生物科學(xué)系畢業(yè)論文正文的要求

1、生物科學(xué)系畢業(yè)論文正文的要求（一）基本格式(1).封面； (2).目錄； (3).中、英文摘要； (4).正文；(5).致謝； (6).參考文獻(xiàn)；（二）論文文字書寫基本要求（1）論文字?jǐn)?shù)大于6000字；（2）書寫和表格設(shè)計規(guī)范；（3）標(biāo)點符號、語法正確，無錯別字；（4）語句通順、流暢； （5）思路清晰，敘述簡明扼要；（6）重點突出；（三）論文正文質(zhì)量 （1）選題科學(xué)； （2）實驗設(shè)計合理；（3）能熟練運用本專業(yè)的“三基”，分析問題，解決問題；（4）論證嚴(yán)密、結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)、邏輯性強(qiáng)；（5）數(shù)據(jù)可信、處理正確；（6）討論充分、了解學(xué)科的發(fā)展前沿；（7）結(jié)論正確 （四）論文創(chuàng)新 （1）達(dá)到一定水平，具有

2、理論或?qū)嵺`應(yīng)用價值；（2）結(jié)論見解獨到，具有學(xué)科前瞻性；生物科學(xué)系畢業(yè)論文排版格式要求1.開題報告及論文封面按學(xué)校要求填寫書寫格式：字體：宋體，字號：四號2.目錄按已設(shè)計格式填寫頁碼3.文題力求簡明、醒目,反映出文章的主題;中文文題一般以不超過20個漢字為宜,并附有與之對應(yīng)的英文文題文題書寫格式： 字體：黑體加粗，字號：小二號，居中英文文題書寫格式： 字體：Time new Roman，字號：小二號，居中4.中英文摘要，按結(jié)構(gòu)式書寫，限600字左右，依次為：目的(Objective)、方法(Methods)、結(jié)果(Results)、結(jié)論(Conclusion)摘要正文書寫格式： 中文 字體：宋

3、體（其中摘要、目的、方法、結(jié)果、結(jié)論以宋體加粗），字號 ：小四號，段落：1.5倍行距，左對齊英文 字體: Time new Roman，字號：小四號，段落：1.5倍行距，左對齊例：【摘要】目的：，方法：，結(jié)果：，結(jié)論：?！続bstracts】Objective：，Methods：，Results：，Conclusion：。5.關(guān)鍵詞一般為35個，盡可能采用中國醫(yī)學(xué)主題詞表 (1993年再版)中所列的中、英文詞 關(guān)鍵詞書寫格式： 字體：宋體，字號：小四號 ，左對齊,兩個關(guān)鍵詞之間用分號（；）分隔6.正文標(biāo)題序號編排用阿拉伯?dāng)?shù)字，前言不編號1 材料和方法（一級標(biāo)題書寫格式： 字體：宋體加粗，字號：

4、小四，左對齊）1.1 （二、三級標(biāo)題書寫格式： 字體：宋體加粗，字號：小四，左對齊） 正文書寫格式： 字體：宋體，字號：小四，段落：首行縮進(jìn) 2字符、1.5倍行距7.表格按統(tǒng)計學(xué)制表原則設(shè)計，盡量使用三線表，在表的上方標(biāo)注表序和表題。表格書寫格式：字體：宋體加粗，字號：五號，居中例：表1 3中抗生素對50種菌株桿菌的8.插圖依文中出現(xiàn)的先后排序，如圖1.圖2，有圖題及圖說明9.參考文獻(xiàn)著錄格式采用順序編碼制，以之中出現(xiàn)順序排序。參考文獻(xiàn)的序號在文中引用處用阿拉伯?dāng)?shù)字置于右上方方括號內(nèi)。以10篇為宜。文獻(xiàn)書寫格式：字體：宋體，字號：五號，段落：1.5倍行距，左對齊期刊作者（凡13位作者列出全部作

5、者姓名，3位作者以上，只列前3名，后家“等”或“et al”）.文題.刊名（外文刊名縮寫按Index Medicus格式），年份，卷（期）：起止頁12Cohen IK. Can collagen metabolism becontrolled: Theoretical consideration. JTrauma, 1985,25(4):41041134Giessen WJ, Wermans WR, Rensing BJ, etal. Restenosis clinical and angiographic definitions of restenosis recommendatios fo

6、rclinicaltrials. In: Schwarttz RS, ed. Coronary restenosis. Boston: Blackwell Scientific Publication, 1993. 169191蚌埠醫(yī)學(xué)院畢 業(yè) 論 文 題目： 姓 名： 專 業(yè)： 年 級： 學(xué) 號： 指導(dǎo)教師： 蚌埠醫(yī)學(xué)院教務(wù)處制年 月 日目 錄一、中文摘要、關(guān)鍵詞 二、英文摘要、關(guān)鍵詞 三、論文正文 前言 1.材料與方法 2.結(jié)果 3.討論 4.結(jié)論 5.致謝 6.參考文獻(xiàn) 范文實例：以下為一畢業(yè)論文的范文，供同學(xué)們書寫時候進(jìn)行格式參考。HLA 1分子在胃癌中的表達(dá)機(jī)制摘 要目的：腫瘤細(xì)胞表

7、達(dá)HLA (human leukocyte antigen) 分子是激發(fā)腫瘤抗原特異性CTL (cytotoxic T lymphocytes) 進(jìn)行腫瘤免疫治療的關(guān)鍵，其中腫瘤細(xì)胞中HLA I類分子表達(dá)異常是腫瘤逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視的重要機(jī)制之一。本研究探討胃癌組織中HLA I類抗原及相關(guān)分子的表達(dá)情況，檢測HLA基因區(qū)域微衛(wèi)星DNA的雜合性丟失 (loss of heterozygosity; LOH)，并分析它們的相關(guān)性。為研究胃癌中HLA I類分子的異常表達(dá)機(jī)制提供理論依據(jù)。方法：首先應(yīng)用4種HLA相關(guān)分子單抗，采用免疫組化的方法（ABC法）檢測胃癌石蠟組織標(biāo)本中HLA I類及相關(guān)分子的表

8、達(dá)情況，統(tǒng)計分析各分子表達(dá)與臨床分期及病理分級的相關(guān)性。同時應(yīng)用5種HLA I類分子相關(guān)抗體，采用冰凍切片免疫組化的方法，檢測新鮮胃癌組織中HLA I類分子的表達(dá)情況，并應(yīng)用微衛(wèi)星多態(tài)性分析技術(shù)檢測胃癌組織中6p HLA及15q 2m (2-microglobulin) 基因區(qū)域的LOH。結(jié)果：在組織學(xué)水平，185例胃癌石蠟切片中HLA I類分子表達(dá)異常，HLA I類分子B/C位點下調(diào)率41%，丟失率22%；A位點下調(diào)率32%，丟失率19%。其中B/C位點的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，且隨著胃癌分化程度的降低逐漸下調(diào)。20例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，有8例（40%）HLA I類分子表達(dá)低于原發(fā)癌。與癌旁組織比較

9、，50例新鮮胃癌組織冰凍切片中HLA I類分子表達(dá)下調(diào)顯著（P<0.05），其中重鏈各分子與HLA I類分子表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，尤以HLA-B/C位點顯著 （P<0.05 rs=0.8236）；應(yīng)用微衛(wèi)星多態(tài)性分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織HLA基因區(qū)域發(fā)生LOH的頻率為18.3%，2m基因發(fā)生LOH的頻率為14.5%。HLA區(qū)域內(nèi)各位點LOH的頻率分別為：D6S1618,16%；D6S291,12%；D6S273,15%；D6S265,15%；D6S105,34%；D6S276,16%。所研究病例未見有6號染色體完全丟失現(xiàn)象的存在。與2m基因緊密相鄰的兩個微衛(wèi)星位點，其LOH頻率分別為：D

10、15S-126，18%；D15S-209，11%。其中與HLA I類分子重鏈基因緊密相鄰的D6s-105位點LOH頻率最高（34.2%）。結(jié)論：在胃癌組織中，存在著明顯的HLA I類分子表達(dá)下調(diào)或缺失，且重鏈各分子與HLA I類分子表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)（P<0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例HLA I類分子表達(dá)下調(diào)或丟失高于原發(fā)癌。通過HLA I類各分子的表達(dá)與相應(yīng)位點LOH的對比分析，大部分HLA I類各分子與癌旁組織相比表達(dá)一致或增強(qiáng)者未發(fā)生LOH，表達(dá)下調(diào)或陰性者則發(fā)生了LOH，特別是與HLA重鏈基因區(qū)域緊密相鄰的微衛(wèi)星位點發(fā)生LOH的頻率最高，說明HLA重鏈基因區(qū)域微衛(wèi)星DNA的LOH可能影

11、響了HLA重鏈各分子的表達(dá)，并進(jìn)一步影響了HLA I類分子在細(xì)胞表面的完整性表達(dá)。本研究顯示HLA重鏈基因區(qū)域的LOH是影響胃癌組織HLA I類分子異常表達(dá)的重要機(jī)制之一。關(guān)鍵詞：胃癌；HLA I類抗原；免疫組化；雜合性丟失The mechanism of HLA class I molecules expressed abnormally in gastric cancer ABSTRACTObjective： Pathogenesis of tumors and anti-tumor immune response in host has attracted a lot of attent

12、ion. HLA class I molecules play a critical role in the antigen processing, presenting and special recognition of tumor cells by cytotoxic T lymphocytes (CTL). There is a general consensus that the abnormal expression of HLA class I molecules reflects the escape mechanism of tumor cells and it is piv

13、otal to excite tumor antigen-special CTL to carry through immune therapy for the expression of HLA class I molecules in tumor cells surface. We discussed the expression of HLA class I molecules in gastric cancer tissues and detected the LOH of microsatellite DNA at HLA gene region, which provided a

14、theory basis for studying the abnormal expression mechanism of HLA class I molecules in gastric cancer.Methods：185 formalin-fixed paraffin-embeded tumor tissues, 22 corresponding autologous normal specimens and 20 lymphnode metastatic cases were tested using 4 monoclonal antibodies (mAbs) by meaning

15、s of immunohistochemical technique (ABC method); 50 OCT-embeded fresh gastric cancer and corresponding normal tissues, which were made into freezing slice, were tested applying 5 monoclonal antibodies (mAbs) by the same method, and analyzed of the LOH frequency at HLA (6p) and 2m (15q) gene region b

16、y microsatellite polymorphic analysis technology.Results：HLA class I antigens were obviously downregulated (A locus 41%, B/C locus 32%) and lost (A locus 22%, B/C locus 19%) in 185 formalin-fixed paraffin-embeded gastric cancer tissues, and the downregulated expression of B/C locus is significantly

17、associated with pathological grade （p<0.05）. In 20 lymphnode metastatic cases, 8 cases show downregulated expression of HLA class I antigens compared with the primary tumor. HLA class I antigens were also obviously downregulated in 50 OCT-embeded fresh gastric cancer compared with corresponding n

18、ormal tissues (P<0.05). The downregulated expression is correlated with heavy chain molecules especially HLA-B/C locus. It was accordant to the results of the paraffin-embeded tissues. The LOH frequency of HLA gene region is 18.3% in gastric cancer and the highest is D6s105 (34.2%). The individua

19、l LOH frequency for the six intra-MHC markers was: D6S1618, 16%; D6S291, 12%; D6S273, 15%; D6S265, 15%; D6S105, 34%; D6S276, 16%. It was not seen about loss of the whole chromosome 6 in the studied samples. The LOH frequency of 2m gene is 14.5%. D15S-126 and D15S-209, next to2m, was 18% and 11% resp

20、ectively.Conclusion：expression of HLA class I antigens is obviously downregulated in gastric cancer, and which is more obvious in lymphnode metastatic cases than the primary tumor. The downregulation is correlated with heavy chain molecules（P<0.05 ）. In order to elucidate the mechanism, we extend

21、ed our study to detect LOH (loss of heterozigosity) of microsatellite DNA at HLA gene region in gastric cancer and compared HLA class I molecules expression with LOH in corresponding locus, the results indicate that the majority of the tumors with positive expression of HLA class I have no allelic l

22、oss at all informative loci, the tumors with weak or negative expression show LOH for at least one locus. However, it can be concluded that LOH of HLA class I heavy chains was one of the mechanisms that lead to abnormally expression of HLA class I molecules and provided the tumor cells with a way to

23、 escape immune surveillance in gastric cancer. But, it is not benefit for T-cell based treat of tumor.Key words： gastric cancer; HLA class I; LOH; Immunohistochemistry 前 言HLA復(fù)合體位于6p21.31，全長約3600kb，占人體整個基因組的1/30001，是迄今所知最復(fù)雜的人類基因復(fù)合體。本研究所涉及的是經(jīng)典HLA I類基因及免疫功能相關(guān)基因中的抗原遞呈相關(guān)基因。HLA分子不僅參與移植排斥反應(yīng)，而且在免疫細(xì)胞的發(fā)育和應(yīng)答過程

24、中發(fā)揮更為重要的作用。近20年來的研究表明，HLA I類分子具有重要的免疫生物學(xué)功能2：一方面，HLA I類分子直接參與抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）對內(nèi)源性抗原的加工和處理；另一方面，在TCR (T cell receptor) 特異性識別APC遞呈的抗原肽過程中，必須同時識別與抗原肽結(jié)合成復(fù)合物的HLA分子，才能產(chǎn)生激活T細(xì)胞的活化信號，這就是所謂的MHC限制性。HLA復(fù)合體通過參與抗原遞呈、制約免疫細(xì)胞間的相互作用、控制機(jī)體免疫應(yīng)答的發(fā)生及強(qiáng)度等多個方面參與免疫調(diào)節(jié)?？梢韵胂螅琀LA I類分子抗原遞呈途徑中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生異常，都會影響HLA I類

25、抗原的表達(dá)及機(jī)體正常的免疫功能。多年來，國內(nèi)外的研究已經(jīng)證實在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)HLA I類抗原表達(dá)降低或缺失，使腫瘤細(xì)胞不能被CTL識別和殺傷，逃避宿主的免疫攻擊得以生存和發(fā)展。腫瘤細(xì)胞HLA I類抗原表達(dá)降低有多種類型3，研究表明，在各型腫瘤中全部HLA I類分子降低的頻率從16-50%不等，HLA I類基因位點或等位基因的選擇性降低的頻率也不同（4-35%）。研究還發(fā)現(xiàn)各型腫瘤的轉(zhuǎn)移瘤中HLA I類抗原降低的頻率也不同（37-69%），并且轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶降低的頻率更高。為此在第13屆國際組織相容性抗原會議上成立了一個工作組（IHWG），組織有關(guān)實驗室利用一套標(biāo)準(zhǔn)的試劑和方法以研究各型腫瘤HL

26、A I類抗原降低的頻率，并通過腫瘤的組織病理學(xué)特征、病程和HLA I類抗原表達(dá)水平的關(guān)系來評價各型腫瘤HLA I類抗原降低或缺失的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)在多種類型的人類腫瘤中HLA I類抗原和/或TAP表達(dá)的降低與腫瘤的級別、病程以及預(yù)后不良的標(biāo)志(如病灶的厚度、疾病的階段、發(fā)病間隔和生存期等)有關(guān)4。通過病程分析CTL對腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)顯示,復(fù)發(fā)的病灶中CTL識別所需的HLA I類限制性成分出現(xiàn)進(jìn)行性的丟失5；在早期對T細(xì)胞免疫治療有效的病人中,其復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)移瘤的HLA I類抗原已丟失6。因此,應(yīng)根據(jù)腫瘤細(xì)胞抗原加工機(jī)制和HLA I類抗原表達(dá)和功能的完整與否來選擇病人進(jìn)行T細(xì)胞免疫治療。腫瘤細(xì)胞上H

27、LA I類分子異常表達(dá)的分子基礎(chǔ)是多樣的，主要體現(xiàn)在（1）基因水平的改變。 如在結(jié)腸癌，肺癌和惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)2m基因的點突變或大片段的缺失而導(dǎo)致HLA I類分子的異常表達(dá)7-9；染色體不分離或有絲分裂的錯誤重組所引起HLA I類等位基因選擇性降低。已經(jīng)證實雜合性丟失可以通過影響HLA分子的表達(dá)參與到腫瘤發(fā)生的機(jī)制之中10。由于HLA基因的復(fù)雜性，目前的研究多用微衛(wèi)星DNA作為遺傳標(biāo)記研究HLA基因的LOH。在已有研究中，不同的腫瘤中HLA基因雜合性丟失的頻率不同，且數(shù)據(jù)相差較大(宮頸癌 50%，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 49%, 結(jié)腸癌13.8%, 喉癌 17.6%, 黑色素瘤 15.3%)11。

28、已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一條6號染色體的部分或全部丟失是導(dǎo)致HLA單倍型丟失的主要原因12-13。（2）轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)缺陷而導(dǎo)致HLA I類分子特異性位點的下調(diào)14-16。Griffion等發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞系中ISRE (interferon stimulate reaction element; ISRE) 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子改變引起HLAI類分子B抗原的表達(dá)下調(diào)。（3）抗原加工遞呈的缺陷。Restifo等17首先在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中描述了腫瘤細(xì)胞抗原加工的缺陷，發(fā)現(xiàn)由于TAP1和TAP2的降低而導(dǎo)致抗原的加工和遞呈過程發(fā)生缺陷。腫瘤細(xì)胞中LMP2或LMP7缺陷對HLA I類抗原表達(dá)的影響是微妙的。它可改變HLA

29、 I類分子傳遞的抗原肽類型而不影響HLA I類抗原的表達(dá)水平18。最新的調(diào)查結(jié)果表明，全世界胃癌的發(fā)病率和死亡率均居于首位，在我國，盡管在過去的20年中，由于醫(yī)學(xué)的發(fā)展，癌腫總體死亡率有所降低，但胃癌的5年存活率仍然很低，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量。為進(jìn)一步提高胃癌患者的存活率，需要深入了解胃癌的病因?qū)W及其發(fā)展過程，并積極研究相應(yīng)的腫瘤免疫治療策略。關(guān)于胃癌中HLA分子表達(dá)情況的研究，在80年代末及90年代初國內(nèi)外已有報道。但因為抗體的限制，研究不夠系統(tǒng)、全面，涉及到分子機(jī)制領(lǐng)域的研究甚少。而關(guān)于胃癌中HLA及2m基因區(qū)域等位基因LOH的研究，國內(nèi)外均未見報道?；诖?，我們利用石蠟切片的免疫組化

30、技術(shù)對臨床標(biāo)本進(jìn)行回顧性研究，探討胃癌中HLA I類及相關(guān)分子的異常表達(dá)情況，同時利用第13屆“HLA表達(dá)和腫瘤”國際組織相容性工作組大會上確立的一套研究LOH所需要最低數(shù)目的STR及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和定義LOH的準(zhǔn)則19，檢測胃癌組織HLA和2m基因區(qū)域異常丟失的情況。這不僅有利于進(jìn)一步理解腫瘤的免疫逃避機(jī)制，而且對提高腫瘤細(xì)胞表面HLA I類分子的表達(dá)、增強(qiáng)免疫治療的效果，為今后成功進(jìn)行腫瘤的分子免疫治療提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1材料臨床標(biāo)本185例原發(fā)性胃癌標(biāo)本取自南京××醫(yī)院及××市第一人民醫(yī)院1994年至2002年手術(shù)切除標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，切片

31、，經(jīng)病理醫(yī)師明確診斷。男性148例，女性37例，年齡2780歲。其中22例有癌旁胃粘膜組織，20例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標(biāo)本。50例原發(fā)性胃癌新鮮手術(shù)標(biāo)本取自20022003年南京××醫(yī)院、××省腫瘤醫(yī)院及××市第一人民醫(yī)院，包括其相應(yīng)的正常組織，立即用OCT包埋，液氮速凍，-700C冰箱凍存?zhèn)溆?。全部病例?jīng)病理診斷明確。1.1.2 主要試劑【所用的所有試劑均可記述，且注明規(guī)格、生產(chǎn)廠家】1） 單克隆抗體應(yīng)用于石蠟組織免疫組化的單克隆抗體：HC10 (抗HLA-B/C)、HCA2（抗HLA -A）工作濃度均為1:100，L368（抗2m）和SY

32、-1（抗LMP2）的工作濃度分別為1:50和1:200，無關(guān)抗體MK2-23的工作濃度為1:100。應(yīng)用于冰凍組織免疫組化的單克隆抗體：2m）工作濃度均為1:20，W6/32（抗HLA I類分子復(fù)合物）工作濃度為1:50。所有鼠單抗為美國S.Ferrone博士惠贈2） ABC試劑盒 （美國Vector公司產(chǎn)品，含有正常馬血清、生物素標(biāo)記的馬抗鼠二抗、Avidin、Biotin）3） DAB試劑盒 （美國Vector公司）4） Harris蘇木素液：蘇木色精2.5g，鉀明礬50g，氧化汞1.25g（均為上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品），無水乙醇25ml，冰醋酸20ml，蒸餾水500ml。將蘇木色精溶于純乙

33、醇中，加入預(yù)先已溶解鉀明礬的蒸餾水中，使溶液盡快沸騰后，將火焰熄滅或稍有火，慢慢加入氧化汞，防止溶液濺出，稍煮。將燒瓶立即浸入冷水中，當(dāng)溶液冷卻后，加入醋酸。5） 0.01M PBS（PH=7.4）：Na2HPO4.12H2O 2.902g， NaH2PO4.2H2O 0.296g ，NaCl 8.5g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)PH至7.4。6） 檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液：80ml dH2O中溶解0.8765g NaCl和0.441g檸檬酸三鈉，調(diào)節(jié)PH至6.0，加dH2O定容至100ml。7） Tween-20 8） 中性樹膠（福州邁新）：加入少許二甲苯。9） 多聚賴氨酸（福州邁新）：用蒸餾

34、水配制10%多聚賴氨酸。10）其他均為國產(chǎn)分析純。1.1.3 主要儀器及材料【所用的所有儀器均可記述，且注明廠家】1） 切片機(jī) （美國Reichert HistoSTAT）2） 孵箱 （隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱）3） 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精宏實驗設(shè)備有限公司）4） 冰箱 （中國海爾）5） 顯微鏡 （日本OLYMPUS）6） 天平 （上海天平儀器廠）7） 耐高溫塑料染色架 （福州邁新）8） 免疫組化染色孵育盒（自制）9） 免疫組化筆 （日本PAP Pen）10）磨砂載玻片1.2方法【要詳細(xì)記述說使用的方法，這點與發(fā)表論文有些不同?！?組織切片處理載玻片預(yù)先清洗后用10%多聚賴氨酸處理5分鐘，烤

35、干備用。石蠟組織切片厚度為4m，撈片后放入600C烤箱中23 h，室溫保存?zhèn)溆谩Ｐ迈r胃癌組織經(jīng)OCT包埋，固定，修塊后切片，冰凍切片厚度為46m，室溫干燥30 min，40C冷丙酮固定后-20保存?zhèn)溆谩?石蠟切片免疫組化染色步驟1） 石蠟切片脫蠟水化：組織切片60 烘箱烤片20 min，二甲苯 3×5 min ，100%乙醇 1×5 min，100%乙醇 1×1 min，95%乙醇 2×1 min，70%乙醇 1×1 min，過水，PBS沖洗 3×3 min。2） 每張片子加一滴或50 l 3% H2O2，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性

36、室溫15 min。3） PBS沖洗3×5 min。4） 微波抗原修復(fù)：將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有已煮沸緩沖液（4.2 ml檸檬酸鹽緩沖液+450 ml H20）的燒杯中，中火15 min，解凍8 min。將燒杯取出，浸入冷水中（不可將玻片從緩沖液中取出冷卻）。5） PBS沖洗，將切片組織周圍擦干，用免疫組化筆畫圈，稍干。6） PBS沖洗3×5 min。7） 每張片子加一滴或50 l的2%正常馬血清，室溫30 min。8） 每張片子加一滴或50 l的一抗，370C 60 min或40C過夜。9） PBST（0.03% Tween-20+ PBS）沖洗3×5

37、 min。 10）每張片子加一滴或50 l生物素標(biāo)記的馬抗鼠二抗（用PBS稀釋為1：200），370C 60 min。11） PBST沖洗3×5 min。12） 每張片子加一滴或50 l親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（A 20l + B 20l +PBS 1 ml，用前半小時配），370C 30 min。 13） PBST沖洗1×5 min，PBS沖洗2×5 min。14） 每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液，鏡下觀察染色深淺， 染好立即中止,用自來水輕柔沖洗15 min。15） 蘇木素復(fù)染，自來水沖洗泛蘭，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗10分鐘，梯度酒精脫水，二

38、甲苯透明，中性樹膠封片。 冰凍切片免疫組化染色步驟冰凍切片46 m，室溫放置30 min后，入4丙酮固定20 min，PBST沖洗，5 min×3。用3%過氧化氫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBST沖洗，5 min×3，下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟。 判斷標(biāo)準(zhǔn)石蠟切片：陽性為棕黃色或棕褐色。計數(shù)著色細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度（兩人單獨計數(shù)）：整張切片中著色的癌細(xì)胞或癌旁細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)>75%、7525%、<25%分別為陽性、弱陽性和陰性，染色強(qiáng)度分為強(qiáng)、弱和無，兩種計分結(jié)果相加綜合打分為、±、。相鄰正常結(jié)構(gòu)（如淋巴和內(nèi)皮細(xì)胞）可作為內(nèi)對照來評

39、價細(xì)胞的染色強(qiáng)度，無關(guān)抗體MK2-23作陰性對照。壞死的胃癌細(xì)胞不計數(shù)。注：本實驗結(jié)果判定方法是按照第12屆國際組織相容性大會上確定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)47 。冰凍切片：染色結(jié)果分別由兩人按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷，以組織中淋巴細(xì)胞作為陽性參照對象，再根據(jù)腫瘤細(xì)胞是否被染色，分為陰性和陽性，陽性分成+，+，+三個等級，染色強(qiáng)度為淡黃色，棕黃色，深棕色，分別記分為0，1，2，3。部分腫瘤組織染色不均一，根據(jù)腫瘤組織陽性面積計算，陽性面積25%，按陰性計算；陽性面積75%，按陽性計算;在兩者之間，根據(jù)其染色強(qiáng)度減0.5（該標(biāo)準(zhǔn)參照Lopez-nevot的方法48）。 統(tǒng)計學(xué)分析根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行分期、分

40、級（TNM分級根據(jù)1987年制定的標(biāo)準(zhǔn)），統(tǒng)計每組各抗原的表達(dá)水平，用SAS 6.12軟件對資料用列聯(lián)表卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。2結(jié)果【根據(jù)實驗的結(jié)果，分為幾個部分分別書寫，圖文并茂，加入適當(dāng)?shù)谋砀?。圖、表的說明要規(guī)范！】2.1 石蠟組織切片表達(dá)情況染色結(jié)果顯示：胃癌及癌旁組織細(xì)胞染色較均一，間質(zhì)（內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）均表達(dá)陽性。HC10和HCA2染色以膜為主，2m表達(dá)為膜漿型，以膜為主，而LMP2則表達(dá)在胞漿中(圖1-6)。在22例癌旁胃粘膜組織中，大部分HLA I，2m和LMP2表達(dá)為陽性，只有4例（18%）HLA I類分子表達(dá)陰性。與癌旁組織相比，HLA I類分子有明顯的表達(dá)下調(diào)或缺失，B

41、/C位點最顯著（見表1）。2m和LMP2有表達(dá)下調(diào)或缺失，但與I 類分子的下調(diào)或丟失無統(tǒng)計學(xué)意義。表1 HLA I類抗原及相關(guān)分子在胃癌中的表達(dá)情況HLA-B/CHLA-A2mLMP237%49%55%73%±41%32%32%22%22%19%13%5%+：表達(dá)正常； ±：表達(dá)下調(diào)； ：表達(dá)缺失2.2 冰凍組織切片表達(dá)情況50例新鮮胃癌組織切片中淋巴細(xì)胞都表達(dá)HLA I類各分子，成為本實驗良好的內(nèi)參照。HLA各分子均表達(dá)在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜表面，呈黃色或淡黃色（如圖8-15），其表達(dá)情況同石蠟組織切片基本一致。胃癌組織中HLA I類各分子的表達(dá)與癌旁組織相比表達(dá)下調(diào)顯著（圖7

42、），且HLA I類重鏈各分子及I類分子復(fù)合物表達(dá)下調(diào)有顯著性差異（P<0.05見表2）。2m表達(dá)也呈下調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。表2 胃癌及癌旁組織中HLA I類各分子的表達(dá)情況HLA-AHLA-B/CHLA-A,B,C2m W6/32癌旁組織1.61±0.491.70±0.521.67±0.531.36±0.611.85±0.56胃癌組織1.10±0.831.30±0.971.36±0.811.11±0.901.24±0.92P0.00080.01520.05460.

43、22630.0001應(yīng)用偏相關(guān)分析，HLA重鏈各分子與HLA I類分子表達(dá)下調(diào)顯著相關(guān)，尤以HLA-B/C位點顯著（P<0.05，相關(guān)系數(shù)rs=0.8236見表3）。2m與HLA I類分子表達(dá)下調(diào)之間的相關(guān)性未見有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。表3 胃癌中HLA I類各分子與HLA I類分子復(fù)合物之間的關(guān)系HLA-AHLA-B/CHLA-A，B，C2mW6/321.09±0.831.27±0.961.36±0.811.11±0.901.24±0.92P<0.0001P<0.0001P<0.0001P=0.0961rs

44、=0.6943rs=0.8236rs=0.6775rs=0.3207 圖1 癌旁胃粘膜HLA-B/C抗原陽性染色 圖2 胃癌HLA-A抗原陽性染色膜型 ABC 法 400× 膜型 ABC 法400× 圖3胃癌 LMP2抗原 陽性染色 圖4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶 HLA-A抗原陰性染色ABC 法 400×漿型 （淋巴細(xì)胞陽性）ABC法 100× 圖5 2m抗原陽性染色 圖6 MK2-23 陰性對照膜漿型 ABC 法 400X ABC 法 100X圖7 胃癌中HLA I類分子的表達(dá) 圖8 HLA I類分子復(fù)合物胃癌陰性染色 圖9 HLA-A，B，C 抗原胃癌陰性染色癌

45、旁胃黏膜陽性染色 癌旁胃黏膜陽性染色 ABC法 100 × ABC法 100 × 圖10 2m抗原胃癌組織表達(dá)陰性 圖11 2m抗原胃癌組織表達(dá)陽性間質(zhì)表達(dá)陽性 ABC法 100 × ABC法 100 × 圖12 HLA-B/C抗原胃癌組織表達(dá)陽性 圖13 HAL-B/C抗原胃癌組織表達(dá)陰性ABC法 100 × 間質(zhì)表達(dá)陽性 ABC法 100 × 圖14 HLA-A抗原胃癌組織表達(dá)陽性 圖15 MK2-23 陰性對照ABC法 100 × ABC法 100 ×3討論【圍繞幾個要點進(jìn)行。參考論據(jù)要圍繞你要說明的論點展開

46、論述，切忌無病呻吟，不切合主題。同時討論要深入，不要膚淺而顯得太簡單。】從八十年代后期開始，F(xiàn)errone A, Lopez-Nenot MA, Teh M等陸續(xù)報導(dǎo)了胃癌中HLA分子的表達(dá)情況及其與病理學(xué)分型，臨床預(yù)后的關(guān)系。但同其它腫瘤一樣，由于各實驗室所用的方法和試劑的不同，結(jié)論不盡一致，也不利于互相比較和歸納總結(jié)。為此，第十二屆國際組織相容性抗原會議(IHWG)成立了“HLA表達(dá)與腫瘤”工作組，組織有關(guān)實驗室利用一套標(biāo)準(zhǔn)的試劑和方法以研究各型腫瘤的HLA抗原的改變頻率。并通過腫瘤的組織病理學(xué)特征，病程和HLA抗原表達(dá)水平的關(guān)系來評價各型腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中HLA抗原改變的臨床意義。目前

47、，國際上關(guān)于HLA分子在不同腫瘤中低表達(dá)或失表達(dá)的文獻(xiàn)較多，主要的結(jié)論有以下幾點：(1)HLA I類分子在許多腫瘤中有低表達(dá)或失表達(dá)的現(xiàn)象。主要形式有5種3： I類分子全部失表達(dá)或低表達(dá)：可能與2m蛋白合成，抗原肽轉(zhuǎn)運蛋白，MHC基因結(jié)構(gòu)缺陷有關(guān)，這類表型的細(xì)胞系有淋巴細(xì)胞系Daudi，黑色素瘤FO-1，結(jié)腸癌COVO。 I類分子單倍型失表達(dá)：很少見，可能與染色體不分離和有絲分裂重組有關(guān)。 A、B、C、TAP、LMP等位點選擇性失表達(dá)：黑色素瘤HLA-B7下調(diào)與原癌基因c-myc的轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)，可干擾HLA-B在啟動子水平的轉(zhuǎn)錄。這種類型能被細(xì)胞因子治療所逆轉(zhuǎn)。 I類分子某些特定等位基因選擇性

48、失表達(dá)：可能由于點突變、HLA基因部分缺失或基因斷裂重組的結(jié)果，不能被細(xì)胞因子治療所逆轉(zhuǎn)。 復(fù)合表型：不能歸納為以上4種情況者。例如在轉(zhuǎn)移的黑色素瘤上僅發(fā)現(xiàn)有HLA-A24表達(dá)10，另外還發(fā)現(xiàn)了HLA-B下調(diào)和HLA-A缺失造成的新表型33。(2)HLA I類分子全部失表達(dá)以及特定位點選擇性失表達(dá)的頻率在不同種腫瘤中有差異（16-50%），在子宮頸癌、前列腺癌和黑色素瘤中失表達(dá)的頻率高于頭頸部癌、乳房癌、肺癌和結(jié)腸癌。(3)HLA I類分子低表達(dá)的發(fā)生機(jī)制在不同腫瘤和個體中不同，主要涉及兩方面：（1）基因突變或大片段缺失及表達(dá)調(diào)控異常；（2）抗原加工異常：TAP失表達(dá)會導(dǎo)致A、B、C在胞內(nèi)不能

49、與抗原肽結(jié)合，從而不能表達(dá)于細(xì)胞膜上；LMP失表達(dá)對A、B、C的表達(dá)水平無明顯影響，但可改變它們提呈的多肽譜18。(4)HLA I類分子和TAP的低表達(dá)常常預(yù)示著腫瘤的臨床進(jìn)程加快和預(yù)后不良。如：在多種腫瘤中，I類分子和TAP在轉(zhuǎn)移癌組織中低表達(dá)頻率明顯高于原位癌組織；在黑色素瘤組織中，已證實它們的低表達(dá)與預(yù)后不良的判斷指標(biāo)（如原位癌組織的厚度、疾病的進(jìn)展階段、無癥狀的間歇期長短和存活率等）相關(guān)。(5) 在黑色素瘤的研究中表明：HLA I類分子的低表達(dá)在體外培養(yǎng)中能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞和NK細(xì)胞的敏感性喪失或降低；在體內(nèi)，低表達(dá)能明顯影響病人進(jìn)行T細(xì)胞免疫治療的效果。如在幾個黑色素瘤病人中，H

50、LA表達(dá)正常的原位癌階段，T細(xì)胞免疫治療的效果相當(dāng)滿意。當(dāng)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)后，T細(xì)胞療法則收效甚微。因此國際HLA工作組建議：在選擇病人進(jìn)行T細(xì)胞免疫治療時，應(yīng)常規(guī)檢測癌組織中HLA I類分子的表達(dá)情況，把HLA低表達(dá)程度和功能的完整性作為是否治療的標(biāo)準(zhǔn)。本實驗室利用IHWG提供的標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑對江蘇省185例胃癌石蠟標(biāo)本和50例新鮮胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，探討HLA抗原及相關(guān)分子在胃癌組織中的表達(dá)及意義，其中胃癌石蠟標(biāo)本部分?jǐn)?shù)據(jù)已在第十三屆國際組織相容性抗原會議上報導(dǎo)49。結(jié)果顯示，石蠟與冰凍組織切片的免疫組化染色結(jié)果基本一致。本研究用存檔的石蠟組織進(jìn)行免疫組化分析,方法簡便,結(jié)果滿意,使研究

51、者能夠獲得豐富的材料進(jìn)行回顧性研究,不受標(biāo)本來源的限制,值得推廣和應(yīng)用。我們還對50例胃癌及相應(yīng)癌旁組織的冰凍切片進(jìn)行了免疫組化分析。已知HLA I類分子復(fù)合物是三聚體分子，細(xì)胞表面HLA I類分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)的完整性，是判斷其是否具有功能的關(guān)鍵因素之一。能夠準(zhǔn)確、充分體現(xiàn)HLA I類分子復(fù)合物表達(dá)情況的單克隆抗體是W6/32，該抗體僅適用于冰凍組織切片，且新鮮組織的冰凍切片相對于石蠟組織切片，無須抗原修復(fù)等相應(yīng)特殊步驟的處理，對組織抗原的破壞性小，其結(jié)果更加真實、可靠。此外，其他抗體均是位點特異性的單克隆抗體，不能真實地反映HLA I類分子結(jié)構(gòu)和功能的完整性。更為重要的是，同例胃癌組織冰凍切片

52、免疫組化與HLA基因區(qū)域LOH的綜合分析，對闡明胃癌組織HLA I類及相關(guān)分子異常表達(dá)機(jī)制提供了良好的實驗依據(jù)。關(guān)于正常胃粘膜上皮HLA分子的表達(dá)存在爭議。本實驗胃癌石蠟組織與冰凍切片中，大部分癌旁胃粘膜上皮HLA I類抗原表達(dá)陽性，著色均一。這與Klein B50, 張宏博51等的結(jié)論一致，但Lopez-Nenot MA48等認(rèn)為其表達(dá)弱且不均一。結(jié)果的差異可能與各實驗室所選用的方法、試劑和判定標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。此外，由于HLA的表達(dá)存在個體的差異性，某些個別病例并不能反應(yīng)正常胃粘膜HLA分子表達(dá)的整體情況。因此，我們的研究結(jié)果表明正常胃粘膜HLA I類及相關(guān)分子的表達(dá)是穩(wěn)定、均一的。胃癌細(xì)胞H

53、LA I類及相關(guān)分子表達(dá)有明顯的下調(diào)或缺失。細(xì)胞表面的HLA I類分子是由重鏈、輕鏈和抗原肽共同組成的三元復(fù)合體，重鏈、輕鏈基因突變或I類分子依賴的抗原加工遞呈分子缺陷均可導(dǎo)致I類抗原表達(dá)下調(diào)或缺失。本實驗顯示，胃癌中HLA重鏈各分子和HLA I類分子復(fù)合物表達(dá)下調(diào)顯著，而且重鏈各分子與HLA I類分子復(fù)合物表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，尤以HLA-B/C抗原顯著（P<0.05）。輕鏈和一種抗原加工分子LMP2的改變較少，且與I類抗原的下調(diào)和丟失無統(tǒng)計學(xué)意義。這些數(shù)據(jù)表明HLA重鏈各分子可能是影響胃癌中HLA I類分子異常表達(dá)的重要因素之一。胃癌細(xì)胞HLA I類抗原表達(dá)與病理學(xué)類型有關(guān)。隨著腺癌分化

54、程度的增高，HLA-I類分子表達(dá)下調(diào)和缺失率減低。185例胃癌石蠟組織中，HLA-B/C位點的表達(dá)下調(diào)與病理學(xué)分期相關(guān)，低分化腺癌的下調(diào)率顯著高于高分化腺癌（P<0.05）。分化程度是組織成熟度的標(biāo)志，分化低的癌組織，HLA I類分子表達(dá)下調(diào)及缺失率高，易于逃避宿主的T細(xì)胞殺傷，可能是分化程度低的癌細(xì)胞更易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的原因之一。50例新鮮胃癌組織冰凍切片免疫組化結(jié)果顯示，HLA I類各分子表達(dá)水平與腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性（P >0.05）?？赡芘c我們的樣本例數(shù)較少，所用的抗體，組織材料的差異有關(guān)?；谀壳暗膶嶒炠Y料，只能就HLA分子表達(dá)與病理分級、臨床分期的關(guān)系做一趨勢性分析，如有可能應(yīng)擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步研究。此外，在20例原發(fā)胃癌轉(zhuǎn)移灶中，40%病例HLA I類分子的表達(dá)均弱于原發(fā)癌。在頭頸部惡性腫瘤，乳腺癌，肺癌等腫瘤中也存在這樣的現(xiàn)象52，說明在機(jī)體的免疫選擇作用下，HLA分子表達(dá)下調(diào)或丟失的腫瘤更容易逃避免疫攻擊，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究中，我們對石蠟和冰凍組織切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用了不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，因為我們所收集的185例胃癌石蠟標(biāo)本，僅有20例相應(yīng)的癌旁組織，按照第12屆國際組織相容性大會上