毒死蜱的微生物降解研究進展

1、For personal use only in study and research; not for commercial use毒死婢當前仍是全球應用最廣泛的五種殺蟲劑之一，也是我國用量最大的農(nóng)藥品種，是對硫磷、甲胺磷等高毒有機磷農(nóng)藥的替代品種， 主要作為農(nóng)用殺蟲劑 防治水稻、蔬菜等作物的螟蟲、韭蛆等近百種害蟲，也作為衛(wèi)生殺蟲劑用于防治 白蟻和嶂螂等。美國在20世紀末期毒死婢年用量就已達到約 7000噸，其中3/4 以上被應用于植物保護，其余則用于家庭衛(wèi)生。毒死婢系列產(chǎn)品（樂斯本乳油） 于1984年在我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所取得登記，獲準在水稻、棉花、蔬菜等作物 上使用；同年，上海市政府在菜

2、籃子工程建設中， 推薦了樂斯本等幾種農(nóng)藥用于 防治蔬菜害蟲，以徹底取代甲胺磷等高毒農(nóng)藥。雖然毒死婢屬于中等毒性殺蟲劑，但危險性仍然很大，它能夠通過皮膚進入 人體，并且在人體內有累積現(xiàn)象，長期或重復給予亞毒性劑量即可對細胞、 神經(jīng) 軸突等產(chǎn)生影響，甚至可引起行為改變，WHO規(guī)定的毒死婢可接受攝取量為10g/kg/（6,7o隨著健康及環(huán)保標準的提升，在許多發(fā)達國家毒死婢已被禁止使 用，2000年6月8日美國環(huán)保署（EPA宣布，禁止在美國家庭和庭院內使用毒 死婢殺蟲劑，指出這種常用的殺蟲劑會危害到兒童的健康安全。依據(jù)美國環(huán)保署的意見，新西蘭政府決定含有毒死婢的產(chǎn)品自2005年12月31日將不再應用于

3、白蟻的防控，并號召取消毒死婢在所有有可能導致孩子暴露的地方使用，2011年10月28日，新西蘭環(huán)保署提議禁止毒死婢用于花園。 為了保證兒童健康，幾 乎所有的發(fā)達國家都已經(jīng)禁止毒死婢應用于家居, 但是并沒有完全禁止其在農(nóng)業(yè) 領域使用；在大多數(shù)發(fā)展中國家，毒死婢仍是應用最廣泛的農(nóng)用殺蟲劑、 由于經(jīng) 濟、技術發(fā)展的限制，短期內也不可能完全禁止毒死婢的應用， 那么如何減少應 用毒死婢所導致的負面影響就成為一個亟待解決的課題。1.2毒死婢的微生物降解研究進展微生物的降解作用被認為是環(huán)境中有機磷農(nóng)藥殘留降解的最主要因素，因此分離篩選能夠高效降解有機磷農(nóng)藥的微生物是解決農(nóng)藥污染， 進行環(huán)境修復的一 項有效措

4、施8,9。某些有機磷降解菌的降解作用具有廣譜性，能降解多種不同的 有機磷農(nóng)藥，這是由于有機磷農(nóng)藥具有相似的化學結構， 降解菌產(chǎn)生的相關酶類作用于有機磷農(nóng)藥的共有結構所致，而降解速度的快慢則可能與農(nóng)藥自身的化學 穩(wěn)定性、降解酶接觸農(nóng)藥靶標位點的難易程度、農(nóng)藥及降解產(chǎn)物對酶促反應的反 饋作用等多種因素有關10,11,有機磷農(nóng)藥初步水解路徑如圖1-2。篩選能降解多 種有機磷農(nóng)藥的微生物菌株對于農(nóng)藥的污染治理也是一項意義重大的工作，現(xiàn)在也已經(jīng)分離到了一些這樣的菌株12。例如，黃桿菌屬細菌Flavobacterium sp.ATCC 27551的水解酶能有效的水解幾乎所有已知的O-P鍵13;缺陷假單胞菌

5、Pseudomonas diminutatfc具有相同降解功能14;近年來也有一些具有類似降解功 能的菌株報道15,16。一般來說，微生物長期持續(xù)接觸某種農(nóng)藥就可能會誘導出降解該農(nóng)藥的能 力，所以經(jīng)常從被農(nóng)藥污染的土壤或施用過該農(nóng)藥的土壤中分離針對該農(nóng)藥的降 解菌；也可通過人工措施使微生物適應目標農(nóng)藥，以獲取高耐受能力和降解能力的微生物菌株。較早關于毒死婢降解菌的報道是Sethunathan N.等13于1973年從施用二嗪農(nóng)的土壤中篩選出的黃桿菌( Flavobacterium sp.)以及 Serdar C.M. 等14在1982年篩選出的缺陷假單胞菌(Pseudomonasdiminut

6、a),它們能以共代 謝的方式降解毒死婢，但是不能以毒死婢作為唯一碳源和能源生長。Mallick等17 在1999年報道一株從土壤中篩選出的節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)能在無機鹽培養(yǎng)基中降解毒死婢，能在 48 h內將10mg/L毒死婢完全降解。Ghanem等18和Li 等19分別分離到了 Klebsiella sp.和Sphingomonassp.,這兩個菌株能以毒死婢作 為唯一碳源和磷源。除細菌外，也分離到一些能降解毒死婢的真菌，Bending G.D. 等20 (2002年)篩選出2株能降解毒死婢的真菌Hypholoma fascicularae和Coriolus versic

7、oloro方華2007年從土壤中篩選到一株毒死婢降解菌，經(jīng)鑒定為 輪枝抱屬(Verticillium sp.)真菌。大量的研究表明，在土壤或水體中微生物降解毒死婢的主要中間產(chǎn)物是3,5,6-三氯-2-叱噬酚(3,5,6-trichloro-2-pyridinol,TCP),如圖 1-3 21,22。Racke等人 將毒死婢用14C標記后進行微生物降解實驗，其結果表明毒死婢經(jīng)土壤微生物作 用后的初步降解產(chǎn)物為3,5,6-三氯-2-叱噬酚(TCP), TCP能被進一步降解，終產(chǎn) 物為CO223,24。但TCP的進一步降解要緩慢得多，高濃度的TCP對毒死婢的生物降解還有抑制作用，另外，TCP較毒死婢

8、水溶性更大，更容易污染水體和土壤，從而放大毒死婢的危害23。毒死婢的初級降解產(chǎn)物除了 TCP外還有0,0-二乙基 硫代磷酸（鹽）（diethylthiophosphate, DETP）,它們均能被微生物完全代謝為無機 物，Singh等人推測毒死婢的微生物降解途徑如圖1-4,可能會產(chǎn)生約15種中間代謝物2 o毒死婢的微生物降解也與環(huán)境因素密切相關，影響到降解菌株生長繁殖的因素都可能會對毒死婢的微生物降解產(chǎn)生影響，例如 ：溫度、濕度、pH以及土著微 生物等生物因子。在最近報道的一些研究中都顯示毒死婢的最大降解率一般都發(fā) 生在中性或者堿性條件下，這可能是由于降解毒死婢的關鍵酶在中性或堿性條件 下有更

9、大的酶活性，另外，在堿性條件下毒死婢的穩(wěn)定性會受到影響，其水解率變得更高25。Singh等也報道了應用Enterobactor sp.降解毒死婢，在堿性pH時 實現(xiàn)了毒死婢的快速降解，但在酸性 pH時其速度則很慢26。目前，利用微生物降解毒死婢等農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為環(huán)境及生物技術領域的研 究熱點，在這方面的研究也已經(jīng)取得了大量成果，分離出了大量降解菌株，并分析研究了相關降解酶及降解基因，但目前所開展的研究工作大多還只是局限在實 驗室，進入實踐應用的并不多，這主要是由于存在以下問題：篩選獲得的農(nóng)藥 降解菌的降解效率普遍較低，而且菌株容易發(fā)生變異、退化而喪失降解能力，難 以滿足實際需求；降解菌株的應用

10、環(huán)境條件不確定， 環(huán)境因素波動較大，這在 很大程度上影響到降解菌能否生長繁殖并發(fā)揮降解作用；應用到環(huán)境中的農(nóng)藥 降解菌會與土著微生物發(fā)生相互作用，導致功效的不確定性；將降解菌株制作 成便于儲運和應用的制劑是其真正進入實踐應用的基礎，但目前與之相關的制劑化研究進展緩慢，存在制劑活性低、難于保存、生產(chǎn)成本高等問題。為了做好實 驗室研究與實踐應用之間的銜接，農(nóng)藥的微生物降解研究應該不僅僅局限在降解 菌的篩選、降解機理、降解動力學等，還應強化以下幾個方面：具有農(nóng)藥降解 功能的天然復合菌系的研究與應用；工程菌的構建（拓寬降解譜、提高降解能力），降解酶基因的改造（降解酶的高效表達）等；降解酶及其制劑的研究

11、與 開發(fā)；降解菌與降解酶制劑的聯(lián)合應用；多種降解菌的聯(lián)合應用。1.3 生防菌及其在防治作物病害中的研究與應用有些微生物對作物病蟲害具有抑制或殺滅作用，因此常被用于作物病蟲害的 防治，這些有益微生物亦被稱為生防菌。按照防治對象的不同，可分為防治作物病原菌的生防菌和防治作物害蟲的的生防菌。通常所說的生防菌大多都是用于防 治作物病原菌，其中以防治作物土傳病害最為普遍； 而防治作物害蟲的生防菌則 多是對害蟲有毒害或致病作用的微生物。 生防菌應用上的一項基本要求是不能對 所應用的作物對象有明顯負面作用。應用生防菌防治作物病蟲害的歷史最早是從防治土傳病害開始的，在20世紀早期就有人開始研究用微生物防治土傳

12、病害，例如，Hartley應用一些常見的腐生真菌和細菌來嘗試防治根腐病。在 20世紀30-50年代，技術人員開展了應 用放線菌及其代謝產(chǎn)物防治作物病害的大量研究；而在剛過去的 50年中，生防 菌的研究與應用取得了更快的發(fā)展，已有不少成熟的生防菌制劑被應用到農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)領域，可應用于作物病害防治的生防菌菌種也越來越多，甚至已經(jīng)構建了一些 生防工程菌。用作生防菌的菌種主要包括細菌和真菌兩個大類，另外也有一些病 毒和噬菌體被當作生防菌使用。近年來，由于人們的生態(tài)意識不斷增強，長期應用化學農(nóng)藥所導致的環(huán)境污 染、農(nóng)藥殘留和病原菌抗藥性等問題得到了更多關注，以生防菌為代表的生物防治方法成為了近期作物病害防

13、治研究的熱點之一。相關研究人員在生防菌篩選、 生防菌菌劑的制備與應用、以及生防菌控病原理等方面開展了廣泛的研究， 取得 了大量的成果，主要表現(xiàn)在兩個方面，一是生防菌菌種庫被不斷充實，生防菌制 劑也越來越多，二是對其防病機理的認識不斷深入。生防細菌與生防真菌當前，應用較多的生防細菌主要有假單胞菌屬(Pseudomonas、芽抱桿菌屬(Bacillus)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、鏈霉菌屬(StreptomyceS等。利用生防細菌 防治作物病害最著名的例子是Kerr利用放射農(nóng)桿菌(Agrobacterium radiobacterK84)成功防治由致病性農(nóng)桿菌引起的冠嚶病27,28。

14、近來也有許多性能優(yōu)異的生防 細菌被分離出來，其中不少菌株還被開發(fā)成商品制劑， 得到廣泛的推廣應用。這 些商品化制劑中則以芽抱桿菌制劑居多，這應歸因于芽抱桿菌所具有的良好生防 性能、抗逆性和易加工性等特性。目前應用的芽抱桿菌種類主要有枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、巨大芽抱桿菌、蠟狀芽抱桿菌和短小芽抱桿菌等。例如，Silveria 等人的研究發(fā)現(xiàn)巨大芽抱桿菌、蠟狀芽抱桿菌和凝結芽抱桿菌3種細菌對番茄青 枯病具有較好的防治作用，同時還能提高番茄種子的發(fā)芽率。AGRAQUEST公司利用枯草芽抱桿菌QST713開發(fā)的活菌制劑Serenade”，被成功用于防治多種 作物的霜霉病、白粉病和灰霉病等。諾維信公司

15、生產(chǎn)的菌劑Taegro（含枯草芽抱 桿菌）施用于溫室或者室內樹苗、灌木和裝飾植物的根部，可有效防治由鐮刀菌 屬和絲核菌屬引起的根腐病和枯萎病。截止目前，美國已經(jīng)有5株枯草芽抱桿菌生防菌株獲得環(huán)保局（EPA）商品化或有限商品化生產(chǎn)應用許可。另外，我國的科 技人員也對芽抱桿菌屬生防菌開展了大量研究工作，陳志誼等人研究了枯草芽抱 桿菌B-916對水稻紋枯病和稻曲病的防治機理，并開發(fā)了產(chǎn)品“紋曲寧”，其平 均防效可達70%以上29。韓艷霞等人的研究表明蠟狀芽抱桿菌 B3-7菌株對小麥 全蝕病菌具有很強的抑制能力，可有效降低小麥全蝕病的發(fā)病程度30。童蘊慧等人證實地衣芽抱桿菌W10對灰葡萄抱（Botry

16、tis cinerea）引起的番茄灰霉病的防 治效果與化學藥劑腐霉利相當310另一類被廣泛研究和應用的生防細菌是假單胞菌，它們中有很多能產(chǎn)生抗菌物質，如硝叱咯菌素、藤黃綠膿菌素、二乙酰藤黃酚等。 Gupta等人（ 1999）發(fā) 現(xiàn)銅綠假單胞菌 GRC1能產(chǎn)生水溶性綠膿菌素，對由 Macrophomina phaseolina 和Fusarium oxysporum引起的土傳病害具有很強的拮抗能力 32。鄭愛萍等人（2003）證實致黃假單胞菌（Pseudomonas aureofaciens對水稻紋枯病菌菌絲有 強烈的致畸作用，并能抑制菌核的萌發(fā)，田間防效高于井岡霉素330 Fernando等人

17、（ 2007）應用Pseudomonaschlororaphis防治蕓藁菌核病，其防效與殺菌劑 異菌月尿相當340另外，大量的鏈霉菌也被作為生防菌使用，例如，灰綠鏈霉菌 K61菌株對康乃馨枯萎病有很好的防治效果，在歐美國家己經(jīng)商品化生產(chǎn)。迄今為止，也已有大量的生防真菌被用于作物病害防治，由生防真菌開發(fā)的 生防制劑甚至多于生防細菌制劑，并已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的作用。主要的生防真菌品種有木霉、盾殼霉、無致病力的尖抱鐮刀菌等。木霉屬真菌由于具有 生境廣泛、對養(yǎng)分的要求低，易于分離和培養(yǎng)、生防療效好等特點，已經(jīng)成為目 前研究最為廣泛的一類生防真菌。Weindling等人早在20世紀30年代就發(fā)現(xiàn)木

18、霉可以寄生許多土傳真菌病害，如絲核菌屬、鐮刀菌屬、小核菌屬等，在土壤中適當添加木霉菌就能夠防治一些真菌病害。重寄生作用被認為是木霉對作物病害 生物防治的一個重要機制，該類木霉首先對真菌寄主進行識別，之后纏繞于病原 菌的菌絲上，并侵入菌絲內而使其死亡?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)的具有生防作用的木霉有哈茨 木霉、綠色木霉、長枝木霉、黃綠木霉等。例如，從土壤中獲得的哈茨木霉(Trichoderma harzianum) T-22菌株，能有效防治番茄枯萎病、天竺葵立枯病以 及由腐霉病菌(Pythium spp.)引起的碎倒病35, 36;綠色木霉T23菌株和TH-31 菌株則分別對甜瓜枯萎病和豆工豆褐斑病有很好的防治效

19、果。盾殼霉是核盤菌的重要寄生菌，對控制核盤菌菌核存活和子囊盤萌發(fā)十分有 效，可用于防控由核盤菌侵染引起的多種作物菌核病，并具有專一性強、有效時間長、對作物無致病性等優(yōu)點。早在 1989年，前蘇聯(lián)就開始生產(chǎn)盾殼霉制劑 Coniothyrin用于向日葵菌核病的防治；另外，彳惠國生產(chǎn)的Contans和匈牙利BIOVED公司生產(chǎn)的KONI都是非常知名的盾殼霉制劑，具有防效好、持效期長、 費用低等特點，在與同功能的化學農(nóng)藥的競爭中亦具有優(yōu)勢。無致病力的尖抱鐮刀菌則通常被用于防治由鐮刀菌引起的植物萎焉病， Ogawa(1985)采用無致病力的尖抱鐮刀菌預接種紅薯，結果表明這能有效防治尖 抱鐮刀菌引起的萎焉

20、病37。國內外的研究人員還對無致病力尖抱鐮刀菌 FO47進 行了長時間的應用研究，發(fā)現(xiàn)該菌株能有效地控制黃瓜、西瓜和番茄等多種植物 的萎焉病和根腐病，該菌株目前在歐洲已被商業(yè)化生產(chǎn)， 并應用于作物土傳病害 的防控。生防菌的控病機理生防菌一般通過分泌抗(抑)菌物質、競爭營養(yǎng)和生態(tài)位點、誘導抗性以及 重寄生等方式來抑制或殺滅病原菌，達到防治作物病害的效果。分泌抗(抑)菌 物質是生防菌防治作物病害最重要的機制之一，這些具有抗(抑)菌特性的物質 主要有：抗生素，毒素，抗菌肽及細胞壁降解酶，細菌素及其類似物。 例如，許多芽抱桿菌都能分泌低分子量的抗菌肽，對紋枯病、赤霉病、白粉病、 炭疽病等多種作物病害具

21、有防治作用。在這些抗菌物質的應用中，以抗生素最為常見，目前農(nóng)用抗生素已經(jīng)成為生物農(nóng)藥的主體，約占生物農(nóng)藥份額的90%。通過與病原菌競爭營養(yǎng)和生態(tài)位點來實現(xiàn)其抗病作用是生防菌防治作物病害的另一重要機制。自然環(huán)境（如，土壤）中微生物種類繁多，很多有生防功能 的有益菌與作物病原菌共存，并為了生存所需的營養(yǎng)物質和空間進行競爭，若生防菌獲得競爭優(yōu)勢，就能起到抑制病原菌的作用380例如，木霉的繁殖速度比鐮刀菌更快，當兩者爭奪生存空間時，木霉菌可使鐮刀菌生長受到抑制，甚至導致其死亡39。Bacon等人分離的一株玉米內生枯草芽抱桿菌與玉米病原菌申珠鐮 抱菌有相同的生態(tài)位點，而枯草芽抱桿菌能在玉米體內迅速定殖而

22、占有更多生態(tài) 位點,故能有效降低申珠鐮抱菌的發(fā)病率40o另外，還有誘導系統(tǒng)抗性和重寄生兩種重要的控病機制。有些生防菌在應用后能誘導植物發(fā)生一系列生理生化反應，并使其產(chǎn)生對多種病原菌的抗性，即誘導系統(tǒng)抗性（Induced systematic resistance, ISR）如，Benhamou等人（1996年）用短 小芽抱桿菌SE34預先接種豌豆，后期再接種病原菌，結果發(fā)現(xiàn)豌豆植株體內會 積累大量的木質素和酚類物質，并使寄主細胞壁加厚，能有效阻止病原菌的侵入 410重寄生則是生防菌寄生于植物病原菌上的一種寄生現(xiàn)象，包括生防寄生菌 與寄主菌的識別、接觸和寄生等一系列的連續(xù)過程。通常木霉就是通過重

23、寄生的 方式發(fā)揮生防作用，木霉與病原菌（寄主）接觸后，沿著寄主菌絲生長，并分泌 一些消化寄主細胞壁的酶，分解部分細胞壁后進入到寄主細胞內， 吸取寄主細胞 的營養(yǎng)進行生長繁衍，最終導致寄主死亡。1.4 生防菌在應用中存在的問題利用生防菌株防治作物病害尤其是土傳病害已經(jīng)取得了大量成果， 成功的利 用這些生防菌株開發(fā)了很多微生物制劑， 其中大多是含單一菌種的活菌制劑，這 些制劑也被廣泛的用于生產(chǎn)實踐，在應用中取得了不錯的效果，但也存在一些問 題，影響了生防菌的應用與推廣。目前所應用的生防菌基本都是在實驗室篩選獲得的一些抑菌效果很強的菌 株，這些菌株雖然在實驗室篩選評估過程中都表現(xiàn)出了很好的防治病害效

24、果，但在田間應用時防病效果卻并不理想、 或是性能不穩(wěn)定，特別是在應用時間或應用 區(qū)域不同時，其防治效果重復性差。這主要是因為生防菌是通過其生命活動而發(fā) 揮功效，在其應用環(huán)境中的許多生物因子或非生物因子都會對生防菌的生命活動 產(chǎn)生影響，進而影響到生防效果420例如，在不同土壤中的微生物群落存在很 大差異，這些土著微生物又會與施加的生防菌發(fā)生復雜的相互作用， 在某些土壤 條件下，生防菌容易獲得生長優(yōu)勢而發(fā)揮較好的功效， 但在其它土壤中卻不一定 如此。另外，也存在生防菌菌劑活性不高、穩(wěn)定性差等問題。為了應對生防菌在實踐應用中所表現(xiàn)出的諸多不足，相關研究人員也展開了大量的研究，以期能更好的拓展生防菌的

25、應用。 主要有以下幾個方面：優(yōu)化菌 劑的制備工藝，生產(chǎn)出活性高、性能穩(wěn)定的生防菌活菌制劑。深入研究生防菌 的生理生化特性、抗菌譜、抗逆性等，以便掌握其合適的應用方式和條件，確保 能有效發(fā)揮功效。兩種或多種生防菌株的混和使用，合理的混用有時不僅能提 高防治病害的效果，還能發(fā)展多功能的菌劑，例如，Raupach等人將枯草芽抱桿菌GB03和短小芽抱桿菌INR7混合用于處理黃瓜種子，結果表明能顯著提高對 多種病害的防治效果43o這可能是兩種菌株都有相似的功能，混用后導致了效 果的疊加，也可能是一種菌株的存在對另一菌株的生存有利，導致其能更好的生長并發(fā)揮相關作用。但是菌株混用時必須要測試菌株之間的親和性

26、，一般來說， 親和性較好的菌株混用后能提高其防治效果，而親和性差的菌株的混用效果則不 明確。對已有的生防菌進行改良，主要涉及到增強菌株抗逆性、提高抑菌物質 的表達、構建工程菌等幾個方面。生防菌與其它輔劑或化學農(nóng)藥的聯(lián)合應用。 另外，生防菌的抗病害相關基因的應用也值得關注，這些基因除了可用于構建工程菌外，還可用于發(fā)展轉基因抗病植物。1.5 微生物活菌制劑概述微生物活菌制劑是指含有特定的微生物活體細胞，并以特定（有益）微生物 活菌數(shù)量為質量指標，且具有某些預知功能的微生物活菌制品。 產(chǎn)品主要有醫(yī)療 保健用活菌制劑（含獸用）、微生物農(nóng)藥及肥料、用于環(huán)境保護及工業(yè)發(fā)酵等方 面的活菌制劑等。法國科學家L

27、ouis Pasteur （1822-1895在1857年發(fā)表關于乳酸發(fā)酵的記錄 之后，研究了丁酸、乳酸、醋酸和乙醇的微生物發(fā)酵過程，證明了微生物活菌在 發(fā)酵過程中的重要作用。1907年，俄國生物學家Elie Metchnikoff提出衰老是由于腸道細菌產(chǎn)物的毒害作用所致，并認為酸奶中的乳酸菌活菌能降低這種毒害作用，由此展開了微生物活菌與健康相關的系列研究；1915年，Daviel Newman首次利用乳酸菌治療膀胱感染并獲得一定療效，隨后科學家們對以乳酸桿菌為主 的活菌制劑進行了大量臨床研究，取得了大量成果。1947年，Mollgaard發(fā)現(xiàn)用乳酸桿菌活菌制劑飼喂仔豬可改善仔豬健康狀況，并有

28、效增加仔豬體重，后續(xù)的進一步研究促使活菌制劑進入到了動物養(yǎng)殖領域。20世紀中后期，微生物活菌制劑得到廣泛發(fā)展，并被大量用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、工業(yè)發(fā)酵以及環(huán)境保護等多個領 域。我國對于微生物活菌制劑的研究與應用始于 20世紀70年代何明清等對不產(chǎn) 生腸毒素但產(chǎn)生大腸菌素的大腸埃希氏菌菌株的應用。20世紀80年代初康白教授成功研制了促菌生（又稱樂腹康，主要成份是蠟樣芽抱桿菌），用于治療嬰幼兒 的腹瀉、腸炎等病癥，取得了良好的效果。從此，微生物活菌制劑在我國的研究、 開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)拉開了序幕，各種微生物活菌制劑相繼走進市場，如常樂康（酪 酸梭菌、嬰兒雙歧桿菌），整腸生（地衣芽抱桿菌），培菲康（雙歧桿菌、

29、乳酸桿 菌、腸球菌）等，但這些制劑均是用于醫(yī)療保健領域，而用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保 護等方面的則相對較少。20世紀70年代末期我國開始了光合細菌、飼料酵母、 乳酸菌以及芽抱桿菌等活菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖及畜牧業(yè)上的應用研究，也取得了一定的成果，但受到產(chǎn)品應用效果不夠穩(wěn)定、生產(chǎn)或使用成本高以及生產(chǎn)習慣等方 面的影響，其發(fā)展較慢，僅有用作水產(chǎn)養(yǎng)殖領域凈水劑的活菌制劑產(chǎn)品相對較多。 另外，幾乎在同一時期，以蘇云金芽抱桿菌和固氮菌為代表的用于種植業(yè)的活菌 制劑也得到了較快發(fā)展，特別是作為生物農(nóng)藥的蘇云金芽抱桿菌的產(chǎn)量在20世紀70年代末就已達到1000噸以上規(guī)模；在20世紀80-90年代固氮菌的應用也 比較廣泛

30、，解磷、解鉀細菌制劑也得到發(fā)展，但在20世紀末期其生產(chǎn)及應用規(guī)模一度出現(xiàn)萎縮；進入21世紀，發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展成為共識， 這帶給了農(nóng)用活菌制劑更多的發(fā)展機遇。周集體等人篩選到一株高效苯酚降解 菌，經(jīng)鑒定為布魯氏桿菌屬（Brucella sp.）,除能降解苯酚外，還可利用苯胺、蔡、 氯苯等芳香化合物為唯一碳源生長45;但受限于菌株穩(wěn)定性、安全性以及制劑 生產(chǎn)技術不成熟等多方面的原因，這些菌株很少被開發(fā)成商業(yè)化產(chǎn)品，在實際應 用中多是使用國外公司的產(chǎn)品，知名產(chǎn)品如丹麥諾維信公司的諾碧清系列污水處 理劑，美國碧沃豐公司的 BZT、OBT系列微生物制劑，美國通用環(huán)?？萍脊?的利蒙LLM

31、O系列菌劑，這些制劑多應用于污水處理、有機污染物降解、土壤修復、資源循環(huán)利用等方面1.6 農(nóng)用微生物活菌制劑的研究與應用現(xiàn)狀微生物活菌制劑已經(jīng)被廣泛應用于種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)以及農(nóng)副產(chǎn)品加工等農(nóng)業(yè) 領域，在種植業(yè)中應用的微生物活菌制劑主要包括微生物農(nóng)藥和微生物肥料兩大 類。這里的微生物農(nóng)藥專指用于防治作物病蟲害、去除雜草、調節(jié)作物生長或緩 解作物連作障礙的微生物活菌制劑。而微生物肥料則主要是指具有肥料效應的微 生物活菌制劑，我國著名微生物學家陳華癸教授對微生物肥料所做的定義是“一類含有活微生物的特定制品，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，作物能夠獲得特定的肥料效應， 在這種效應的產(chǎn)生過程中，制品中的活微生物起關鍵作

32、用?！背嗽诜N植業(yè)中應 用的微生物農(nóng)藥和微生物肥料外，微生物活菌制劑目前也已經(jīng)應用到動物疾病防 治、飼料加工、改善動物生產(chǎn)環(huán)境等多個環(huán)節(jié)，養(yǎng)殖業(yè)也成為了微生物活菌制劑 應用最為廣泛的領域之一。用作農(nóng)藥的活菌制劑作為微生物農(nóng)藥的活菌制劑主要有殺蟲劑、殺菌劑、除草劑以及植物生長調 節(jié)劑等多種。微生物殺蟲劑是其中使用最為廣泛的一類，它是利用對某些有害昆 蟲有致死作用的病原微生物制成，以防治和殺死目標害蟲為目的的生物制劑， 常 用的微生物有細菌、真菌、原生動物及線蟲。蘇云金芽抱桿菌被認為是微生物殺 蟲劑發(fā)展史上最重要的部分，1901年日本人S. Ishiwata在染病的家蠶幼蟲體內 發(fā)現(xiàn)了蘇云金芽抱桿

33、菌，并認為該菌是導致家蠶致病和死亡的主要原因，后人不斷研究將蘇云金芽抱桿菌用于作物蟲害防治，美國于1928年啟動了以應用蘇云金芽抱桿菌為主的防治玉米螟計劃，1929年就進行第一次大田應用，在1938年 法國第一個蘇云金芽抱桿菌產(chǎn)品 Sporeine就面世了。除了細菌被廣泛用作微生 物殺蟲劑，許多真菌也被開發(fā)成殺蟲劑，如白僵菌對多種農(nóng)林害蟲有致死作用， 已經(jīng)大量用于防治玉米螟、水稻葉蟬、松毛蟲等害蟲。目前，在包括中國在內的 許多國家，真菌殺蟲劑已廣泛用于農(nóng)林害蟲和城市昆蟲的防治，相關研究表明真 菌殺蟲劑在植物病蟲害的持續(xù)控制中具有巨大潛力，近年來已成為生防制劑的研 究熱點。另外，一些原生動物以及

34、昆蟲病原線蟲也被用于殺蟲劑開發(fā)，例如，原 生動物中微胞子蟲能用于防治棉鈴蟲、 婢蟲、松毛蟲等；昆蟲病原線蟲是昆蟲的 寄生性天敵，能主動尋找寄主，其侵染率高、致死力強、對人畜及環(huán)境安全，已 被廣泛應用于防治農(nóng)林害蟲。直至今日，人類利用微生物殺蟲已有100多年的歷 史，已篩選的殺蟲微生物達幾百種，制成產(chǎn)品并大面積應用的主要有蘇云金芽抱 桿菌、日本金龜子芽抱桿菌、球形芽抱桿菌、白僵菌、綠僵菌、擬青霉等。微生物殺菌劑一般包括農(nóng)用抗生素和抗病微生物制劑，但在這里單指抗病微生物的活菌制劑，抗病微生物一般通過寄生、抗生、競爭、溶菌等作用來抑制、 甚至殺滅致病微生物。熒光假單胞菌(Pseudomonas fl

35、uoresce。黑研究最多的生物 防治細菌，它大量存在于植物根際，定殖于植物根面，繁殖快，可產(chǎn)生嗜鐵素和 抗生素，在植物局部和空間微環(huán)境與目標菌競爭，對多種植物病原菌有抑制作用46?？莶菅勘U菌(Bacillus subtilis)制劑商業(yè)化生產(chǎn)與應用已有 30余年，這類制 劑對鐮抱屬(Fusarium )和絲核菌屬(Rhizoctonia)植物病原菌防治效果較好，同時 還具有促進生長的作用47。放射土壤桿菌K84的活菌制劑在1973年就被大規(guī)模 生產(chǎn)，它能有效抑制致病性根癌土壤桿菌的生長，主要用于預防植物冠嚶病480另外，也有一些具有抗菌能力的真菌被用于作為殺菌劑， 如哈茨木霉(T. har

36、zianum) 對灰霉病、腐霉病、菌核病、立枯病等多種病害都有較好的防治效果，哈茨木霉 T39已在以色列等國家獲得成功登記49。鏈抱粘帚霉(Gliocladium catenulatum) 也是一種重要的菌寄生真菌，可用于防治土壤里的腐霉菌和絲核菌。用作除草劑的活菌制劑是利用植物病原微生物致目標雜草染病死亡的微生 物制劑，一般由雜草病原菌的繁殖體和相應的助劑組成。由寄主雜草分離得到的植物病原菌對寄主植物一般具有種間特異性， 其選擇性高，對栽培植物比較安全， 因而應用較多。應用最廣泛的一類是利用病原真菌生產(chǎn)的抱子除草劑，真菌的抱子也是目前認為最適合作為除草劑的部分，對一些不產(chǎn)抱或產(chǎn)抱少的真菌則用

37、菌絲體片段來代替抱子。第一個注冊上市的真菌除草劑是1981年在美國登記的Devine制劑J,它是將棕桐疫霉菌的厚垣抱子制成懸浮劑，用于防治柑桔園中的 莫倫藤以及其它多年生作物田中的有害葡萄樹，其防治率可達96%; Collego制劑被認為是最成功的商品化真菌除草劑之一，它是將長抱狀刺盤抱的抱子加工成可濕性粉劑用來防治皂角，大田常規(guī)使用防治率在90%以上；Tasmart制劑的活性成分為稗內臍蠕抱菌，用于防治水稻田中的稗草；1963年我國研制成功了真菌除草劑“魯保一號”，它是在大豆菟絲子上分離得到的一種寄生性病原菌一膠 抱炭疽菌菟絲子專化型，可用于防治大豆、亞麻、瓜類、以及蔬菜等作物田中的 菟絲子

38、。具有雜草生物防治開發(fā)潛力的真菌類微生物主要集中在以下幾個屬：鐮刀菌屬、交鏈抱菌屬、疫霉屬、柄銹菌屬、殼單抱菌屬、刺盤抱菌屬、尾抱菌屬、 黑粉菌屬、核盤菌屬等50。細菌類則主要有假單胞菌屬、黃單胞菌屬、黃桿菌 屬、腸桿菌屬、檸檬酸細菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、歐文氏菌屬等。日本 煙草公司開發(fā)的除草劑Camperico就屬于細菌除草劑，其有效成分是殺禾黃桿菌 （Xanthomortsas campestris pv.poannua）, 可用于防治高爾夫球場的早熟禾，防治 率可達90%以上，且具有高選擇性。由于微生物除草劑對環(huán)境較為友好， 持效期 長，并能在一定程度上解決化學除草劑所帶來的抗性雜

39、草問題，因而一直廣受關注，也開發(fā)了諸多產(chǎn)品，但又由于微生物除草劑存在防治效果不穩(wěn)定 （受環(huán)境影 響大）、靶標單一、菌株易退化等問題而導致其難以規(guī)模推廣和應用。隨著生物 技術的發(fā)展和對雜草科學、除草微生物病原生物學及致病機理、遺傳學等方面研 究的深入，相信微生物除草劑將會在除草劑市場占有更大份額。還有一類能調節(jié)作物生長的活菌制劑，它主要是利用微生物生長過程中產(chǎn)生 的具植物生長調節(jié)功能的代謝物（如脫落酸、細胞分裂素、赤霉素等）來發(fā)揮作 用。例如，赤霉菌（如藤倉赤霉菌、菜豆根瘤菌、固氮螺菌等）能產(chǎn)生赤霉素， 能促進種子萌發(fā)、植株生長、提早開花結果。微生物農(nóng)藥最大的優(yōu)勢在于能克服化學農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的污

40、染和減少農(nóng)產(chǎn) 品中農(nóng)藥殘留，同時能有效提高農(nóng)產(chǎn)品的品質及所獲得的經(jīng)濟收益。正是基于它所具有的這一系列優(yōu)勢，許多歐美發(fā)達國家都將微生物農(nóng)藥的研究和應用作為目 前所推行的 生態(tài)農(nóng)業(yè)計劃”的核心內容。近年來，美國、澳大利亞和巴西等國在 推廣應用微生物農(nóng)藥上發(fā)展迅速，并引領著微生物農(nóng)藥新產(chǎn)品的研究與開發(fā)； 美 國環(huán)境保護局（EPA）已經(jīng)注冊了控制根系細菌和真菌病害、冰核細菌霜害和害 蟲的11個種的195個細菌菌株，注冊了 6種控制雜草、植物病害和害蟲幼蟲的 真菌。我國微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展對于實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化， 以及保障人民的生命健康和保護生態(tài)環(huán)境都十分重要。因此，有必要加快微生物農(nóng)藥

41、的研制、產(chǎn)業(yè)化和推廣應用進程，實現(xiàn)農(nóng)作物重大病蟲害可持續(xù)控制， 減少 農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留及對生態(tài)環(huán)境的污染，促進生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。用作肥料的活菌制劑由于長期使用化學肥料而在環(huán)保等方面產(chǎn)生了一系列問題，促使人們給予生 物肥料(尤其是微生物肥料)更多的關注，微生物肥料在減少化學肥料使用量、 控制有機廢棄物污染、改善生態(tài)環(huán)境、提高農(nóng)產(chǎn)品品質等方面均能發(fā)揮重要作用。微生物肥料白研究始于19世紀80年代根瘤菌固氮功能的發(fā)現(xiàn)，1888年荷 蘭學者Martinus Beijerinck首先獲得了根瘤菌的純培養(yǎng)51, 1889年波蘭人Prazmowski用根瘤菌純培養(yǎng)接種豆科植物形成了根瘤，1895年Nobbe和H

42、iltner成功開發(fā)了純培養(yǎng)的根瘤菌制劑“ Nitragin”產(chǎn)品，標志了微生物肥料走出實驗 室進入商業(yè)化應用52。1937年Azotobacter接種劑 “Azotogenft蘇聯(lián)推廣應用， 據(jù)報道能顯著提高作物的產(chǎn)量，從此產(chǎn)生了自生固氮菌肥料。此后蘇聯(lián)又推出了 具有解磷活性的巨大芽抱桿菌 (Bacillus megaterium varphosphaticum)活菌制劑， 其能夠提高土壤磷的有效性，從此開始了磷細菌和鉀細菌肥料的廣泛研究與應 用。Dobereiner實驗室在研究應用巴西固氮螺菌(Azospir川um brasilense)的基 礎上，于1976年提出了聯(lián)合共生固氮的概念，并

43、將多種聯(lián)合固氮菌作為肥料用 于作物生產(chǎn)530截止目前已有大量的肥料菌劑在不同的國家登記應用，其相關 研究和生產(chǎn)應用也在不斷深入，Wilson等人統(tǒng)計報道，僅1992年全球就有約300 項研究是關于微生物肥料在土壤和作物上的應用。目前，微生物肥料的開發(fā)研究主要集中在以下幾個方面：固氮機理分子水平的研究，以提高微生物的固氮水平；以分子生物學技術改造共生細菌，提高其生存能力，最終可促進根瘤的形成；探索微生物肥料中不同菌株之間的相互 關系，以獲得最佳的菌株配伍；完善微生物肥料的產(chǎn)品標準， 加強對微生物肥 料的質量監(jiān)督和管理。我國的微生物肥料研究開發(fā)水平總體比較落后，其開發(fā)的成品多是模仿國外產(chǎn)品，或利用

44、已商業(yè)化的菌種復配而成，但近年來在新菌種篩 選、菌劑復配及應用效果評價等方面開展了較多研究，也取得了一定的成果。有研究人員計算，若使我國微生物肥料的使用量占到化肥使用量的3%,則糧食產(chǎn)量可增加50億千克以上(目前我國微生物肥料的用量約300多萬噸，不足化肥量的0.5%);若中國種植的800萬公頃大豆能采用根瘤菌接種固氮技術， 則每年可以節(jié)省5000萬美元以上的肥料投入。另外，由于大量施用化肥所帶來的土壤退化、水污染等一系列負面影響，也為微生物肥料的應用與發(fā)展帶來了機 遇。其它農(nóng)用活菌制劑獸藥用活菌制劑最初多是從人用微生態(tài)活菌制劑中引入，或直接使用，或經(jīng)改良后使用，主要用于預防和治療腹瀉、腸炎、

45、消化不良等消化道疾病。目前最 常見的是使用蠟樣芽抱桿菌、枯草芽抱桿菌、乳酸桿菌等菌種的活菌制劑治療畜 禽的消化道疾病以及水產(chǎn)養(yǎng)殖上的感染性疾病。例如，康白等人分離的蠟樣芽抱桿菌(DM423)的活菌制劑一促菌生，獸醫(yī)上用來對畜禽的腸炎腹瀉等疾病進行治 療，獲得了滿意的療效54。王平等報道，在仔豬出生時即投喂乳酸桿菌 TPY-211 口服液，對防治7日齡內仔豬腹3f有明顯效果550薛俊龍等證實市售禽用“益生 素”(主要益生菌為嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌、酵母菌、枯草芽抱桿菌等)能有效 避免雛雞感染雞白痢沙門氏桿菌，顯著提高雛雞成活率56; KozasaT 1986年首次 將活菌制劑應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領域的疾

46、病防治，利用東洋芽抱桿菌(Bacillus toyoi)處理鰻鯽，降低了由愛德華菌引起的死亡率57o活菌制劑除了被用于防治動物疾病外，有些也被用作動物的飼料或添加劑。 Kyriakis等研究表明，日糧中添加地衣芽抱桿菌，可顯著提高仔豬平均重量和日 均增重量，飼料采集量相比對照組提高26.8%,飼料轉化率也得到改善58; Guerra 等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌制劑能夠顯著提高斷奶仔豬的平均日增重，并且對于控制腸道中總大腸桿菌數(shù)量具有明顯效果590這類飼用活菌制劑在我國國內的起步較晚， 成熟產(chǎn)品不多，國際上的知名產(chǎn)品主要有美國Probiottics公司的Protoxin,彳惠國Chevita 公司的 Suiferm Special,以及泰國的 Toyacerin 和加拿大的 Prosuis Paste 等，其主要功效大多為促進畜禽生長發(fā)育，提高飼料轉化率，改善畜禽健康狀況， 增