往占優(yōu)勢，因此，隨著培養(yǎng)時間

35、的延長，培養(yǎng)基的pH會逐漸下降。當(dāng)然，pH的變化還與培養(yǎng)基的組分尤其是碳氮比有很大的關(guān)系，碳氮比高的培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)各種真菌的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后其pH值常會顯著下降；相反，碳氮比低的培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)一般細(xì)菌的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，其pH值常會明顯上升。在微生物培養(yǎng)過程中pH值的變化往往對該微生物本身及發(fā)酵生產(chǎn)均有不利的影響，因此，如何及時調(diào)整pH就成了微生物培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)中的一項重要措施。通過總結(jié)實踐中的經(jīng)驗，一般把調(diào)節(jié)pH的措施分成“治標(biāo)”和“治本”兩大類，前者是根據(jù)表面現(xiàn)象而進(jìn)行的直接、及時、快速但不持久的表面化調(diào)節(jié)，后者則是根據(jù)內(nèi)在機(jī)制而采用的間接、緩效但可發(fā)揮持久作用的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)將這兩類措施表

36、解如下：pH調(diào)節(jié)治標(biāo)過酸時，加入NaOH、Na2CO3等堿液中和過堿時，加入H2SO4、HCl等酸液中和治本過酸時加適當(dāng)?shù)矗杭幽蛩?、NaNO3、NH4OH或蛋白質(zhì)等提高通氣量過堿時加適當(dāng)碳源：加糖、乳酸、醋酸、檸檬酸或油脂等降低通氣量第四節(jié) 微生物培養(yǎng)法概論一個良好的微生物培養(yǎng)裝置的基本條件是：按微生物的生長規(guī)律進(jìn)行科學(xué)的設(shè)計，能在提供豐富而均勻營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，保證微生物獲得適宜的溫度和良好的通氣條件(厭氧菌除外)，此外，還要為微生物提供一個適宜的物理化學(xué)條件，并嚴(yán)防雜菌污染等。從歷史發(fā)展的角度(縱向)來看，微生物培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的軌跡有以下特點：從少量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)；從淺層培養(yǎng)發(fā)展到厚層（

37、固體制曲）或深層（液體攪拌）培養(yǎng)；從以固體培養(yǎng)技術(shù)為主到以液體培養(yǎng)技術(shù)為主；從靜止式液體培養(yǎng)發(fā)展到通氣攪拌式的液體培養(yǎng)；從分批培養(yǎng)發(fā)展到連續(xù)培養(yǎng)以至多級連續(xù)培養(yǎng)；從利用分散的微生物細(xì)胞發(fā)展到利用固定化細(xì)胞；從單純利用微生物細(xì)胞到利用動物、植物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)；從利用野生型菌株發(fā)展到利用變異株直至遺傳工程菌株；從單菌發(fā)酵發(fā)展到混菌發(fā)酵；從低密度培養(yǎng)發(fā)展到高密度培養(yǎng)；從人工控制的發(fā)酵罐到多傳感器、計算機(jī)在線控制的自動化發(fā)酵罐；等等。以下就實驗室和生產(chǎn)實踐中一些較有代表性的微生物培養(yǎng)法作一簡要介紹。一、實驗室的微生物培養(yǎng)法（一）好氧培養(yǎng)法1. 固體培養(yǎng)法實驗室中將微生物菌種接種在固體培養(yǎng)基的表面，

38、使之獲得充足的氧氣生長。因所用器皿不同而分為試管斜面、培養(yǎng)皿瓊脂平板、較大型的克氏扁瓶及茄子瓶斜面等平板培養(yǎng)方法。2. 液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)就是將微生物菌種接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。實驗室進(jìn)行好氧菌液體培養(yǎng)的方法主要有四種: 試管液體培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和臺式發(fā)酵罐培養(yǎng)。（1）試管液體培養(yǎng) 裝液量可多可少。此法的通氣效果一般較差，僅適合培養(yǎng)兼性厭氧菌。常用于微生物的各種生理生化試驗等。（2）淺層液體培養(yǎng) 在三角瓶中裝入淺層培養(yǎng)液，其通氣量與裝液量、棉塞通氣程度密切相關(guān)。此法一般僅適用于兼性厭氧菌的培養(yǎng)。（3）搖瓶培養(yǎng) 將裝有較少量液體培養(yǎng)基的三角瓶（搖瓶），用812層紗布或疏松的棉塞封

39、口以利于通氣并阻止空氣中雜菌或雜質(zhì)進(jìn)入，將搖瓶放置在旋轉(zhuǎn)式或往復(fù)式搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。為使菌體獲得充足的氧，一般裝液量為三角瓶容積的10左右，如250ml三角瓶裝1020ml培養(yǎng)液。搖瓶培養(yǎng)在實驗室里被廣泛用于微生物的生理生化試驗、發(fā)酵和菌種篩選等，也常在發(fā)酵工業(yè)中用于種子培養(yǎng)。（4）臺式發(fā)酵罐 實驗室用的發(fā)酵罐體積一般為幾升到幾十升。商品發(fā)酵罐的種類很多，一般都有多種自動控制和記錄裝置。如配置有pH、溶解氧、溫度和泡沫檢測電極，有加熱或冷卻裝置，有補料、消泡和pH調(diào)節(jié)用的酸或堿貯罐及其自動記錄裝置，大多由計算機(jī)控制。因為它的結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)用的大型發(fā)酵罐接近，所以，它是實驗室模擬生產(chǎn)實踐的重要試驗

40、工具。（二）厭氧培養(yǎng)法1. 固體培養(yǎng)法實驗室中培養(yǎng)厭氧菌除了需要特殊的培養(yǎng)裝置或器皿外，首先應(yīng)配制特殊的培養(yǎng)基。此類培養(yǎng)基中，除保證提供6種營養(yǎng)要素外，還須加入適當(dāng)?shù)倪€原劑，必要時，還要加入刃天青等氧化還原勢指示劑。早期主要采用高層瓊脂柱法、厭氧培養(yǎng)皿法，現(xiàn)在主要采用厭氧罐技術(shù)、厭氧手套箱技術(shù)和亨蓋特滾管技術(shù)（圖6-5）。圖6-5 厭氧微生物的培養(yǎng)裝置A.Hungate厭氧試管；B.厭氧培養(yǎng)皿；C.厭氧罐2. 液體培養(yǎng)法實驗室中厭氧菌的液體培養(yǎng)同固體培養(yǎng)一樣，都需要特殊的培養(yǎng)裝置以及加有還原劑和氧化還原指示劑的培養(yǎng)基。若在厭氧罐或厭氧手套箱中對厭氧菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，通常不必提供額外的培養(yǎng)措施；若

41、單獨放在有氧環(huán)境下培養(yǎng)，則在培養(yǎng)基中必須加入巰基乙酸、半胱氨酸、維生素C或庖肉(牛肉小顆粒)等有機(jī)還原劑，或加入鐵絲等能顯著降低氧化還原電位的無機(jī)還原劑，在此基礎(chǔ)上，再用深層培養(yǎng)或同時在液面上封一層石蠟油或凡士林-石蠟油，則可保證專性厭氧菌的生長。二、生產(chǎn)實踐中的微生物培養(yǎng)法（一）好氧培養(yǎng)法1. 固體培養(yǎng)法工業(yè)生產(chǎn)中利用麩皮或米糠等為主要原料，加水?dāng)嚢璩珊窟m度的半固體物料作為培養(yǎng)基，接種微生物進(jìn)行培養(yǎng)，在豆醬、醋、醬油等釀造食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。根據(jù)所用設(shè)備和通氣方法的不同可分為淺盤法、轉(zhuǎn)桶法和厚層通風(fēng)法(圖6-6)。食用菌生產(chǎn)中通常將棉籽殼等培養(yǎng)料裝入塑料袋中或平鋪在床架上，接種培養(yǎng)。圖6

42、-6 通風(fēng)曲槽結(jié)構(gòu)模式圖1.天窗，2.曲室，3.風(fēng)道，4.曲槽，5.曲料，6.篦架，7.鼓風(fēng)機(jī)，8.電動機(jī)2. 液體培養(yǎng)法早期的青霉素和檸檬酸等的發(fā)酵工業(yè)中，均使用過淺盤培養(yǎng)法，但因其勞動強度大、生產(chǎn)效率低以及易污染雜菌等缺點，未能廣泛使用?，F(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中主要采用深層液體通風(fēng)培養(yǎng)法向培養(yǎng)液中強制通風(fēng)，并設(shè)法將氣泡微小化，使它盡可能滯留于培養(yǎng)液中以促進(jìn)氧的溶解。最常用的是機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐（圖6-7）。圖6-7 機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的構(gòu)造及其運轉(zhuǎn)原理（二）厭氧培養(yǎng)法1. 固體培養(yǎng)法生產(chǎn)實踐中對厭氧菌進(jìn)行大規(guī)模固態(tài)培養(yǎng)的例子還不多見，在我國的傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)中，一向采用大型深層地窖對固態(tài)發(fā)酵料進(jìn)行堆積式

43、固態(tài)發(fā)酵，這對酵母菌的酒精發(fā)酵和己酸菌的己酸發(fā)酵等都十分有利，因此可生產(chǎn)名優(yōu)大曲酒(蒸餾白酒)。2. 液體培養(yǎng)法工業(yè)上主要采用液體靜置培養(yǎng)法，接種后不通空氣靜置保溫培養(yǎng)，常用于酒精、啤酒、丙酮、丁醇及乳酸等發(fā)酵過程。該法發(fā)酵速度快，周期短，發(fā)酵完全，原料利用率高，適合大規(guī)模機(jī)械化、連續(xù)化、自動化生產(chǎn)。第五節(jié) 微生物生長的控制在微生物研究或生產(chǎn)實踐中，常常需要控制所不期望的微生物的生長。任何殺死或抑制微生物的方法都可以達(dá)到控制微生物生長的目的，它們包括加熱、低溫、干燥、輻射、過濾等物理方法和消毒劑、防腐劑、化學(xué)治療劑等化學(xué)方法兩大類。由于目的不同，對微生物生長控制的要求和采用的方法也就有很大的不

44、同，因而產(chǎn)生的效果也不同。（1）滅菌 利用強烈的理化因素殺死物體中所有微生物的措施稱為滅菌。（2）消毒 采用溫和的理化因素殺死物體中所有病原微生物的措施稱為消毒。（3）防腐 利用某種理化因素抑制微生物生長的措施稱為防腐。（4）化療 利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病原微生物或病變細(xì)胞的治療措施稱為化療?，F(xiàn)將上述4個概念的特點和比較列在表6-3中。表6-3 滅菌、消毒、防腐、化療的比較比 較 項 目滅 菌消 毒防 腐化 療處理因素強烈理化因素溫和理化因素理化因素化學(xué)治療劑處理對象任何物體內(nèi)外生物體表，酒、乳等有機(jī)質(zhì)物體內(nèi)外宿主體內(nèi)微生物類型一切微生物有關(guān)病原菌一切微生物有關(guān)病原菌對微生

45、物作用徹底殺滅殺死或抑制抑制或殺死抑制或殺死實例加壓蒸汽滅菌，輻射滅菌，化學(xué)殺菌劑70酒精消毒，巴氏消毒法冷藏。干燥，糖漬，鹽腌，缺氧，化學(xué)防腐劑抗生素，抗代謝藥物一、控制微生物生長的物理方法（一）高溫滅菌當(dāng)環(huán)境溫度超過微生物的最高生長溫度時就會引起死亡。高溫的致死作用，主要是引起蛋白質(zhì)、核酸和脂類等重要生物大分子發(fā)生降解或改變其空間結(jié)構(gòu)等，從而變性或破壞。一定時間內(nèi)(一般為10min)殺死微生物所需要的最低溫度稱為致死溫度。高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌，在相同溫度下，濕熱滅菌效果比干熱滅菌好（表6-4）。原因是蛋白質(zhì)的含水量與其凝固溫度成反比，因此濕熱條件下，菌體吸收水分，菌體蛋白更容易凝

46、固（表6-5）；熱蒸汽穿透能力強(表6-6)；濕熱蒸汽有潛熱存在，當(dāng)蒸汽在物體表面凝結(jié)成水時放出大量熱量，可提高滅菌物品的溫度。表6-4 干熱與濕熱空氣對不同細(xì)菌的致死時間比較 加熱方式細(xì)菌種類干熱9090相對濕度 加熱方式細(xì)菌種類干熱9090相對濕度20802080白喉棒桿菌24h2h2min傷寒桿菌3h2h2min痢疾桿菌3h2h2min葡萄球菌8h3h2min表6-5 蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度的關(guān)系蛋白質(zhì)含水量/%蛋白質(zhì)凝固溫度/滅菌時間/min蛋白質(zhì)含水量/%蛋白質(zhì)凝固溫度/滅菌時間/min5056306145302574803001601703018809030表6-6 干熱和濕熱空

47、氣穿透力的比較加熱方式溫度/加熱時間/h透過布的層數(shù)及其溫度/20層40層100層干熱1301404867270以下濕熱10541011011011. 干熱滅菌干熱滅菌是通過灼燒或烘烤等方法殺死微生物。（1）火焰灼燒法 實驗室常用酒精燈火焰灼燒接種工具和試管口等物品。醫(yī)院常焚燒污染物品及實驗動物尸體等。此法滅菌徹底、迅速、簡便。（2）烘箱熱空氣法 通常將滅菌物品放入電熱烘箱內(nèi)，在150170下維持l2 h可達(dá)到徹底滅菌（包括細(xì)菌的芽孢）的目的。利用熱空氣滅菌，滅菌時間可根據(jù)被滅菌物品的體積作適當(dāng)調(diào)整。該法適用于金屬器械和玻璃器皿等耐熱物品的滅菌，也可用于油料和粉料物質(zhì)的滅菌。2. 濕熱滅菌（1

48、）常壓法巴氏消毒法 此法最早由法國微生物學(xué)家巴斯德采用。這是一種專用于牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進(jìn)行高溫滅菌的液態(tài)風(fēng)味食品或調(diào)料的低溫消毒方法。此法可殺滅物料中的無芽孢病原菌（如牛奶中的結(jié)核分枝桿菌或沙門氏菌），又不影響其原有風(fēng)味。具體做法可分為2類：第一類是經(jīng)典的低溫維持法（LTH）,例如用于牛奶消毒只要在63維持30min即可；第二類是較現(xiàn)代的高溫瞬時法（HTST），用此法作牛奶消毒時只要在72維持15s。近年來，牛奶和其他液態(tài)食品一般都采用超高溫瞬時滅菌技術(shù)（UHT），即138142，滅菌24s，既可殺菌，又能保質(zhì)，還可縮短時間，提高經(jīng)濟(jì)效益。煮沸消毒法 物品在水中煮沸(100)15

49、min以上，可使某些病毒失活，可殺死細(xì)菌及真菌的所有營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢、孢子。如延長時間或加入l碳酸鈉或25石炭酸，則效果更好。此法適用于解剖器具、家庭餐具和飲用水等的消毒。間歇滅菌法 又稱分段滅菌法或丁達(dá)爾滅菌法。將待滅菌物品于常壓下加熱至100處理1560min，殺死其中營養(yǎng)細(xì)胞。冷卻后37保溫過夜，使其中殘存芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞，第二天再以同樣的方式加熱處理，反復(fù)三次，可殺滅所有的芽孢和營養(yǎng)細(xì)胞，達(dá)到滅菌目的。此法主要適用于一些不耐高溫的培養(yǎng)基、營養(yǎng)物等的滅菌，缺點是較費時間。（2）加壓法常規(guī)加壓蒸汽滅菌法 一般稱作“高壓蒸汽滅菌法”。這是一種利用高溫(而非壓力)進(jìn)行濕熱滅菌的方法，優(yōu)點是

50、操作簡便、效果可靠，故被廣泛使用。其原理是：將待滅菌的物件放置在盛有適量水的專用加壓滅菌鍋(或家用壓力鍋)內(nèi)，蓋上鍋蓋，并打開排氣閥，通過加熱煮沸，讓蒸汽驅(qū)盡鍋內(nèi)原有的空氣，然后關(guān)閉鍋蓋上的閥門，再繼續(xù)加熱，使鍋內(nèi)蒸汽壓逐漸上升，隨之溫度也相應(yīng)上升至100以上。為達(dá)到良好的滅菌效果，一般要求溫度應(yīng)達(dá)到121.5(0.1MPa)，時間維持1530min。有時為防止培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖等成分的破壞，也可采用在較低溫度(115.6即0.07MPa)下維持35min的方法。加壓蒸汽滅菌法適合于一切微生物學(xué)實驗室、醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材或物料的滅菌。連續(xù)加壓蒸汽滅菌法 ：在發(fā)酵行業(yè)里也稱“

51、連消法”。此法僅用于大型發(fā)酵廠的大批量培養(yǎng)基的滅菌。主要操作原理是讓培養(yǎng)基在管道的流動過程中快速升溫、維持和冷卻，然后流進(jìn)發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般加熱至135140下維持515s。優(yōu)點：采用高溫瞬時滅菌，既進(jìn)行了徹底地滅菌，又有效地減少營養(yǎng)成分的破壞，從而提高了原料的利用率和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。在抗生素發(fā)酵中，它可比常規(guī)的“實罐滅菌”(120，30min)提高產(chǎn)量510；由于總的滅菌時間比分批滅菌法明顯減少，故縮短了發(fā)酵罐的占用時間，提高了它的利用率；由于蒸汽負(fù)荷均衡，故提高了鍋爐的利用效率；適宜于自動化操作，降低了操作人員的勞動強度。（二）低溫抑菌低溫的作用主要是抑菌。它可使微生物的代謝活力降低

52、，生長繁殖停滯，但仍能保持活性。低溫法常用于保藏食品和菌種。1. 冷藏法 將新鮮食物放在4冰箱保存，防止腐敗。然而貯藏只能維持幾天，因為低溫下耐冷微生物仍能生長，造成食品腐敗。利用低溫下微生物生長緩慢的特點，可將微生物斜面菌種放置于4冰箱中保存數(shù)周至數(shù)月。2. 冷凍法 家庭或食品工業(yè)中采用-10 -20左右的冷凍溫度，使食品冷凍成固態(tài)加以保存，在此條件下，微生物基本上不生長，保存時間比冷藏法長。冷凍法也適用于菌種保藏，所用溫度更低，如-20低溫冰箱、或-70超低溫冰箱、或-195液氮。（三）輻射輻射主要有紫外光、電離輻射、強可見光等，可用于控制微生物生長和保存食品。1. 紫外光它由波長1004

53、00nm的光組成，其中200300nm范圍的紫外光殺菌作用最強。紫外光殺菌作用主要是它可以被蛋白質(zhì)(約280nm)和核酸(約260nm)吸收，使其變性失活。核酸中的胸腺嘧啶吸收紫外光后形成二聚體，導(dǎo)致DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中遺傳密碼閱讀錯誤，引起致死突變。紫外線還可使空氣中分子氧變?yōu)槌粞酰纸夥懦鲅趸芰O強的新生態(tài)0，破壞細(xì)胞物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使菌體死亡。紫外光穿透能力很差，只能用于物體表面或室內(nèi)空氣的滅菌。紫外光滅活病毒特別有效，對其他微生物細(xì)胞的滅活作用因DNA修復(fù)機(jī)制的存在受到影響。紫外光的殺菌效果也與菌種的生理狀態(tài)有關(guān)。干細(xì)胞抗紫外輻射能力比活細(xì)胞強，孢子抗性比營養(yǎng)細(xì)胞強，帶色細(xì)胞的色素若可吸收

54、紫外光也可起保護(hù)作用。2. 電離輻射控制微生物生長所用的電離輻射主要是X射線和射線。電離輻射波長短，穿透力強，能量高，效應(yīng)無專一性，作用于一切細(xì)胞成分。主要用于其他方法不能解決的塑料制品、醫(yī)療設(shè)備、藥品和食品的滅菌。射線是某些放射性同位素，如65Co發(fā)射出的高能輻射，具較強穿透能力，能致死所有微生物。已有專門用于不耐熱的大體積物品消毒的射線裝置。3. 強可見光太陽光具有殺菌作用，主要是由紫外光造成的。但含有400700nm波長范圍的強可見光也具有直接的殺菌效應(yīng)，它們能夠氧化細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的光敏感分子，如核黃素和卟啉環(huán)(構(gòu)成氧化酶的成分)。因此，實驗室應(yīng)注意避免將細(xì)菌培養(yǎng)物暴露于強光下。此外，曙紅和

55、四甲基藍(lán)能吸收強可見光使蛋白質(zhì)和核酸氧化，因此常將兩者結(jié)合用來滅活病毒和細(xì)菌。（四）干燥和滲透壓微生物代謝離不開水。干燥或提高溶液滲透壓降低微生物可利用水的量或活度，可抑制其生長。1. 干燥干燥的主要作用是抑菌，使細(xì)胞失水，代謝停止，也可引起某些微生物死亡。干果、稻谷、奶粉等食品通常采用干燥法保存，防止腐敗。不同微生物對干燥的敏感性不同，G 細(xì)菌，如淋病球菌對干燥特別敏感，幾小時便死亡；但結(jié)核分枝桿菌特別耐干燥，在此環(huán)境中，100、20 min仍能生存；鏈球菌用干燥法保存幾年而不喪失致病性。休眠孢子抗干燥能力很強，在干燥條件下可長期不死，故可用于菌種保藏。2. 滲透壓一般微生物都不耐高滲透壓。微生物在高滲環(huán)境中，水從細(xì)胞中流出，使細(xì)胞脫水。鹽腌制咸肉或咸魚，糖浸果脯或蜜餞等均是利用此法保存食品的。（五）過濾除菌過濾除菌是將液體通過某種多孔的材料，使微生物與液體分離。現(xiàn)今大多用膜濾器除菌。膜濾器用微孔濾膜作材料，通常由硝酸纖維素制成，可根據(jù)需要選擇250.025m的特定孔徑。含微生物的液體通過微孔濾膜時，大于濾膜孔徑的微生物被阻攔在膜上，與濾液分離。微孔濾膜具有孔徑小、價格低、濾速快、不易阻塞、可高壓滅菌及可處理大容量液體等優(yōu)點。但也有使用小于0.22m孔徑濾膜時易引起濾孔阻塞的缺點，而當(dāng)使用0.22m孔徑濾膜時，雖可基本濾除溶液中存在的細(xì)菌，但病毒及支