微透析-液相色譜-化學發(fā)光聯(lián)用微透析技術(shù)應用于中藥藥動學的研究(張群林)

1、微透析微透析- -液相色譜液相色譜- -化學發(fā)光聯(lián)用化學發(fā)光聯(lián)用技術(shù)應用于中藥藥動學的研究技術(shù)應用于中藥藥動學的研究安徽醫(yī)科大學藥學院安徽醫(yī)科大學藥學院張群林張群林 副教授副教一一個人簡歷個人簡歷二二化學發(fā)光技術(shù)化學發(fā)光技術(shù)三三液相色譜液相色譜化學發(fā)光聯(lián)用技術(shù)化學發(fā)光聯(lián)用技術(shù)四四微透析在體采樣技術(shù)微透析在體采樣技術(shù)五五丹參藥動學研究丹參藥動學研究3ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY個人簡歷個人簡歷1992.9-1996.6 沈陽藥科大學中藥系沈陽藥科大學中藥系1996.7-2000.8 安徽省藥物研究所中藥

2、新藥研發(fā)安徽省藥物研究所中藥新藥研發(fā)2000.9-2005.6 中國科學技術(shù)大學獲分析化學博士學位中國科學技術(shù)大學獲分析化學博士學位 （導師：崔華教授）（導師：崔華教授）2005.7 “安徽醫(yī)科大學引進人才安徽醫(yī)科大學引進人才”2005.7現(xiàn)在現(xiàn)在 藥學院藥物分析教研室藥學院藥物分析教研室 2006.8 任副教授、碩士生導師、中青年學術(shù)帶頭人任副教授、碩士生導師、中青年學術(shù)帶頭人 2009.7 任教研室主任任教研室主任 化學發(fā)光化學發(fā)光1作為一種自然現(xiàn)象很早就為人類所注意作為一種自然現(xiàn)象很早就為人類所注意 18771877年，年，Radziszewski2 證實在乙醇證實在乙醇KOH溶液中洛粉

3、溶液中洛粉堿堿( (Lophine, 2,4,5-2,4,5-三苯基咪唑三苯基咪唑) )被被H2O2等氧化發(fā)出綠等氧化發(fā)出綠光光 十九世紀末期，德國科學家十九世紀末期，德國科學家Wiedemann3首次解釋了化首次解釋了化學發(fā)光的機制學發(fā)光的機制1 B. T. P. Whitehead, L. J. Kricka, et.al. Clin. Chem. 25 (1979) 1531. 2 B. Radziszewski, Chem. Ber. 10 (1877) 70. 3 E. Wiedemann, Ann. Phys. Chem. 34 (1888) 446. 化學發(fā)光現(xiàn)象是一種相對簡單的

4、有機反應過程化學發(fā)光現(xiàn)象是一種相對簡單的有機反應過程 化學發(fā)光化學發(fā)光(Chemiluminescence, CL)4 R. Dubois, Acad. Sci. 132 (1901) 431. 5 K. van Dyke, F. McCapra, I. Behesti, Bioluminescnece and Chemiluminescence, Instruments and Applications. Vol 1. FL: CRC Press, 1985. 6 K. Gleu, Z. Petsch. Angew. Chem. 48 (1935) 57. 1901年，法國生物學家年，法國生

5、物學家Dubois4引入了熒光素引入了熒光素( (Luciferin)和熒光素酶和熒光素酶(Luciferase) 的概念的概念 19021902年，年，Schmitz合成發(fā)光試劑魯米諾合成發(fā)光試劑魯米諾( (Luminol) ), ,它曾被它曾被廣泛用于血跡鑒定；廣泛用于血跡鑒定；1928年年, ,Albrecht 觀察到魯米諾在堿觀察到魯米諾在堿性介質(zhì)中的化學發(fā)光行為性介質(zhì)中的化學發(fā)光行為5 1935年年, ,Gleu和和Petsch6報道了光澤精報道了光澤精(Lucigenin)與與H2O2反反應產(chǎn)生化學發(fā)光應產(chǎn)生化學發(fā)光 這些發(fā)光試劑的合成，對于化學發(fā)光發(fā)展為分這些發(fā)光試劑的合成，對于

6、化學發(fā)光發(fā)展為分析化學的一種重要手段起到了非常重要的作用析化學的一種重要手段起到了非常重要的作用 化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的發(fā)展歷史的發(fā)展歷史 由于大多數(shù)化學發(fā)光非常微弱，且稍縱即逝，早期的化學由于大多數(shù)化學發(fā)光非常微弱，且稍縱即逝，早期的化學發(fā)光研究主要集中在對化學發(fā)光反應現(xiàn)象的觀察和反應機發(fā)光研究主要集中在對化學發(fā)光反應現(xiàn)象的觀察和反應機理的探討上，其發(fā)展一直比較緩慢。理的探討上，其發(fā)展一直比較緩慢。 19451945年出現(xiàn)了光電倍增管，年出現(xiàn)了光電倍增管，19501950年出現(xiàn)了商品化的化學發(fā)年出現(xiàn)了商品化的化學發(fā)光檢測裝置光檢測裝置 到了八十年代，隨著生命科學、環(huán)境科學和材料科學的興到

7、了八十年代，隨著生命科學、環(huán)境科學和材料科學的興起，化學發(fā)光才被真正應用于分析化學并迅速得到了發(fā)展起，化學發(fā)光才被真正應用于分析化學并迅速得到了發(fā)展目前，化學發(fā)光分析的研究和應用已成為當前目前，化學發(fā)光分析的研究和應用已成為當前微量和痕量分析領域一個十分重要的研究方法微量和痕量分析領域一個十分重要的研究方法 化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的發(fā)展歷史的發(fā)展歷史化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的優(yōu)點的優(yōu)點1.1.靈敏度極靈敏度極高高 熒光素酶和磷酸三腺甙熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學發(fā)光分析，可的化學發(fā)光分析，可 測定測定2 10-17 mol/L的的ATP，即可檢測出一個細菌中，即可檢測出一個細菌中 的

8、的ATP含量含量2.2.線性范圍寬線性范圍寬 至少二個數(shù)量級以上至少二個數(shù)量級以上3.3.儀器設備簡單儀器設備簡單 不需要光源、單色器和背景校正不需要光源、單色器和背景校正4.4.分析速度快分析速度快 多數(shù)化學發(fā)光反應是快速反應，在瞬間或幾秒即多數(shù)化學發(fā)光反應是快速反應，在瞬間或幾秒即 可完成可完成, 100 samples h-15.5.易于自動化易于自動化 適合與適合與HPLC和和HPCE等其它的分離技術(shù)聯(lián)用，作等其它的分離技術(shù)聯(lián)用，作 為其高靈敏度的檢測器為其高靈敏度的檢測器 化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的基本原理的基本原理 化學反應釋放出的化學能激發(fā)產(chǎn)物分子或體系共存的其它化學反應釋放出的

9、化學能激發(fā)產(chǎn)物分子或體系共存的其它分子，這些分子分子，這些分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產(chǎn)生光輻射的現(xiàn)象。由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產(chǎn)生光輻射的現(xiàn)象。一一. . 化學反應必須釋放出足夠的能量可以使某種反應產(chǎn)化學反應必須釋放出足夠的能量可以使某種反應產(chǎn)物或中間體到達激發(fā)態(tài)；物或中間體到達激發(fā)態(tài)；二二. . 反應歷程必須有利于形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物；反應歷程必須有利于形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物；三三. . 這種激發(fā)態(tài)物質(zhì)必須具有一定的發(fā)光量子效率，或這種激發(fā)態(tài)物質(zhì)必須具有一定的發(fā)光量子效率，或者能夠?qū)⑵淠芰哭D(zhuǎn)移給共存的某種熒光物質(zhì)，產(chǎn)生者能夠?qū)⑵淠芰哭D(zhuǎn)移給共存的某種熒光物質(zhì)，產(chǎn)生光輻射。光輻射。 化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的必須條件的

10、必須條件化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的基本類型的基本類型q直接化學發(fā)光直接化學發(fā)光q間接化學發(fā)光間接化學發(fā)光 化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的定量原理的定量原理定量原理定量原理：在化學發(fā)光分析中，被分析物相在化學發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于發(fā)光試劑小得多，對于一級對于一級動力學反應：動力學反應： dc/dt =Kc定量依據(jù)：定量依據(jù)：（1 1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性（2）在一定條件下，在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其，其與與 被測物濃度成線性被測物濃度成線性 cttcttIAttcl0c

11、l0cldddd 化學發(fā)光化學發(fā)光(CL)的常見反應體系的常見反應體系& 魯米諾及其衍生物發(fā)光體系魯米諾及其衍生物發(fā)光體系& 吖啶類發(fā)光體系吖啶類發(fā)光體系 & 四價鈰發(fā)光體系四價鈰發(fā)光體系 & 其它發(fā)光體系其它發(fā)光體系 & 復雜體系中低含量物質(zhì)的檢測復雜體系中低含量物質(zhì)的檢測分析化學挑戰(zhàn)之一分析化學挑戰(zhàn)之一& 高選擇性和高靈敏度的分析技術(shù)高選擇性和高靈敏度的分析技術(shù)& 化學發(fā)光是高靈敏分析技術(shù)，靈敏度可與質(zhì)譜媲美化學發(fā)光是高靈敏分析技術(shù)，靈敏度可與質(zhì)譜媲美& 分布廣泛、療效確切的黃酮，易于發(fā)生氧化還原反應分布廣泛、療效確切的黃酮，

12、易于發(fā)生氧化還原反應前期工作基礎前期工作基礎液相色譜液相色譜化學發(fā)光（化學發(fā)光（HPLC-CL）聯(lián)用技術(shù)）聯(lián)用技術(shù)分析中藥黃酮成分分析中藥黃酮成分ChemiluminescenceProducing light with chemicals 化學發(fā)光化學發(fā)光(Chemiluminescence)技術(shù)技術(shù)液相色譜液相色譜-化學化學發(fā)光聯(lián)用技術(shù)發(fā)光聯(lián)用技術(shù) 發(fā)光新體系發(fā)光新體系 規(guī)律和機理規(guī)律和機理中藥材中藥材指紋圖譜指紋圖譜（復方）制劑（復方）制劑中藥藥動學中藥藥動學 葛根素注射液中葛根素含量的測定葛根素注射液中葛根素含量的測定OOOHHOOOHHOHOHOPuerarin首次報道化學發(fā)首次報道

13、化學發(fā)光法測定葛根素光法測定葛根素Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 36(3): 587592 草豆蔻中豆蔻明含量的測定草豆蔻中豆蔻明含量的測定OHOHOOCH3Cardarmonin首次報道化首次報道化學發(fā)光法測定學發(fā)光法測定豆蔻明豆蔻明Phytochemical Analysis, 2005, 16(1-2): 440-445.中藥沙棘制劑中的三種黃酮含量的測定中藥沙棘制劑中的三種黃酮含量的測定 沙棘沙棘( (Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科沙棘屬的植物，主要是胡頹子科沙棘屬的植物，主

14、要種植于中國的北方和西南地區(qū)。種植于中國的北方和西南地區(qū)。它是一種傳統(tǒng)的中草藥，很早以它是一種傳統(tǒng)的中草藥，很早以前就被人們用于止咳、助消化、前就被人們用于止咳、助消化、促進血液循環(huán)和止痛。沙棘油還促進血液循環(huán)和止痛。沙棘油還可以治療皮膚病和血栓可以治療皮膚病和血栓。 300510152025300.00.20.40.60.81.0QUKAISTime (min)Absorbance (a.u.)a05101520253050010001500200025003000ISKAQUTime (min)Relative CL Intensity (a.u.)b圖圖2 槲皮素、山萘酚和槲皮素、山萘酚

15、和異鼠李素標準化合物的異鼠李素標準化合物的DAD(a) 和和CL(b)檢測色檢測色譜圖譜圖QU, IS: 4.5 10-7 g mL-1 KA: 2.0 10-7 g mL-1051015202530400800120016002000ISKAQUTime (min)Relative CL Intensity (a.u.)a0510152025304008001200160020002400ISKAQUTime (min)Relative CL Intensity (a.u.)b圖圖3 3 心達康膠囊心達康膠囊(a)和沙棘顆粒和沙棘顆粒(b)樣品樣品中中三種黃酮醇的三種黃酮醇的CL檢測色譜圖檢

16、測色譜圖 Journal of Separation Science, 2005, 28(11): 1117-1256.圖圖4 二十種黃酮和酚類化合物的化學發(fā)光檢測色譜圖二十種黃酮和酚類化合物的化學發(fā)光檢測色譜圖首次報道能同時響應化合物首次報道能同時響應化合物種類最多的種類最多的CL檢測器檢測器Journal of Chromatography A 2005, 1095, 94-101.v 黃酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等顯著藥理作用，受到黃酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等顯著藥理作用，受到國內(nèi)外醫(yī)藥界的廣泛重視，但其藥動學研究資料的缺乏，制國內(nèi)外醫(yī)藥界的廣泛重視，但其藥動學研究資料的缺乏，

17、制約了黃酮類新藥的研發(fā)與體內(nèi)作用機制研究約了黃酮類新藥的研發(fā)與體內(nèi)作用機制研究v 生物樣品中痕量黃酮的高通量、高靈敏分析技術(shù)是研究藥動生物樣品中痕量黃酮的高通量、高靈敏分析技術(shù)是研究藥動學的基本前提學的基本前提v 中藥藥動學研究所面臨的生物樣本具有藥物含量低（樣品中中藥藥動學研究所面臨的生物樣本具有藥物含量低（樣品中的中藥成分濃度常在的中藥成分濃度常在ng / mL水平或以下）、藥物濃度變化范水平或以下）、藥物濃度變化范圍大（需要測定的血藥濃度范圍為峰濃度圍大（需要測定的血藥濃度范圍為峰濃度 Cmax 1/20 Cmax ）、干擾組分多且不確定、樣品不易重復獲得等特點）、干擾組分多且不確定、樣

18、品不易重復獲得等特點 HPLC-CL聯(lián)用技術(shù)應用于黃酮藥動學研究聯(lián)用技術(shù)應用于黃酮藥動學研究24ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY液相色譜液相色譜化學發(fā)光法測定大鼠血漿中化學發(fā)光法測定大鼠血漿中山奈酚濃度及其藥動學研究山奈酚濃度及其藥動學研究 25ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY研究背景研究背景山奈酚的性質(zhì)山奈酚的性質(zhì)藥理作用廣泛，藥動資料缺乏藥理作用廣泛，藥動資料缺乏 僅有兩篇報道：僅有兩篇報道： 家兔灌胃，家兔灌胃，HPLC-DAD，前處理復雜，前處理復雜 大鼠靜注

19、，大鼠靜注，HPLC-UV，未報道藥動學參數(shù)，未報道藥動學參數(shù)OHOOOHOHHO1234567812345626ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY實驗方法實驗方法HPLC-CL條件的條件的優(yōu)化優(yōu)化1.色譜分離條件流動相不增加背景、不熄滅發(fā)光信號；不生成沉淀發(fā)光試劑混合次序發(fā)光反應試劑的濃度、試劑流速等2.發(fā)光反應兼容性3. 流路的優(yōu)化4.發(fā)光反應條件分離度、峰形、保留時間02468107007508008509009501000105011000.00.10.20.30.40.50.60.70.80.970080090010001

20、10012001300140015000.30.40.50.60.71440146014801500152015400.51.01.52.02.53.03.52004006008001000120014001600Relative CL Intensity (a.u.) Concentration of Rhodamine 6G ( mol/l)abRelative CL Intensity (a.u.) Concentration of Cerium(IV) (mmol/l)cRelative CL Intensity (a.u.)Concentration of Sulfuric Acid

21、 (mol/l)dFlow Rate (ml/min)Relative CL Intensity (a.u.)27ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITYHPLC-CL實驗裝置示意圖實驗裝置示意圖DADComputerInterfacePMTCellHPLC PumpInjection ValveHPLC ColumnPeristaltic Pump1.5 mLmin-1Rho 6G0.4 % aqueous phosphoric acid Methanol Waste1.5 mL min-1Cerium (IV)Mixing Tee28

22、ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY血漿樣品的預處理方法血漿樣品的預處理方法取血漿樣品取血漿樣品100 L，精密加入內(nèi)標溶液（，精密加入內(nèi)標溶液（0.2 mg mL-1 異鼠李素）異鼠李素）5.0 L，20%的磷酸溶液的磷酸溶液10 L酸化，加甲醇酸化，加甲醇200 L，渦旋混合，渦旋混合1.0 min，離心，離心（10000 r min-1）10 min后，取上清液后，取上清液10 L進樣。進樣。29ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY方法學考察方法學考察專屬性專屬性1 1

23、線性關(guān)系和檢測限線性關(guān)系和檢測限2 2精密度、準確度與提取回收率精密度、準確度與提取回收率 3 3穩(wěn)定性穩(wěn)定性4 430ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY結(jié)結(jié) 果果專屬性專屬性0510152025050100150200250300350400450500KAISRelative CL Intensity (a.u.)Retention Time (min)abc123SampleBlankBlank+KA+IS31ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY結(jié)結(jié) 果果線性關(guān)系和檢

24、測限線性關(guān)系和檢測限 線性范圍：線性范圍：2.0 10-92.0 10-6g ml-1線性方程：線性方程：y = 0.8626 x + 5.553 (r = 0.9991, n = 7)檢測限檢測限 ：1.0 10-9 g mL-1。32ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY結(jié)結(jié) 果果精密度、準確度與提取回收率精密度、準確度與提取回收率 日內(nèi)和日間日內(nèi)和日間RSD均小于均小于5.0%，回收率大于，回收率大于80.0% Added (ng mL-1)Found (ng mL-1)Precision (%RSD)Accuracy (%)Re

25、covery(%)Intra-day20.016.2 0.63.780.889.2 3.1160.0151.3 3.02.094.697.1 1.710001001.2 32.83.3100.195.3 2.7Inter-day20.016.0 0.74.480.090.0 4.3160.0150.7 4.63.193.997.4 2.41000.01002.4 13.01.3100.295.1 2.433ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY結(jié)結(jié) 果果4穩(wěn)定性穩(wěn)定性xxConcentration(ng mL-1)0 h48 hDevi

26、ation(%) sRSD(%) sRSD (%)20.016.0 0.63.816.4 0.63.60.7160.0152.1 3.02.0146.6 2.61.81.61000.0997.2 28.92.9949.5 25.62.72.6凍融穩(wěn)定性凍融穩(wěn)定性Concentration(ng mL-1)Before freeze-thawingAfter freeze-thawingDeviation(%)x sRSD(%)x sRSD (%)20.016.0 0.63.815.7 0.74.30.8160.0152.1 3.02.0142.2 2.61.73.41000.0997.2 28

27、.92.9951.6 33.93.42.334ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY藥動學研究藥動學研究 給藥給藥1250mg/kg BW隨機分組隨機分組2500mg/kg BW前處理前處理取血取血C-T數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)DAS 2.0藥動參數(shù)藥動參數(shù)首次成功將首次成功將HPLC-CL聯(lián)用技術(shù)應用于聯(lián)用技術(shù)應用于中藥藥動學的研究中藥藥動學的研究多峰現(xiàn)象多峰現(xiàn)象肝腸循環(huán)肝腸循環(huán)37ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY結(jié)結(jié) 果果藥動學參數(shù)藥動學參數(shù)ParametersDoses (mg kg

28、-1 BW)25001250Tmax (h)1.21 0.461.08 0.43Cmax (ng mL-1)232.90 5.14165.67 1.99AUC0- (ng h mL-1)1728.41 57.31729.01 29.44MRT0- (h)13.38 3.874.77 2.06t1/2 (h)9.27 1.843.30 1.05Journal of Chromatography B, 2009, 877(29),3595-3600.30微透析采樣技術(shù)微透析采樣技術(shù)ANHUI MEDICAL UNIVERSITYANHUI MEDICAL UNIVERSITY微透析技術(shù)微透析技術(shù)

29、(microdialysis, MD)時間分辨性、空間分辨性時間分辨性、空間分辨性不破壞機體完整性不破壞機體完整性提供游離態(tài)小分子化合物提供游離態(tài)小分子化合物樣品可不經(jīng)預處理直接用于測定樣品可不經(jīng)預處理直接用于測定樣品量少、濃度低樣品量少、濃度低微透析微透析v 多個器官連多個器官連續(xù)取樣續(xù)取樣v 與高靈敏度與高靈敏度分析技術(shù)聯(lián)分析技術(shù)聯(lián)用用v 活體內(nèi)待測活體內(nèi)待測組分的實時、組分的實時、連續(xù)、檢測連續(xù)、檢測 微透析微透析液相色譜液相色譜化學發(fā)光法測定大鼠化學發(fā)光法測定大鼠血和腦組織中丹參酚類化合物濃度血和腦組織中丹參酚類化合物濃度及其藥動學研究及其藥動學研究 脂溶性成分脂溶性成分二萜醌類二萜醌

30、類水溶性成分酚類水溶性成分酚類丹參素丹參素DSS、原兒茶酸、原兒茶酸PA、原兒茶醛原兒茶醛PAL、咖啡酸、咖啡酸CA丹酚酸丹酚酸 A、丹酚酸、丹酚酸B等等丹參丹參近期藥理研究發(fā)現(xiàn)：近期藥理研究發(fā)現(xiàn)：丹參酚類化合物具有改善血液循環(huán)、丹參酚類化合物具有改善血液循環(huán)、減少腦梗死面積、抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)、和清除自由基、減少腦梗死面積、抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)、和清除自由基、保護損傷的腦組織等藥理作用。保護損傷的腦組織等藥理作用。研究背景研究背景研究背景研究背景 丹參水溶性成分的藥動學研究丹參水溶性成分的藥動學研究l吸收和分布：吸收和分布： 丹參提取物給家兔灌服，采用液丹參提取物給家兔灌服，采用液-液

31、萃取技術(shù)對家兔血漿液萃取技術(shù)對家兔血漿中的丹參素進行萃取，用膠束毛細管電泳進行測定。灌胃后中的丹參素進行萃取，用膠束毛細管電泳進行測定。灌胃后30 min，肝、肺、腎、腦組織中的丹參素濃度最高；，肝、肺、腎、腦組織中的丹參素濃度最高；70 min時，時，心組織中丹參素濃度最高；心組織中丹參素濃度最高；50 min時，脾組織中時，脾組織中DSS濃度最高。濃度最高。灌胃給藥后，灌胃給藥后，DSS在很短的時間內(nèi)進行吸收、分布。其中肝組在很短的時間內(nèi)進行吸收、分布。其中肝組織中的丹參素濃度最大，表明織中的丹參素濃度最大，表明DSS在新西蘭大白兔體內(nèi)的代謝在新西蘭大白兔體內(nèi)的代謝主要在肝組織中進行。主要

32、在肝組織中進行。楊燕楊燕, 楊榮楊榮, 衛(wèi)引茂衛(wèi)引茂, 等等. 藥物分析雜志藥物分析雜志. . 2008, 28(3): 362. 研究背景研究背景l(fā)代謝和排泄代謝和排泄 Zhang等利用等利用HPLC-UV和和HPLC-MS對大鼠灌胃對大鼠灌胃200 mg kg-1丹參總酚酸（丹參素丹參總酚酸（丹參素 2.3%，原兒茶醛，原兒茶醛4.6%，丹酚酸，丹酚酸B 60.7%）后）后尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物進行了研究，在收集的尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物進行了研究，在收集的24 h尿液中檢測到尿液中檢測到5個代謝產(chǎn)物：丹參素、咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸和個代謝產(chǎn)物：丹參素、咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸和3,4-二

33、甲氧基二甲氧基苯乙酸，而在糞便中未檢測到代謝產(chǎn)物。苯乙酸，而在糞便中未檢測到代謝產(chǎn)物。 Shen等利用等利用LC/TOFMS，對大鼠靜脈注射純化的丹酚酸，對大鼠靜脈注射純化的丹酚酸A后血后血漿中的代謝產(chǎn)物進行了研究，發(fā)現(xiàn)了漿中的代謝產(chǎn)物進行了研究，發(fā)現(xiàn)了5個代謝產(chǎn)物：單葡萄糖醛酸個代謝產(chǎn)物：單葡萄糖醛酸化丹酚酸化丹酚酸A、甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸、甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸A、甲基丹酚酸、甲基丹酚酸A，二甲基丹，二甲基丹酚酸酚酸A和二甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸和二甲基葡萄糖醛酸化丹酚酸A。Zhang J, He Y, Cui M, et al. Biomedical Chromatography. 20

34、05, 19(1): 51.Shen Y, Wang X, Xu L, et al. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2009, 23(12): 1810.研究背景研究背景l(fā)藥動學參數(shù)及生物利用度藥動學參數(shù)及生物利用度 Guo等用等用LC-MS測定了大鼠注射冠心寧凍干粉后血漿中測定了大鼠注射冠心寧凍干粉后血漿中DSS，PA，PAL，綠原酸，綠原酸，CA和和SalB的濃度。獲得了這幾種酚類化合物的的濃度。獲得了這幾種酚類化合物的t1/2，Cmax，Tmax。 潘堅揚等考察了丹參素在大鼠體內(nèi)藥動學和口服生物利用度。用潘堅揚等考察了丹參素在大鼠體

35、內(nèi)藥動學和口服生物利用度。用超高壓液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定丹參素血藥濃度，計算藥超高壓液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定丹參素血藥濃度，計算藥動學參數(shù)，丹參素的口服生物利用度為動學參數(shù)，丹參素的口服生物利用度為9.53%，口服生物利用度較差。，口服生物利用度較差。 Han等用等用LC-MS測定了大鼠靜脈注射劑量為測定了大鼠靜脈注射劑量為10、20和和40 mg kg-1 的純度為的純度為98 %的的SalB后的血藥濃度，求算了后的血藥濃度，求算了AUC，MRT，t1/2，V等參等參數(shù)，發(fā)現(xiàn)數(shù)，發(fā)現(xiàn)AUC隨劑量增加，各劑量組之間隨劑量增加，各劑量組之間MRT，t1/2和和V無差異。無差異。

36、Guo XR, Chen XH, Li L, et al. Journal of Chromatography B. 2008, 873(1): 51.潘堅揚潘堅揚, 趙筱萍趙筱萍, 邵青邵青. 中國中藥雜志中國中藥雜志. 2008, 33(2): 146.Han DE, Gao ZD, Zhao D, et al. Biomedical Chromatography. 2009, 23(10): 1073.研究背景研究背景l(fā) 腦部藥動學研究腦部藥動學研究 羅世英等對大鼠灌胃丹參水提物（羅世英等對大鼠灌胃丹參水提物（DSS 32.4 , PAL 6.0, SalB 36.2 mg kg-1）采

37、用液）采用液-液萃取法對血清樣品和腦組織勻漿樣品進行預處理，液萃取法對血清樣品和腦組織勻漿樣品進行預處理，用用HPLC-UV法測定，在大鼠血清中檢測到法測定，在大鼠血清中檢測到DSS、PAL和和SalB，在腦組，在腦組織勻漿中未檢測到這三種物質(zhì)。但由于紫外檢測器靈敏度較低，腦勻漿織勻漿中未檢測到這三種物質(zhì)。但由于紫外檢測器靈敏度較低，腦勻漿中未檢測到的原因有待進一步試驗證明？中未檢測到的原因有待進一步試驗證明？ 鄭曉暉等在研究復方丹參方中使藥冰片對君藥丹參藥動學和組織分鄭曉暉等在研究復方丹參方中使藥冰片對君藥丹參藥動學和組織分布的影響時，用丹參水煎液對新西蘭大白兔灌胃給藥（布的影響時，用丹參水

38、煎液對新西蘭大白兔灌胃給藥（10g kg-1），通），通過從小腦延髓池抽取腦脊液，以及腦組織勻漿采用過從小腦延髓池抽取腦脊液，以及腦組織勻漿采用LC-MS，在腦脊液和，在腦脊液和腦組織勻漿中測得腦組織勻漿中測得DSS，但未報道丹參素在腦組織中的藥動學參數(shù)。，但未報道丹參素在腦組織中的藥動學參數(shù)。羅世英羅世英, 鐘志國鐘志國, 林堅濤林堅濤, 等等. 中藥藥理與臨床中藥藥理與臨床. 2009, 25(4): 44.鄭曉暉鄭曉暉, 趙欣趙欣, 房敏峰房敏峰, 等等. 西安交通大學學報西安交通大學學報 (醫(yī)學版醫(yī)學版). 2007, 28(2): 170.研究背景研究背景存在問題：存在問題：腦組織藥

39、代動力學研究的報道較少。測定腦組腦組織藥代動力學研究的報道較少。測定腦組織中藥物含量多采取腦組織勻漿法或抽取腦脊液進行測定織中藥物含量多采取腦組織勻漿法或抽取腦脊液進行測定30微透析微透析（microdialysis , MD）采樣技術(shù)采樣技術(shù)應用于丹參藥動學研究應用于丹參藥動學研究 臺灣臺灣Tsai課題組用課題組用HPLC-UV法測定了大鼠靜脈注射純度為法測定了大鼠靜脈注射純度為98%的的 丹酚酸丹酚酸B（100 mg kg-1）后，血液和膽汁中的游離后，血液和膽汁中的游離SalB，線性范圍為線性范圍為0.150g mL-1，并，并報道了藥動學參數(shù)。報道了藥動學參數(shù)。Chen YF, Jaw

40、 I, Shiao MS, et al. Journal of Chromatography A. 2005, 1088(1-2): 140.研究內(nèi)容研究內(nèi)容HPLC-CL體系的建立體系的建立微透析采樣技術(shù)的研究微透析采樣技術(shù)的研究丹參藥動學研究丹參藥動學研究實驗一實驗一 靜脈注射給藥靜脈注射給藥實驗二實驗二 口服給藥口服給藥 OHOHOHO OHOHO OHOHOOH HOOHOHOOOOHOOOHOHOHOOHOHO HOHOHOOOOOHOHOHHOHOOHOOHOHProtocatechuic aldehyde (PAL)Danshensu (DSS)Protocatechuic ac

41、id (PA)Caffeic acid (CA)Salviandic acid B (SalB)Salviandic acid A (SalA) 流動相組成、流動相組成、pH、流速、流速 發(fā)光反應流路、試劑濃度、發(fā)光反應流路、試劑濃度、pH、流速、流速DADComputerInterfacePMTCellHPLC PumpInjection ValveHPLC ColumnPeristaltic Pump2.0 mL min-12.0 mL min-1HAuCl4H2O20.1% aqueous phosphoric acid 0.1% methanolphosphoric acidWaste

42、2.0 mL min-1LuminolMixing Teev 實驗一：實驗一： 色譜柱：色譜柱：Shim-pack ODS, 250 4.6 mm I.D. 5 m 柱溫柱溫: 30C 流速：流速：1.0 mL min-1 流動相：流動相：A：水（含：水（含0.1%磷酸，磷酸，v/v） B：甲醇（含：甲醇（含0.1%磷酸，磷酸，v/v） 梯度洗脫：梯度洗脫：015 min，2550% B；1530 min，50% B 進樣量：進樣量：20 L。v 實驗二：實驗二： 流動相：流動相：0.1%磷酸磷酸甲醇（甲醇（92: 8，v/v），等度洗脫），等度洗脫 其他條件同實驗一其他條件同實驗一液相色譜的

43、分析條件液相色譜的分析條件色譜與化學發(fā)光分析條件的優(yōu)化色譜與化學發(fā)光分析條件的優(yōu)化9.510.010.511.011.512.0010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity / a.u.pH of NaHCO3-Na2CO3 Buffer(a)010203040500200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity /(A.U.)Concentration of Luminol / mol L-1(b)20304050607080020004000

44、60008000100001200014000Relative CL Intensity / a.u.Concentration of HAuCl4 / g mL-1(c)02040608010010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity /a.u.Concentration of H2O2 / mol L-1(d)0.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.4200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity / a.u.Flo

45、w Rate / mL min-1(e)9.510.010.511.011.512.0010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity / a.u.pH of NaHCO3-Na2CO3 Buffer(a)010203040500200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity /(A.U.)Concentration of Luminol / mol L-1(b)20304050607080020004000600080001000012000140

46、00Relative CL Intensity / a.u.Concentration of HAuCl4 / g mL-1(c)02040608010010002000300040005000600070008000900010000Relative CL Intensity /a.u.Concentration of H2O2 / mol L-1(d)0.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.4200040006000800010000120001400016000Relative CL Intensity / a.u.Flow Rate / mL min-1(e)

47、DSS PAA PAL CA SalB SalAv 儀器設備：腦立體定位儀腦立體定位儀微量注射泵微量注射泵動物恒溫控制器動物恒溫控制器 血管探針血管探針腦探針腦探針.Text 2Text 3模型模型組組Blood probeBrain probe血管探針的植入血管探針的植入腦探針的植入腦探針的植入l 探針回收率的測定探針回收率的測定 體外：體外：Rin vitro = Cdia/ Cs 體內(nèi)：體內(nèi)：Rin vivo = (Cperf Cdial)/Cperf 實際濃度實際濃度 ：Cf = Cm/R in vivo 流速對探針回收率的影響流速對探針回收率的影響 血管探針：血管探針：2.5、2.0

48、、1.5 L min-1 腦探針腦探針 ：1.0、0.8、0.6 L min-1 濃度對探針回收率的影響濃度對探針回收率的影響 在所選濃度范圍內(nèi)無影響在所選濃度范圍內(nèi)無影響探針回收率的穩(wěn)定性探針回收率的穩(wěn)定性 4 h內(nèi)的體外回收率的內(nèi)的體外回收率的RSDv 給藥給藥實驗一：丹參注射液（實驗一：丹參注射液（ DSS 3.5 mg/kg，PAL 0.5 mg/kg，SalB 0.48 mg/kg）尾靜脈注射）尾靜脈注射實驗二：丹參提取物灌胃實驗二：丹參提取物灌胃(DSS，40 mg /kg，PAL149 mg /kg, SalB 50 mg/kg ) 灌胃灌胃v 樣品采集樣品采集灌流液種類：林格液

49、灌流液種類：林格液實驗一：采樣部位：腦；灌流液流速實驗一：采樣部位：腦；灌流液流速 2.0L/min。采樣間隔。采樣間隔15 min實驗二：采樣部位：血管、腦同步；灌流液速度：血管實驗二：采樣部位：血管、腦同步；灌流液速度：血管2.0L/min； 腦腦0.8 L/min；采樣時間間隔：血管；采樣時間間隔：血管15 min；腦；腦30 min& 專屬性專屬性 樣品中的雜質(zhì)不干擾測定樣品中的雜質(zhì)不干擾測定& 線性關(guān)系和檢測限線性關(guān)系和檢測限 各酚類化合物的線性關(guān)系良好（各酚類化合物的線性關(guān)系良好（R0.990）。）。 LOD：實驗一：實驗一： 0.22 12.80 ng/mL，實驗

50、二：，實驗二：0.29 0.80 ng/mL& 精密度和準確度精密度和準確度 日內(nèi)和日間日內(nèi)和日間RSD均小于均小于5.5% DSS 丹參素；丹參素； PA 原兒茶酸；原兒茶酸；PAL 原兒茶醛；原兒茶醛； CA 咖啡酸；咖啡酸；SalB 丹參素丹參素B； SalA 丹酚酸丹酚酸A濃度：濃度：64.0 ng/mLAbsorbanceRelative CL Intensity (a.u.)UVCL(a )(b )(c )(d )HPLC-CLHPLC-UVblood microdialysateBlank brian microdialysateBlank blood microdialysateBrian microdialysate& 實驗一：丹參注射液靜脈給藥 丹參注射液給藥后（丹參注射液給藥后（DSS 3.5 mg/kg BW，PAL 0.5 mg/kg BW，SalB 0.48 mg/kg BW）在血液和腦中均觀察到）在血液和腦中均觀察到DSS，而未見，而未見PAL與與SalB。 腦中游離腦中游離DSS的的C-T 曲線曲線0.00.51.01.52.02.50100200300400500600DSS Concentration in Brai