淺談轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲(chóng)研究上的應(yīng)用

1、·生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用論文·題目：淺談轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲(chóng)研究上的應(yīng)用論文提綱一、國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展 1.1國(guó)外的研究情況 1.2我國(guó)的研究現(xiàn)狀2、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲(chóng)研究上的應(yīng)用 2.1.蘇云金桿菌毒蛋白基因 2.1.1概述 2.1.2機(jī)理及應(yīng)用 2.2植物凝集素基因 2.2.1概述 2.2.2機(jī)理及應(yīng)用 2.3蛋白酶抑制劑基因 2.3.1概述機(jī)理及應(yīng)用三、結(jié)論與展望 3.1結(jié)論 3.2展望淺談轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲(chóng)研究上的應(yīng)用【摘要】隨著轉(zhuǎn)基因植物商品化進(jìn)程的不斷加深，轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展前景也越來(lái)越來(lái)起人們的關(guān)注，本文筆者于植物抗蟲(chóng)基因工程在國(guó)內(nèi)外的進(jìn)展情況的基礎(chǔ)上

2、，就轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲(chóng)研究上的應(yīng)用進(jìn)行探討研究?！娟P(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)基因技術(shù) 抗蟲(chóng)機(jī)理 基因蟲(chóng)害嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定發(fā)展。長(zhǎng)期以來(lái)人們普遍采用化學(xué)殺蟲(chóng)劑來(lái)控制害蟲(chóng)，但隨著時(shí)間的推移尤其是化學(xué)農(nóng)藥的大量、不合理的使用，帶來(lái)了如農(nóng)藥殘留、害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性、殺滅天敵等自然生態(tài)平衡被破壞、環(huán)境污染的嚴(yán)重問(wèn)題。利用植物抗蟲(chóng)基岡工程培育的抗蟲(chóng)作物，可以避免害蟲(chóng)危害，還具有成本低、保護(hù)全、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，從而倍受關(guān)注，成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)生物工程研究的一個(gè)熱點(diǎn)。植物抗蟲(chóng)基因工程是植物基因工程中最為重要的研究?jī)?nèi)容之一。自從l987年比利時(shí)植物遺傳所的Vaeck等AYI首先報(bào)道了外源抗蟲(chóng)

3、基閣轉(zhuǎn)入炯草，隨后Barton等和美國(guó)孟山都公司的Fishhoff等人也都報(bào)道了他們獲得抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草和番茄植株的研究，由此開(kāi)創(chuàng)了植物抗蟲(chóng)育種的新領(lǐng)域。目前已有多種植物抗蟲(chóng)基因在煙草、水稻、玉米、棉花、馬鈴薯等多種作物上獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植株，有的已申請(qǐng)到田間釋放和商品化生產(chǎn)。本文筆者于植物抗蟲(chóng)基因工程在國(guó)內(nèi)外的進(jìn)展情況的基礎(chǔ)上，就轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲(chóng)研究上的應(yīng)用進(jìn)行探討研究。一、國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展 1.1國(guó)外的研究情況 1987年比利時(shí)科學(xué)家首次成功地將Bt毒蛋白基因?qū)藷煵菀詠?lái)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物的研究日新月異、碩果累累。迄今為止，得到的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物種類已達(dá)25種以上，有的已進(jìn)入商品化生產(chǎn)1。

4、根據(jù)它們的來(lái)源，已克隆得到的抗蟲(chóng)基因可分為三類：第一類是從細(xì)菌中分離出來(lái)的抗蟲(chóng)基因，主要是蘇云金桿菌殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白(Bt)基因；第二類是從植物組織中分離出的抗蟲(chóng)基因，主要為蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因(Lec)等，應(yīng)用最廣泛的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)；第三類是從動(dòng)物體內(nèi)分離的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等2。 1.2我國(guó)的研究現(xiàn)狀 在報(bào)道了首例有關(guān)轉(zhuǎn)Bt基因煙草和番茄的研究后，Bt基因被相繼轉(zhuǎn)入到棉花、水稻、玉米、蘋(píng)果和核桃等作物中，目前已經(jīng)有6O多種Bt基因被報(bào)道。美國(guó)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因?qū)霘ぷ衙?，育成世界上首例抗蟲(chóng)棉，棉鈴蟲(chóng)為害率下降5O。

5、1996年美國(guó)Bt基因抗蟲(chóng)棉種植面積72萬(wàn)hm，約占總植棉面積143。我國(guó)是繼美國(guó)后育成抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉的第二個(gè)國(guó)家，育成中國(guó)第一代單價(jià)抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)性在9O 以上，減少用藥6O 8O，增產(chǎn)3O4O 4。1992年底中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心的郭三堆等5 人在國(guó)內(nèi)首先人工合成了Bt基因之后，又對(duì)豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因進(jìn)行了修飾，構(gòu)建了同時(shí)帶有這兩種基因的雙價(jià)殺蟲(chóng)基因高效植物表達(dá)載體，再通過(guò)花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入我國(guó)不同棉花生產(chǎn)區(qū)的主栽品種，已獲得了數(shù)十個(gè)雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉株系。雙價(jià)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花研制成功并大面積進(jìn)入田間試驗(yàn)，目前在國(guó)外尚未見(jiàn)報(bào)道，標(biāo)志著我國(guó)在抗蟲(chóng)棉的研究方面已達(dá)到了國(guó)際先進(jìn)

6、水平。 二、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物抗蟲(chóng)研究上的應(yīng)用 2.1.蘇云金桿菌毒蛋白基因 2.1.1概述 蘇云金芽孢桿菌(研)晶體蛋白基因，克隆于蘇云金芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，分類上屬原核生物，細(xì)菌綱，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，廣泛存在于土壤、塵埃、水域、沙漠、植被、昆蟲(chóng)尸體中。Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白是蘇云金芽孢桿菌在芽孢形成過(guò)程中產(chǎn)生的。德國(guó)科學(xué)家Berliner最早從患病地中海螟中分離到了這種芽孢桿菌，并命名為“ Bacillus thuringiensis n.sp.。蘇云金芽孢桿菌可產(chǎn)生對(duì)鱗翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Col

7、eopterans)和雙翅目(Dipterans)等作物害蟲(chóng)有毒性的伴孢結(jié)晶蛋白質(zhì)(Kozicl M G etal，1993)。由于Bt殺蟲(chóng)蛋白對(duì)不同的昆蟲(chóng)具有很強(qiáng)的專一性和高度選擇性，對(duì)植物、人畜無(wú)害。據(jù)統(tǒng)計(jì)已有60多種Bt基因被報(bào)道，根據(jù)它們的殺蟲(chóng)范圍和基因序列的同源性可大致分為六大類，即Cryl、cry2、Cry3、Cry4、Cry5和Cyt，每一類又包含有不同的亞基，前五類稱為晶體蛋白基因家族(Crystal Protein Coden Gene)，第六類稱為細(xì)胞外溶解性晶體蛋白基因(Cytolytic ProteinCoden Gene)。 2.1.2機(jī)理及應(yīng)用 從基因結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，由于

8、蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白來(lái)源于原核生物，在基因結(jié)構(gòu)上同真核生物有著顯著的區(qū)別，在轉(zhuǎn)入植株后，在基因的表達(dá)上存在著不穩(wěn)定的因素，表現(xiàn)為不表達(dá)或表達(dá)極弱等，故植株表現(xiàn)為抗性很弱或無(wú)抗性。研究發(fā)現(xiàn)在不改變表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，根據(jù)植物偏愛(ài)，適當(dāng)?shù)膶?duì)編碼蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白基因進(jìn)行改造后，在植物的表達(dá)效率大大的改善。后來(lái)，研究者采用完全改變基因結(jié)構(gòu)的方法(如，G+C的含量有原來(lái)的37提高到49 ；18個(gè)Polv(A)序列減少到1個(gè)；ATTTA序列由13個(gè)減為零等)使基因結(jié)構(gòu)完全符合植物的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果得到了表達(dá)量可觀的轉(zhuǎn)化植株6。有趣的是，新近克隆的Crv1 la5基因可不經(jīng)改造而在植株中高效表達(dá)7，

9、這一發(fā)現(xiàn)引起了科研工作者的極大興趣，具有特殊的意義。 2.2植物凝集素基因 2.2.1概述Lectin是一種含有非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合到特異單糖或寡糖上的植物保守性(糖)蛋白，主要存在于很多植物的種子和營(yíng)養(yǎng)組織中。自1988年Stillmark在蓖麻中發(fā)現(xiàn)一種蛋白酶細(xì)胞凝集因子以來(lái)，人們已經(jīng)分離了幾百種凝集素，并研究了其生化結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)還克隆了許多凝集素基因。目前成功應(yīng)用于植物抗蟲(chóng)基因工程的凝集素基因有：雪花蓮凝集素(GNA)基因，豌豆凝集素(PLec)基因，麥胚凝集素(WGA)基因，半夏凝集素(PTA)基因。有人研究發(fā)現(xiàn)稻胚凝集素可以與N一乙酰葡萄胺專化結(jié)合，具有同WGA相似的抗蟲(chóng)性。

10、我國(guó)王亦菲(2ooo)以普通水稻為模板，擴(kuò)增出了凝集素基因。部分凝集素對(duì)哺乳動(dòng)物也有顯著毒害，如WGA、PTA，這樣就使得這些凝集素不適于轉(zhuǎn)基因。而GNA對(duì)哺乳動(dòng)物毒害較小，因此大部分工作就集中在了GNA基因的轉(zhuǎn)化研究上，迄今為止GNA基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到馬鈴薯、番茄、煙草、萵苣等9種作物。研究證明GNA對(duì)刺吸式口器的昆蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)、褐飛虱等同翅目及線蟲(chóng)有特效，對(duì)咀嚼式口器也有中等毒殺作用82.2.2機(jī)理及應(yīng)用 凝集素是植物界普遍存在的一類保守性很強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在植物體內(nèi)有著特殊的生理功能。從現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基岡植物的抗蟲(chóng)性來(lái)看，禾本科中典型的植物凝集素麥胚凝集素(WGA)，對(duì)歐洲玉米螟有良好的抗性，并且KSPo

11、well等人將WGA以0.1(wv)飼喂稻褐飛虱(Nilapaveta lugens)超過(guò)24h，同對(duì)照相比蜜汁滴數(shù)顯著降低了54，盡管平均喂WGA的昆蟲(chóng)分泌蜜汁體積小于對(duì)照，但差異并不 著(cp>O.05)；雪蓮花凝集素(GNA)對(duì)蚜蟲(chóng)、葉蟬、稻褐飛虱等同翅目吸食陛害蟲(chóng)有極強(qiáng)的毒性，另外由于GNA具有高度特異結(jié)合甘露糖寡聚體,使其在分析，純化糖蛋白方面成為有前途的工具，目前已成功應(yīng)用于純化鼠,清中免疫球蛋白一M的單克隆抗體；豌豆外源凝集素(peaLectin)能抑制豇豆象的生長(zhǎng)，并且已分離應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯等作物中，抗蟲(chóng)效果比較明顯。 當(dāng)昆蟲(chóng)進(jìn)食GNA后，GNA在昆蟲(chóng)的消化道中與

12、腸道膜上相應(yīng)的糖蛋白專一性的結(jié)合，降低膜的透性，從而影響營(yíng)養(yǎng)的吸收；GNA還能越過(guò)上皮的阻礙，進(jìn)入昆蟲(chóng)循環(huán)系統(tǒng)，造成對(duì)整個(gè)昆蟲(chóng)的毒性；同時(shí)GNA還可以在昆蟲(chóng)消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，促進(jìn)消化道細(xì)菌繁殖，達(dá)到抗蟲(chóng)的目的。GNA對(duì)幼蟲(chóng)的存活率、體重、拒食率、化蛹、羽化率及生殖都有很大的影響9 。 2.3蛋白酶抑制劑基因 2.3.1概述 蛋白酶抑制劑(Proteinase Inhibitor，PI)是自然界最豐富的蛋白種類之一，存在于所有的生命體中，與前述蘇云金桿菌相比，更具有抗蟲(chóng)譜廣、對(duì)人畜無(wú)剮作用及昆蟲(chóng)不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點(diǎn)(Gatehouse，1988),對(duì)維持生物體的正常代謝和預(yù)防外來(lái)蛋白水解酶對(duì)機(jī)體

13、的破壞起著重要作用。其一般為60一l20個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量約為825kD。20世紀(jì)70年代，人們?cè)谘芯恐参锏鞍酌敢种苿r(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)馬鈴薯、兩紅柿等作物在受到昆蟲(chóng)噬食或機(jī)械損傷f1寸，局部蛋白酶抑制劑含量驟增，從而推測(cè)可能是植物抵抗害蟲(chóng)的一種天然防御系統(tǒng)。在植物界，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了包括絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑等近l0個(gè)蛋白酶抑制劑家族。其中絲氨酸蛋白酶抑制劑在植物抗蟲(chóng)基因工程中有更大的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)槎鄶?shù)昆蟲(chóng)所利用的蛋白消化酶正是絲氨酸類蛋白消化酶，尤其是類胰蛋白酶，而絲氨酸蛋白酶抑制劑又可分為BowmanBirk、Kunitz、PII和PIII家

14、族等不同的類型11410其中又以BowmanBirk家族的豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpT I)研究得較為深人且應(yīng)用廣泛。 2.3.2機(jī)理及應(yīng)用 1987年英國(guó)的Hilder等把編碼CpT I的eDNA導(dǎo)人煙草獲得轉(zhuǎn)CpT I基岡的抗蟲(chóng)植株。研究表明，該轉(zhuǎn)基因煙草能抗煙草夜蛾、玉米穗蛾、棉鈴蟲(chóng)和粘蟲(chóng)等，且發(fā)現(xiàn)其CpT I的表達(dá)量與抗蟲(chóng)性里正相關(guān)。此后，世界上的一些實(shí)驗(yàn)室和公司相繼把cpT l基岡轉(zhuǎn)入水稻、油菜、白薯、蘋(píng)果和楊樹(shù)等具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物中。墨西哥大學(xué)、美國(guó)的Mon santo公司也把該基因轉(zhuǎn)入棉花用于防治棉鈴蟲(chóng)、棉象鼻蟲(chóng)和螟蛉蟲(chóng)。中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)中心也正在將人工合成的毒素基因與改造的

15、CpT I基因經(jīng)重組構(gòu)成雙價(jià)抗蟲(chóng)基因?qū)嗣藁ǖ茸魑?。此外，將馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因?qū)藷煵莺退?，還獲得了表達(dá)水稻巰基蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)基因煙草工程植株。植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中PI的合成具有階段特異性(stage-specific)，即P1只在某一階段合成，隨后將被降解10 。其機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。植物對(duì)PI具有損傷誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制11 ，許多植物受到昆蟲(chóng)侵害后局部組織或整個(gè)植株的PI含量會(huì)急劇增加，從而抑制昆蟲(chóng)的攝食。PI的誘導(dǎo)合成是植物對(duì)外界損傷的種反應(yīng)12 ，誘導(dǎo)的PI可以更有效抑制昆蟲(chóng)腸道中蛋白酶的活性13 。馬鈴薯蛋白酶抑制劑一II(Dotato inhibitor II，PTII)基因具

16、有損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子14，如果使用這類啟動(dòng)子調(diào)控其它外源抗蟲(chóng)基因在植物中的表達(dá)，將具有特殊的意義。三、結(jié)論與展望 3.1結(jié)論 目前，雖然有各種各樣的抗蟲(chóng)基因和基因表達(dá)載體相繼問(wèn)世，但是由于基因轉(zhuǎn)移方法上的原因，有些抗蟲(chóng)基因無(wú)法轉(zhuǎn)移給植物或者轉(zhuǎn)化頻率很低。要從事抗蟲(chóng)基因的轉(zhuǎn)移，一方面要了解抗蟲(chóng)基因的來(lái)源、作用，另一方面要掌握遺傳轉(zhuǎn)化的理論、方法。其中如何提高轉(zhuǎn)化過(guò)程中植株再生頻率也是問(wèn)題的關(guān)鍵之一。由于在室內(nèi)和田問(wèn)都已發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)對(duì)Bt。產(chǎn)生了抗藥性，因此如何防止抗性擴(kuò)散是轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因遺傳工程所面臨的一大問(wèn)題人們已采取了一些降低選擇壓力的方法來(lái)克服這個(gè)問(wèn)題，如將轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株混種、使Bt基因的

17、表達(dá)局限在特定器官、開(kāi)辟隔離帶、使用化學(xué)調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子等。 已有報(bào)道，將不同的抗蟲(chóng)基因豇豆胰蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草，具有加性抗蟲(chóng)作用。由于植物的害蟲(chóng)是多種多樣的，如何提高轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲(chóng)廣譜性，也是需要進(jìn)一步研究的課題。除了使植物獲取得抗蟲(chóng)性外，也可以對(duì)昆蟲(chóng)進(jìn)行改造可將顯性的雌性不育基因轉(zhuǎn)入昆蟲(chóng)胚胎的基因組中，以育成不育昆蟲(chóng)?？傊?，基因工程并非解決一切問(wèn)題的萬(wàn)全之策，只有將傳統(tǒng)的抗蟲(chóng)育種、遺傳工程及田間綜合防治相互結(jié)合起來(lái)，才能更好地控制害蟲(chóng)發(fā)生，更好地改良植物。 3.2展望植物抗蟲(chóng)基因工程在短短十幾年中已取得了豐碩成果，抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、馬鈴薯的商業(yè)化推廣證明了這項(xiàng)技術(shù)的

18、實(shí)用性。在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)，抗蟲(chóng)基因在植物整個(gè)生活周期中都存在并行使其抗蟲(chóng)功能，克服了使用農(nóng)藥控制蟲(chóng)害的時(shí)效性和易被沖刷、流失、分解等缺點(diǎn)，又防止了化學(xué)農(nóng)藥在食物中的殘留危害人體健康和對(duì)環(huán)境造成的污染等問(wèn)題。多種抗蟲(chóng)基因的同時(shí)開(kāi)發(fā)及其互補(bǔ)和協(xié)同作用。對(duì)于控制昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，提高抗蟲(chóng)植物的抗蟲(chóng)能力及抗蟲(chóng)范圍前景是樂(lè)觀的。另外，我們必須認(rèn)識(shí)到?；蚬こ滩⒎鞘墙鉀Q一切問(wèn)題的萬(wàn)全之策。通過(guò)植物基因工程得到的只是一種人工種質(zhì)新材料。而不是生產(chǎn)上可以立即應(yīng)用的新品種，它必須經(jīng)過(guò)常規(guī)育種考驗(yàn)。只有將傳統(tǒng)的抗蟲(chóng)育種、遺傳工程及田間綜合防治相互結(jié)合起來(lái)，才能更好地控制害蟲(chóng)發(fā)生，更好地改良植物。因此，植物基因工程技術(shù)

19、必須與常規(guī)育種相結(jié)合，并經(jīng)大田試驗(yàn)將轉(zhuǎn)基因植物的外源目的基固持續(xù)遺傳給后代或通過(guò)有性繁殖轉(zhuǎn)移到其他品種上去。可以相信，隨著研究的不斷深入，目前抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因工程中存在的各種問(wèn)題必將得到解決，在不久的將來(lái)會(huì)有更多的抗蟲(chóng)作物新品種從實(shí)驗(yàn)室走向大田?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Gathehouse AMR，Hilder VA，BoulterDPlant Genetic M anipulation for Crop ProtectionDBCAB internitonal，1992，1551812 謝先芝抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的研究進(jìn)展及前景J生物工程進(jìn)展1999，19(6)：47513 崔洪志，郭三堆Bt毒蛋白抗蟲(chóng)植物基因

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