生物工程畢業(yè)論文

1、 本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）手冊(2011屆) 題 目： 微波輔助提取金銀花總黃 酮工藝條件的研究 學(xué) 院： 生物工程 專 業(yè)： 生物工程 學(xué) 號： 20071230129 姓 名： 白玉龍 指導(dǎo)老師： 葛立軍 職稱： 講 師 合作老師： / 職稱： / 成 績： 浙江中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處制學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明茲呈交的學(xué)位論文，是本人在指導(dǎo)老師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考的其他個(gè)人或集體的研究成果，均在文中以明確方式標(biāo)明。本人依法享有和承擔(dān)由此論文而產(chǎn)生的權(quán)利和責(zé)任。聲明人（簽名）： 年 月 日手冊目錄（一）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))正文3（二）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))任務(wù)書21（三）本科畢業(yè)論文

2、(設(shè)計(jì))開題報(bào)告23（四）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))文獻(xiàn)綜述30（五）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))外文翻譯36（六）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))指導(dǎo)記錄62（七）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))中期檢查表64（八）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))答辯資格審查表65（九）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))答辯記錄66（十）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))成績評定書67（十一）本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))作品(實(shí)物)驗(yàn)收表68本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）微波輔助提取金銀花總黃酮工藝條件的研究 姓 名： 白玉龍 指導(dǎo)老師： 葛立軍 合作老師： / 專 業(yè)： 生物工程 提交日期： 年 月 日目 錄中文摘要5外文摘要6引言71實(shí)驗(yàn)材料及儀器71.1材料71.2試劑81.3儀器82工藝流程

3、83實(shí)驗(yàn)方法93.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備93.2金銀花總黃酮傳統(tǒng)提法93.3微波輔助提取單因素實(shí)驗(yàn)方法93.4微波輔助提取正交試驗(yàn)方法93.5黃酮含量測定方法94結(jié)果104.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制104.2 微波輔助提取金銀花總黃酮工藝條件的研究（單因素實(shí)驗(yàn)）104.2.1微波功率對金銀花總黃酮提取影響104.2.2微波時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響114.2.3固液比對金銀花總黃酮提取的影響124.2.4 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響 134.3微波輔助提取金銀花總黃酮工藝條件研究（正交實(shí)驗(yàn)）13 4.4 微波輔助提取與傳統(tǒng)乙醇回流法比較155討論176結(jié)論17參考文獻(xiàn)18致謝20微波輔助提取金銀花總黃

4、酮工藝條件的研究白玉龍指導(dǎo)老師：葛立軍 （浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物工程學(xué)院，杭州，浙江 310053）摘 要：目的本實(shí)驗(yàn)采用微輔助提取，分別通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)考察金銀花總黃酮的最佳工藝條件，為金銀花總黃酮藥理藥效研究提供材料，同時(shí)為其進(jìn)一步開放奠定基礎(chǔ)。方法 以蘆丁為對照品，用紫外-可見分光光度法建立蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法考察液固比、乙醇濃度、提取時(shí)間等因素對微波提取工藝參數(shù)做初步研究。結(jié)果（1）單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果：金銀花總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度70%，固液比為1:25，微波時(shí)間12min, 微波功率406W。（2）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果：固液比（B

5、）、乙醇濃度%（A）和微波功率W（C）對指標(biāo)影響顯著。根據(jù)以上分析，可定出影響指標(biāo)的因素顯著性主次順序?yàn)椋篈CBD?？傸S酮的優(yōu)選浸提條件（各因子優(yōu)水平組合）為最佳提取功率為406W，最佳提取時(shí)間為12min，最佳固液比1:25，最佳乙醇濃度為70%。（3）以總黃酮得率為指標(biāo)，微波輔助提取優(yōu)于傳統(tǒng)回流提取法。 結(jié)論 該方法提高了黃酮的提取率，減少了有機(jī)溶劑用量，縮短了提取時(shí)間。 關(guān)鍵詞：金銀花；總黃酮；微波輔助提??；正交試驗(yàn)法； 乙醇回流 Microwave-assisted extraction process of flavonoids in honeysuckle ConditionsBa

6、i YulongDirector：Gelijun（Bioengineering College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, China, 310053）Abstract: Objective The purpose of micro-assisted extraction process of total flavonoids in honeysuckle conditions of a preliminary study and with the traditional craft make that nol compare

7、d to optimize the extraction of total flavonoids in honeysuckle conditions. Method Use rutin as reference substance, by ultraviolet-visible spectro photometry rutin standard curves set up; in the single factor test, based on the total flavonoid content as an index, using orthogonal test approachto l

8、iquid-solid ratio, ethanol concentration , extraction time on the microwave extraction process parameters to do a preliminary study. Conclusion The experimental results show that: The yield of total flavonoids as an index, microwave-assisted extraction is superior to the traditional reflux extractio

9、n method, total flavonoids in honeysuckle the best extraction process for the 70% ethanol concentration, solid-liquid ratio of 1:25, microwave time to 12min, microwave power 406W.Key words: honeysuckle ; total flavonoids; microwave-assisted extraction; orthogonal test method; ethanol return引 言微波輔助萃取

10、1-2 ( microwave assisted extraction) MAE又稱微波輔助提取，是指使用適合的溶劑在微波 反應(yīng)器中從天然藥用植物、礦物或動(dòng)物組織中提取各種化學(xué)成分的技術(shù)和方法。MAE是在分析化學(xué)中派生出來的新型萃取技術(shù)，和傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾、索氏抽提等技術(shù)比較，微波提取技術(shù)可以縮短萃取時(shí)間、降低能耗、減少溶劑用量、提高收率和純度、降低生產(chǎn)成本，不僅具有很高的經(jīng)濟(jì)效益， 而且有望改變中草藥傳統(tǒng)的服用方式。微波提取由于其快速高效分離及選擇性加熱的優(yōu)勢， 在天然產(chǎn)物2有效成分的提取方面受到重視，目前 ，利用微波技術(shù)提取中藥和天然產(chǎn)物生物活性成分，已涉及黃酮類、苷類、多糖、萜類、揮發(fā)油

11、、生物堿、鞣質(zhì)、甾體及有機(jī)酸等。陳斌3等利用微波萃取葛根異黃酮的工藝，采用77乙醇，固液比為 1:1 4 ，且在體系溫度低60的前提下，微波間隙處理3次，葛根總黃酮的浸出率達(dá)96以上。與傳統(tǒng)的熱浸提相比，不僅產(chǎn)率高，而且速度快，節(jié)能。戴玉錦等通過單因素的特點(diǎn)，大大節(jié)省了能源。 王白軍4等對白芥子中總黃酮的微波提取與含量測定，運(yùn)用微波技術(shù)提取白芥子總黃酮，采用 MCL-3型連續(xù)微波反應(yīng)器中，用80乙醇，功率400W，反應(yīng)時(shí)間20min，提盡黃酮，比色法測定7總黃酮含量，結(jié)果測得白芥子中總黃酮含量為 1.85，平均加樣回收率素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對柚皮中黃酮類化合物提取工藝進(jìn)行了研究。用微波法從柚皮中提

12、取黃酮的最佳工藝條件為，乙醇濃度80、浸提時(shí)間為5 min 、料液比 1:25此時(shí)黃酮得率為0. 84mg/g。與傳統(tǒng)水浴法的對比試98.96，相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為2.11( r=6) 8。首次運(yùn)用微波技術(shù)從白芥子中提取總黃酮，提取速度快，提高了效率，比常規(guī)法提取的含量高，其結(jié)果令人滿意。 本實(shí)驗(yàn)采用單因素分組實(shí)驗(yàn)方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合實(shí)際情況分別對微波輔助提取法和傳統(tǒng)乙醇回流提取法提取金銀花總黃酮的最佳工藝進(jìn)行探究。1. 材料與方法 1.1 材料金銀花(浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠提供)60烘箱內(nèi)烘干，打粉備用。1.2 試劑蘆丁對照品（批號：10080-2003016，含量91.7

13、%）購于中國藥品生物制品檢定所；所用試劑亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、回收乙醇、95%乙醇皆為分析純；所用水為去離子水。1.3 儀器 粉碎機(jī) （DFT-100克 上海新諾儀器廠）微波爐 （WP700型 格蘭仕微波爐有限公司）；電子天平 （AG135型 上海精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋 （018268型 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （RE-52 AAA型 上海嘉鵬科技有限公司）；循環(huán)水式真空泵 （SHB-A 河南省太康科教器材廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （DGG-9140A型 上海森信實(shí)驗(yàn)有限公司）；紫外722型可見分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）；自動(dòng)平衡離心機(jī) （TDZ5-W

14、S型 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。2. 工藝流程如圖2-1所示：粉碎、烘干 浸提、微波處理蒸發(fā)濃縮干燥、溶解定容金銀花粉末濾液濃縮液總黃酮粗品含量計(jì)算0.10.090.07 2-1 微波輔助提取金銀花總黃酮工藝流程圖3. 實(shí)驗(yàn)方法3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備  3.1.1最大吸收波長的選擇方法 以亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉為顯色劑，分別作各樣品提取液以及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸收曲線，在510nm處均有1個(gè)強(qiáng)吸收峰，因此選擇510nm為測定波長。3.1.2對照品溶液的制備方法   精密稱取蘆丁對照品10.2mg置50mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻備用。3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲

15、線的制備  精密量取對照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分別置10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；最后加入4%氫氧化鈉試液4mL，加甲醇定容至刻度，搖勻，放置15min。采用分光光度法，在510nm處測定吸光度，以對照品量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.2 微波提取單因素實(shí)驗(yàn)方法分別考察不同的微波輻射功率,輻射時(shí)間,乙醇濃度,固液比對提取效果的影響3.3 提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法 系統(tǒng)考察微波提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)已有的資料及實(shí)際情況，選用微波輻射功率（A），輻射時(shí)

16、間（B），乙醇濃度（C），固液比（D）作為考察因素，以測得的浸提取樣品中總黃酮含量為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表設(shè)計(jì)，得到供試液。3.4微波輔助提取法與乙醇回流法比較比較兩種提取方法的處理時(shí)間和液固比對總黃酮提取量的影響。傳統(tǒng)乙醇回流法提取總黃酮的所需時(shí)間比微波輔助提取法提取長得多，且金銀花總黃酮提取量比較低;而微波輔助提取的總黃酮較乙醇回流法高。比較此兩種方法在最佳條件下的總黃酮含量。3.5總黃酮含量測定方法 取0.5mL液，加入5%亞硝酸溶液0.3mL蕩搖勻，放置6min加入10%硝酸鋁0.3mL蕩搖勻，放置6min入4%氫氧化鈉試液4mL，30%（V/V）乙醇定容至刻度，搖勻，放置1

17、5min分光光度法，在510nm定吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得總黃酮含量。4. 結(jié)果4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制表4-1 標(biāo)準(zhǔn)曲線表編號012345蘆丁濃度（mg/mL）00.020.030.050.070.09吸光度（OD）00.2060.3810.5480.7380.911圖4-1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為：Y=10.328x+0.0147，R2=0.9900，表明在一定范圍內(nèi)線形關(guān)系良好。4.2 微波提取金銀花總黃酮單因素實(shí)驗(yàn)方法4.2.1 微波功率對金銀花總黃酮提取的影響準(zhǔn)確稱取5g金銀花粉末，加入70%的乙醇溶液，設(shè)定微波功率為126W-700W

18、，微波輔助提取全程時(shí)間為10min，將提取液離心，取上清液，將過濾渣乙醇回流2h后合并提取液，檢測總黃酮含量， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4-2和表4-2。表4-2 微波功率對金銀花總黃酮提取的影響微波功率（W）126252406567700總黃酮得率（%）1.341.862.052.432.10圖4-2 微波功率對金銀花總黃酮提取的影響由圖4-2可知，微波功率設(shè)在300W800W之間，隨著微波功率的增大，微波對細(xì)胞壁的破碎作用增強(qiáng)，胞內(nèi)總黃酮溶出速率增大，得率逐漸增高。 微波處理時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響準(zhǔn)確稱取5g金銀花粉末，加入適量70%的乙醇溶液，設(shè)定微波功率為406W，微波輔助提取時(shí)間分別設(shè)定為

19、4min，6min，8min，10min，12min，14min將提取液離心，取上清液，將過濾渣乙醇回流2h后合并提取液，檢測總黃酮含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4-2和表4-2。表4-3 微波處理時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響微波時(shí)間（min）4681012總黃酮得率（%）1.261.541.762.482.36 圖4-3 微波處理時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響由圖4-3可見，微波時(shí)間在10min內(nèi)，黃酮含量隨著超聲時(shí)間的延長而增加，10min時(shí)達(dá)到最大值。 固液比對金銀花總黃酮提取的影響準(zhǔn)確稱取5g金銀花粉末，液固比分別設(shè)定為20，30，40，50，60將提取液離心，取上清液，將過濾渣乙醇回流2h后合并提

20、取液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4-4表4-4。表4-4 固液比對金銀花總黃酮提取的影響固液比（mL/g）2030405060總黃酮得率（%）1.582.162.201.981.76圖4-4 固液比對金銀花總黃酮提取的影響由圖4-4可知，在液固比為1:30的時(shí)候有一個(gè)峰值，液固比在20到30時(shí)候隨液固比的升高，含量增加，1:40到1:60的時(shí)候，隨液固比的增加，含量減少。液固比在1:30的時(shí)候總黃酮含量最高，達(dá)到2.20%。4.2.4 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響準(zhǔn)確稱取5g金銀花粉末，加入適量70%的，設(shè)定微波功率為406W，微波輔助提取液固比設(shè)定為30,分別設(shè)定乙醇溶液溶度為50%，60%，70%，

21、80%，90%將提取液離心，取上清液，將過濾渣乙醇回流2小時(shí)后合并提取液，檢測總黃酮含量, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4.2.4表4.2.4.表4-5 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響乙醇濃度（%）5060708090總黃酮得率（%）0.911.542.382.101.86圖4-5 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響從上圖可見，金銀花總黃酮最佳提取乙醇濃度為70%，而在乙醇濃度過高或過低時(shí)得率較小。可能的原因是：乙醇濃度過低，提取液中雜質(zhì)含量較多，可能是蛋白質(zhì)、過濾、濃縮、和分離均較困難;而隨著乙醇濃度的提高，脂溶性的物質(zhì)溶出增多，給提純帶來較大的麻煩。所以，選擇70%乙醇作為微波輔助提取溶劑。4.3 微波輔

22、助提取金銀花總黃酮正交實(shí)驗(yàn)方法 為系統(tǒng)考察微波提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，分別選擇乙醇濃度%（A）、固液比（B）、微波功率W（C）和微波時(shí)間min（D）作為考察因素，以測得的浸提取樣品中總黃酮含量為考察指標(biāo)，選用擇 L9（34）正交表設(shè)計(jì)得到供試液正交設(shè)計(jì)表見4-6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4-7。 表4-6 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表實(shí)驗(yàn)號乙醇濃度%（A）固液比（B）微波功率W（C）微波時(shí)間min（D）1501:2525282701:30406103901:3570012表4-7 微波輔助提取金銀花總黃酮的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表因素乙醇濃度（%）固液比（g/mL）微波功率（w）微波時(shí)間（min） 黃酮

23、得率（%）試驗(yàn)號123456789M1M2M3m1m2m3RA5050507070709090908.607.865.392.872.621.801.07B1:251:301:351:251:301:351:251:301:356.876.556.432.292.182.140.15C252406700406700252700 252406 6.027.076.762.012.362.250.25D8101212810101286.576.656.622.192.2172.2070.0272.072.342.192.862.632.371.941.581.87為進(jìn)一步確定各因素對金銀花總黃酮得

24、率的影響程度，對表4-7中的各因素進(jìn)行方差分析和顯著性檢查，見表4-8。表4-8 方差分析表方差來源離差平方和自由度均方F值顯著性ABCD1.7140.1383.9445.88422220.2940.0690.8571.97228.524.2536.5640.21 * * *由上表可知：微波時(shí)間min（D）對提取率的影響很小，作為誤差項(xiàng)。顯著性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)因素：固液比（B）、乙醇濃度%（A）和微波功率W（C）對指標(biāo)影響顯著。根據(jù)以上分析，可定出影響指標(biāo)的因素顯著性主次順序?yàn)椋篈CBD?？傸S酮的優(yōu)選浸提條件（各因子優(yōu)水平組合）為最佳提取功率為406W，最佳提取時(shí)間為12min，最佳固液比1:25，

25、最佳乙醇濃度為70%。該工藝條件下金銀花總黃酮粗品得率可以達(dá)到2.86%。4.4 乙醇回流法提取總黃酮4.4.1 乙醇回流時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響準(zhǔn)確稱取發(fā)酵液150mL，用水提法浸提1，2，3，4，5h后，測定總黃酮的含量，結(jié)果見圖4-6表4-9。表4-9 乙醇回流法處理時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響處理時(shí)間（h）123456總黃酮得率（%）0.560.700.810.871.211.05圖4-6 乙醇回流時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響圖4-6 回流時(shí)間對金銀花總黃酮提取的影響由圖4-6知，用乙醇回流法提取金銀花總黃酮，隨時(shí)間的變長，總黃酮的提取量也在增加，提取5h時(shí)，總黃酮含量最高。4.4

26、.2 回流固液比對金銀花總黃酮提取的影響用傳統(tǒng)乙醇回流法提取金銀花總黃酮，在其他條件不變的情況下，改變回流液固比，測得的金銀花總黃酮含量見表4-10和圖4-7。表4-10 回流液固比金銀花總黃酮提取的影響 液固比（mL/g）2030405060總黃酮得率（%）0.510.620.700.860.75圖4-7 回流固液比對金銀花總黃酮提取的影響由圖4-7知，乙醇回流法提取金銀花總黃酮的時(shí)候，總黃酮的含量隨著固液比的升高而升高，液固比在50到最高得率為0.86%。當(dāng)液固比超過50的時(shí)候，金銀花總黃酮的含量隨固液比的增加而減少。所以乙醇回流法提取金銀花總黃酮的最佳液固比是50:1。由圖4-3和圖4-

27、6明顯可看出兩種提取方法總黃酮提取量隨時(shí)間的延長而提高，但傳統(tǒng)乙醇回流法提取總黃酮的所需時(shí)間比微波輔助提取法提取長得多，且金銀花總黃酮提取量比較低，而微波輔助提取的總黃酮較乙醇回流法高。由圖4-4和4-7知，在相同液固比下，微波輔助提取的總黃酮較乙醇回流法高。微波輔助與傳統(tǒng)提法最佳工藝對比比較此兩種方法在最佳條件下的總黃酮得率，結(jié)果見表4-11。表4-11 微波輔助與傳統(tǒng)提法最佳工藝對比表提取方法時(shí)間固液比功率乙醇濃度總黃酮得率微波輔助提取法10min1:25406W70%2.86%乙醇回流法5h1:5070%1.54%從表可知，在兩種方法的最佳工藝條件下，微波輔助提取法提取得到的總黃酮明顯要

28、高于傳統(tǒng)乙醇回流法，且浸提劑用量少，提取時(shí)間縮短,提取量增加，提取過程無需高溫，避免了因高溫對總黃酮分子結(jié)構(gòu)的破壞，被浸提的生物活性物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)保持不變，是黃酮化合物工業(yè)生產(chǎn)較理想的一種提取新工藝。微波輔助提取金銀花黃酮類化合物提取率能達(dá)到2.86%，要高于乙醇回流法提取的1.54%。微波輔助提取時(shí)間僅為10min，比乙醇回流法提取的5h要遠(yuǎn)遠(yuǎn)的縮短了。5. 討論5.1 微波萃取法的原理是微波直接與被分離物作用，微波的激活作用導(dǎo)致樣品基體內(nèi)不同成分的反應(yīng)差異使被萃取物與基體快速分離，通過偶極子旋轉(zhuǎn)和離子傳導(dǎo)兩種方式同時(shí)加熱，加劇了體系中分子的碰撞頻率，使黃酮分子容易從藥材內(nèi)部擴(kuò)散到溶劑中，大

29、大縮短加熱的時(shí)間，并達(dá)到較高產(chǎn)率 。5.2 傳統(tǒng)的工藝需要以熱傳導(dǎo)、熱輻射等方式進(jìn)行，溫度上升緩慢，提取時(shí)間長。本實(shí)驗(yàn)中，用傳統(tǒng)醇回流法需要大于4 h的提取過程，而微波萃取法只需30 min即可完成，提取率較傳統(tǒng)醇提取法高，節(jié)時(shí)，節(jié)能，其優(yōu)越性顯而易見。6. 小結(jié)6.1正交實(shí)驗(yàn)工藝分析 本實(shí)驗(yàn)采用單因素分組實(shí)驗(yàn)方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合實(shí)際情況分別確定了微波輔助提取法和傳統(tǒng)乙醇回流提取法提取金銀花總黃酮的最佳工藝。其中傳統(tǒng)乙醇回流提取法的最佳工藝條件為液固比50:1，提取時(shí)間5h；金銀花總黃酮微波輔助提取工藝，最佳提取功率為406W，最佳提取時(shí)間為12min，最佳液固比25:1，最

30、佳乙醇濃度為70%。該工藝條件下金銀花總黃酮粗品得率可以達(dá)到2.86%。6.2 本方法與其他方法比較微波輔助提取法與傳統(tǒng)水提法相比，提取時(shí)間縮短至二十四分之一，所得凈多糖產(chǎn)率也有一定的提高。這是由微波所具有的高頻特性、熱特性及生物效應(yīng)幾大特點(diǎn)所致,一方面，高頻微波促使樣品中偶極分子旋轉(zhuǎn)而導(dǎo)致弱氫鍵破裂及離子遷移，加速了多糖對樣品的滲透，并使多糖很快溶解;另一方面，微波是一種高頻波，它使提取體系中偶極分子因高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生高頻率摩擦，從而可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生極大的熱量，使整個(gè)樣品同時(shí)被加熱，從而大大加快了多糖的溶解;第三方面，微波具有生物效應(yīng)，微波會(huì)引起樣品細(xì)胞膜破裂，加速了黃酮從細(xì)胞中釋放出來。從兩種

31、方法的對比中可以明顯看出，微波輔助提取較傳統(tǒng)乙醇回流提取法提取量高，且溶劑用量少，縮短了提取時(shí)間，提取成本低。6.3 展望在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法考察固液比、乙醇濃度、提取時(shí)間等因素研究微波提取工藝參數(shù)，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。該方法提高了黃酮的提取率，減少了有機(jī)溶劑用量，縮短了提取時(shí)間 。本實(shí)驗(yàn)通過對微波提取金銀花總黃酮的工藝條件研究為藥理藥效研究提供材料。 參考文獻(xiàn)1 王艷，張鐵軍微波萃取技術(shù)在中藥有效成分提取中的應(yīng)用J中草藥，2005, 36(3):470-4732 張英，俞卓裕，吳曉琴中草藥和天然植物有效成分提取新技術(shù)微波協(xié)助萃取J中國中藥雜志

32、，2004, 29(2)：104-1063 陳斌，南慶賢，呂玲微波萃取葛根總黃酮的工藝研究J農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，200l, l7(6)：123-1254 戴玉錦，盧明，馮玲微波法從柚皮中提取黃酮類化合物的工藝研究J江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006, (1)：121-1235 張志信，張仕秀，宋關(guān)斌用微波一堿水法提取三七莖葉總黃酮的工藝研究J藥物生物技術(shù)，2005, 12(6)：389-3916 李伶，楊俊紅，徐志東用微波提取山楂中總黃酮的正交實(shí)驗(yàn)研究J中國藥學(xué)雜志，2005, 40(2)：l12-1147 林敏，吳冬青，范彥康等用微波對提取萬壽菊花中黃酮類化合物的影響J湖州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005, 27(2)

33、:108-1118 孔琪，吳春菊花黃酮的提取及抗氧化活性研究J中草藥，2004, 35(9):1001-10029 房方，張廣強(qiáng)，謝新年.用分光光度法進(jìn)行黃酮類化合物含量測定的研究J.河南中醫(yī)藥學(xué)刊,2002, 12(1):17-1910 丁利君，吳振輝，蔡創(chuàng)海，等金銀花中黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝的研究J食品科學(xué)，2002, 23(2)：62-6611 胡碧波，吳祖帥，蔡君，等金銀花中主要黃酮的測定及影響因素考察J中國中藥雜志，2006, 31(21)：117-11912 揚(yáng)俊，蔣惠娣，徐娟華金銀花總黃酮的提取工藝及其含量的動(dòng)態(tài)變化研究J中草藥2002, 33(11)：990-99313 張睿，

34、徐雅琴，時(shí)陽. 黃酮類化合物提取工藝研究J.食品與機(jī)械J，2003, (1)：21-2214 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編M.人民衛(wèi)生出版社J, 200015 涂瑤生，畢曉黎.微波提取技術(shù)在中藥及天然藥物提取中的應(yīng)用及展望J.世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005, 7(3)：65-6916 張秀明，茯苓藥理作用研究概況J中藥材，2001, 24(6)：445-44917Wang H K,Xia ,Yang ZY,et a1.Recent advances in the discovery and development of flavonoids and their an a-1ogue

35、s Jas antitum Oland anti-HIV agents,Adv ExpMed Biol,1998,439:191-225.致 謝首先要感謝指導(dǎo)老師葛立軍在實(shí)驗(yàn)期間給予的無限支持和悉心關(guān)懷，在畢業(yè)設(shè)計(jì)的每一環(huán)節(jié)，都離不開他的指點(diǎn)和幫助，使得本次實(shí)驗(yàn)較為成功，獲得寶貴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)成果，并使我積累了一定的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中，葛立軍老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、實(shí)事求是的工作作風(fēng)、平易近人的待人風(fēng)格、耐心細(xì)致的指導(dǎo)和幫助都給我留下了深刻的印象，是我在今后工作生活中學(xué)習(xí)榜樣。在此謹(jǐn)向葛老師致以崇高的敬意和誠摯的感謝！值此畢業(yè)論文完成之際，謹(jǐn)向各位老師和同學(xué)表示由衷的謝意，沒有你們一直以來

36、的支持，就沒有我今天的成長，明天的成功。本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))任務(wù)書學(xué) 院生物工程專 業(yè)生物工程姓 名白玉龍學(xué) 號20071230129指導(dǎo)老師葛立軍職 稱講 師合作老師/職 稱/題 目微波輔助提取金銀花總黃酮工藝條件的研究一、課題的內(nèi)容和任務(wù)要求1.1研究的內(nèi)容1.1設(shè)計(jì)微波提取金銀花總黃酮的最佳工藝條件，制備供試液。1.2最大吸收波長的選擇方法研究。1.3配置標(biāo)準(zhǔn)蘆丁作對照品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線方法的研究。1.4用紫外分光光度法測定粗總黃酮的含量。1.5微波輔助提取法與傳統(tǒng)乙醇回流法進(jìn)行效果比較。1.2任務(wù)要求本文擬采用微波輔助提取法來探討金銀花總黃酮的提取最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)分別從微波時(shí)間、微波功率

37、、乙醇濃度、固液比等因素考察超聲波法對金銀花總黃酮提取的影響，獲得最佳微波提取條件，并與傳統(tǒng)乙醇回流法進(jìn)行比較。為微波技術(shù)應(yīng)用于金銀花總黃酮提取開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。二、進(jìn)度安排（起止時(shí)間： 2010年 10 月 9 日 2011 年 4 月22 日）2010年10月2010年11月 搜集資料，確立研究方向，學(xué)習(xí)基本操作2010年11月2010年12月 完成外文翻譯、撰寫綜述2010年12月2011年1月 完成開題報(bào)告，準(zhǔn)備試驗(yàn)用品2011年1月2011年3月 工藝條件的研究完成實(shí)驗(yàn)2011年3月2011年4月 撰寫畢業(yè)論文，準(zhǔn)備論文答辯2011年4月 完成畢業(yè)論文答辯及修改三、主要參考資料1 王

38、艷，張鐵軍微波萃取技術(shù)在中藥有效成分提取中的應(yīng)用J中草藥，2005，36(3)：470-4732 涂瑤生，畢曉黎.微波提取技術(shù)在中藥及天然藥物提取中的應(yīng)用及展望J.世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005，7(3)：65-693 江蘇新醫(yī)學(xué).中藥大辭典M.上海：上?？茖W(xué)出版社，19974 裴凌鵬，惠伯棣，金宗鐮，等.黃酮類化合物的生理活性及其制備技術(shù)研究進(jìn)展J.食品科學(xué)，2004，25(2)：203-2075 Kim Antioxi dantive flavonoids from the leaf of Morus AlbaJ.Arch Pham Res,1999,22(1):81.6 Kayo D

39、oi. Studies on the constituents of the leaf of Morus AlbaJ.Chem Pham Bull,2001,49(2):151.簽名欄：學(xué)生： 指導(dǎo)老師： 學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)： 注意：1任務(wù)書由指導(dǎo)老師填寫、院領(lǐng)導(dǎo)審核，學(xué)生、指導(dǎo)老師、院領(lǐng)導(dǎo)均應(yīng)簽字。2此任務(wù)書要求在畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）工作開始前下達(dá)。本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開題報(bào)告學(xué) 院生物工程專 業(yè)生物工程姓 名白玉龍學(xué) 號20071230129指導(dǎo)老師葛立軍職 稱講 師合作老師/職 稱/題 目微波輔助提取金銀花總黃酮工藝條件的研究題目性質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)開發(fā)工程設(shè)計(jì)應(yīng)用型調(diào)查型其他一、選題依據(jù)和目標(biāo)（該研究的

40、目的、意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢）1.1 研究目的及意義金銀花，為中藥材和植物的統(tǒng)稱。植物金銀花又名忍冬，為忍冬科多年生半常綠纏繞木質(zhì)藤本植物。“金銀花”一名出自本草綱目，由于忍冬花初開為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。藥材金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花。金銀花自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥。它性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪。金銀花既能宣散風(fēng)熱，還善清解血毒，用于各種熱性病，如身熱、發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等證，均效果顯著。目前，已見微波輔助提取應(yīng)用于其他植物黃酮類化合物的提取，未見該法應(yīng)用于金銀花總黃酮的提取。本文擬利用乙醇溶液做溶劑對金銀

41、花進(jìn)行微波處理，目的在于優(yōu)化金銀花總黃酮提取的工藝條件。 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)方法考察液固比、乙醇濃度、提取時(shí)間等因素研究微波提取工藝參數(shù)，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢 金銀花黃酮作為藥用有獨(dú)特的藥理方式和良好的療效，且毒副作用很低，從而成為治療冠心病新藥開發(fā)和研究的熱點(diǎn)之一。 目前研究試驗(yàn)證明金銀花具有消炎、殺菌、降壓、 治療冠心病之效。金銀花又屬于2002年衛(wèi)生部公布的“既是 研究，食品又是藥品的物品”。而微波法具有穿透性強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高等特點(diǎn)，越來越多被用來提取中草藥中的有效成分，成為一種普遍的提取方法。從文獻(xiàn)

42、檢索情況來看，國內(nèi)外近5年對金銀花的研究主要集中在對有效成分的提取、含量測定、有效成分的藥理活性等方面。2003年，張睿、徐雅琴對提取黃酮類化合物的工藝進(jìn)行研究綜述，闡明了9種提取方法（水提法、堿性水或堿性烯醇提取法、有機(jī)溶劑提取法、微波法、超聲波法、酶解法、大孔樹脂吸附法、超濾法、超臨界萃取法）的優(yōu)缺點(diǎn)。2004年，李莉研究了金銀花黃酮類化合物的提取方法，選擇水或70%乙醇為溶劑，微波處理或非微波處理桑葉的各種方法提取桑葉總黃酮。研究結(jié)果表明，經(jīng)微波處理10min桑葉，以70%乙醇作溶劑提取桑葉總黃酮的浸出率最高。2006年張璐、劉強(qiáng)等，通過對茯苓多糖制備工藝及藥理作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，結(jié)果

43、為茯苓多糖的制備方法有發(fā)酵醇沉法、稀堿浸提法、水提醇沉法、微波輔助提取法；茯苓多糖具有抗腫瘤作用、免疫增強(qiáng)作用、保肝與催眠作用、抗衰老作用、抗單純皰疹病毒作用、抗炎作用、防石消石作用等。 2007年王宏磊、彭永宏等在對超聲波法提取劍花總皂苷工藝研究實(shí)驗(yàn)中，利用超聲波法，采用正交實(shí)驗(yàn)對劍花總皂苷提取工藝進(jìn)行研究。結(jié)果表明，提取劍花總皂苷的最優(yōu)條件為：粒度80目，最佳溶劑水，超聲時(shí)間40min，溶劑揮干溫度80，料液比l:2。2007年，鄧光輝、周桂等在超聲波法乙醇提取山楂葉黃酮的研究中，突破山楂葉中有效成分黃酮的提取主要使用的傳統(tǒng)乙醇提取法，在超聲波條件下，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了乙醇浸提山楂葉中

44、黃酮的提取工藝條件。綜上所述,微波輔助提取法已經(jīng)在較多植物黃酮的提取中得到應(yīng)用，且作用效果明顯。該方法提高了黃酮的提取率，減少了有機(jī)溶劑用量，縮短了提取時(shí)間 。本實(shí)驗(yàn)通過對微波提取金銀花總黃酮的工藝條件研究為藥理藥效研究提供材料，同時(shí)為其進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。目前，未見有微波輔助提取方法應(yīng)用于金銀花的提取。鑒于目前的狀況，其產(chǎn)業(yè)化道路仍較漫長。從長遠(yuǎn)來看，若能總結(jié)出最佳提取工藝，應(yīng)用于金銀花總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)，則有非常光明的產(chǎn)業(yè)化前景。二、課題關(guān)鍵問題及難點(diǎn)2.1 溶劑的選擇浸出液的溶劑選擇，必須是對有效成分溶解度大，對無效成分溶解度小(不溶解或雜質(zhì)沉淀)，不能與金銀花中黃酮的成份起化學(xué)變化而影啊

45、有效成分。而且擴(kuò)散性、滲透性強(qiáng)，價(jià)廉易得，安全無毒的溶劑。溶劑選擇不當(dāng)，不但給生產(chǎn)帶來了麻煩，還會(huì)嚴(yán)重影響提金銀花總黃酮的質(zhì)量和澄明度2.2 提取溫度在高溫度條件下，分子之間碰撞的次數(shù)加劇，有效成份被破壞，無效成分浸出量增加，這不僅增加了浸出物質(zhì)的雜質(zhì)，而且容易引起某些不耐熱成份和揮發(fā)性較強(qiáng)的成份分解、變質(zhì)或揮發(fā)掉。而溫度過低也會(huì)影響金銀花總黃酮的提取。因此，應(yīng)注意微波輻射的時(shí)間和功率的控制。2.3 活性炭脫色脫脂后的黃酮醇溶液濃縮至50mL左右加入0.02g/mL粉末活性炭于50保持30min，然后過濾。脫色可反復(fù)進(jìn)行，直至顏色符合要求或色值不能再降低?；钚蕴棵撋啽阋仔?，效果也好，但活性炭

46、脫色后，過濾相當(dāng)困難，并且活性炭作為脫色劑時(shí)，由于其對黃酮的吸附作用，會(huì)造成黃酮一定量的損失，對黃酮得率也會(huì)有較大影響，如何避免，是難點(diǎn)也關(guān)鍵問題。三、完成該課題研究已具備的條件（有關(guān)的研究工作基礎(chǔ)，儀器設(shè)備條件，經(jīng)費(fèi)情況）3.1 研究工作基礎(chǔ)在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段，查閱了大量相關(guān)金銀花總黃酮提取文獻(xiàn)，為實(shí)驗(yàn)開展提供理論基礎(chǔ)。本人具有一定的專業(yè)知識技能和相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。經(jīng)過指導(dǎo)老師葛老師的幫助，結(jié)合文獻(xiàn)資料中的有關(guān)資源，確立了研究方案，技術(shù)路線合理。3.2 主要儀器設(shè)備條件本實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)室具有實(shí)驗(yàn)過程所需要的所有試劑，儀器，設(shè)備這些為實(shí)驗(yàn)的開展提供了保障。3.3 經(jīng)費(fèi)情況本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作過程中，

47、在指導(dǎo)老師葛老師、學(xué)院老師和同學(xué)們的指導(dǎo)鼓勵(lì)和幫助下。實(shí)驗(yàn)一切經(jīng)費(fèi)預(yù)算合理，主要用于對金銀花、對照品及其所必須試劑的購買。準(zhǔn)備充分，保證實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。 四、研究方案（擬采取的研究方法或試驗(yàn)方法及主要技術(shù)路線）4.1實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備材料 供試材料：金銀花，60烘箱內(nèi)烘干，打粉備用。所用材料經(jīng)鑒定為菊科金銀花 試劑：蘆丁對照品（批號：10080-2003016，含量91.7%）購于中國藥品生物制品檢定所；所用試劑亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉95%、乙醇皆為分析純；所用水為去離子水。實(shí)驗(yàn)設(shè)備粉碎機(jī) （DFT-100克 上海新諾儀器廠）微波爐 （WP700型 格蘭仕微波爐有限公司）；電子天平 （AG13

48、5型 上海精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋 （018268型 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （RE-52 AAA型 上海嘉鵬科技有限公司）；循環(huán)水式真空泵 （SHB-A 河南省太康科教器材廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （DGG-9140A型 上海森信實(shí)驗(yàn)有限公司）；紫外722型可見分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）；自動(dòng)平衡離心機(jī) （TDZ5-W型 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。4.2 擬采取的研究方法或試驗(yàn)方法 4.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備  4.2.1.1最大吸收波長的選擇方法 以亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉為顯色劑，分別作各樣品提取液以及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸收曲線，在510nm處均

49、有1個(gè)強(qiáng)吸收峰，因此選擇510nm為測定波長。4.2.1.2對照品溶液的制備方法   精密稱取蘆丁對照品10.2mg置50mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻備用。4.2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備  精密量取對照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分別置10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；再加入10%硝酸鋁0.3mL，振蕩搖勻，放置6min；最后加入4%氫氧化鈉試液4mL，加甲醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。采用分光光度法，在510nm處測定吸光度，以對照品量（mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.2.2微波提取單因素實(shí)驗(yàn)方法分別考察不同的微波輻射功率,輻射時(shí)間,乙醇濃度,固液比對提取效果