表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)及其在生物分析中的應(yīng)用

1、食品課程論文表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)及其生物題目 分析應(yīng)用研究進(jìn)展 姓名專業(yè)陳坤 學(xué)號(hào) 2009309010006 食品科學(xué)二九 年 十二 月表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)及其生物分析應(yīng)用研究進(jìn)展Bioanalysis Application of Surface-enhanced Raman Spectroscopic（陳坤 2009309010006 食科院 食品科學(xué)）摘要：拉曼光譜誕生距今已整整80年，激光器、CCD檢測(cè)器、光纖探針技術(shù)的發(fā)展使拉曼光譜分析儀器及其應(yīng)用進(jìn)展日新月異。然而傳統(tǒng)拉曼光譜信號(hào)微弱，因此表面增強(qiáng)拉曼散射光譜（SERS）憑借其超靈敏且具有化學(xué)選擇性而被廣泛應(yīng)用于生物分子鑒定。它是

2、一種信號(hào)強(qiáng)度高，熒光和水的背景干擾小的表面分析技術(shù)。本文就SERS在生物應(yīng)用方面的研究作簡(jiǎn)單回顧。關(guān)鍵詞：表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）；生物分析；應(yīng)用拉曼光譜是用途廣泛的無損檢測(cè)和分子識(shí)別技術(shù)，它能夠提供化學(xué)和生物分子結(jié)構(gòu)的指紋信息。但是常規(guī)拉曼散射截面分別只有紅外和熒光過程的10-6和10-14。1這種內(nèi)在低靈敏度的缺陷曾制約了拉曼光譜應(yīng)用于痕量檢測(cè)和表面科學(xué)領(lǐng)域。盡管拉曼光譜技術(shù)是一種重要的生物化學(xué)分析工具，但由于其信號(hào)強(qiáng)度低，而生物分子通常在自然環(huán)境下含量較低，這樣得到的拉曼信號(hào)很小或者檢測(cè)不到，作為信息讀出手段往往缺乏高靈敏性。直到20世紀(jì)70年代中期，F(xiàn)leischmann、Van

3、Duyne和Creighton分別領(lǐng)導(dǎo)的3個(gè)研究組2-4分別觀測(cè)和確認(rèn)了表面增強(qiáng)拉曼現(xiàn)象，即在粗糙銀電極表面的吡啶分子的拉曼信號(hào)比其在溶液中增強(qiáng)了約106倍。人們將這種由于分子等物種吸附或非?？拷哂心撤N納米結(jié)構(gòu)的表面，其拉曼信號(hào)強(qiáng)度比其體相分子顯著增強(qiáng)的現(xiàn)象稱作表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering，SERS)效應(yīng)。SERS效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)有效地解決了拉曼光譜在表面科學(xué)和痕量分析中存在的低靈敏度問題。1. 表面增強(qiáng)拉曼散射機(jī)理與SERS實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用所取得的進(jìn)展相比，SERS理論的研究一直相對(duì)滯后，這主要是因?yàn)榫哂蠸ERS效應(yīng)的體系非常復(fù)雜。體系表面形貌和

4、表面電子結(jié)構(gòu)，光和粗糙表面的相互作用，光和分子的相互作用，分子在表面的取向、成鍵作用以及分子和表面的周邊環(huán)境，入射光的強(qiáng)度、頻率、偏振度和偏振方向等因素對(duì)SERS譜圖的影響均比較復(fù)雜。SERS體系的這些復(fù)雜性導(dǎo)致了人們對(duì)SERS效應(yīng)認(rèn)知的多樣性. 人們從各個(gè)角度和具體實(shí)驗(yàn)條件提出了不同的SERS機(jī)理5。 目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)同的SERS機(jī)理主要有物理增強(qiáng)機(jī)理和化學(xué)增強(qiáng)機(jī)理兩類。SERS譜峰強(qiáng)度ISERS常具有以下正比關(guān)系6, 7：式中，E（0）和E（S）分別為頻率為0的表面局域光電場(chǎng)強(qiáng)度和頻率為S的表面局域散射光電場(chǎng)強(qiáng)度；和分別為分子所處位置的激發(fā)光的電場(chǎng)方向和拉曼散射光的電場(chǎng)方向；（）fi是某始

5、態(tài)i經(jīng)中間態(tài)r到終態(tài)f的極化率張量。式（1）ISERS前半部分表明，入射與散射光的局域電場(chǎng)強(qiáng)度越大，拉曼信號(hào)強(qiáng)度越大，這來自于物理增強(qiáng)機(jī)理的貢獻(xiàn)，通常歸因于電磁場(chǎng)增強(qiáng)（Electromagnetic enhancement, EM）機(jī)理8。式，（1）后半部分表明，體系極化率（）fi越大, 則相應(yīng)拉曼信號(hào)的強(qiáng)度也越大，這是SERS化學(xué)增強(qiáng)（Chemical Enhancement, CE）機(jī)理的貢獻(xiàn)5, 9。它是由于分子和表面之間的化學(xué)作用，從而增大了體系的極化率。1.1 化學(xué)增強(qiáng)機(jī)理化學(xué)相互作用對(duì)反映在光電場(chǎng)下電子密度形變難易程度的拉曼過程是非常重要的。當(dāng)分子化學(xué)吸附于基底表面時(shí)，表面、表面吸

6、附原子（Adatom）和其它共吸附物種等都可能與分子有一定的化學(xué)作用，這些因素對(duì)分子的電子密度分布有直接的影響?；瘜W(xué)增強(qiáng)主要包括以下3類機(jī)理：（1）由于吸附物和金屬基底的化學(xué)成鍵導(dǎo)致非共振增強(qiáng)（Chemical-Bonding Enhancement, CB）；（2）由于吸附分子和表面吸附原子形成表面絡(luò)合物（新分子體系）而導(dǎo)致的共振增強(qiáng)（Surface Complexes Enhancement, SC）；（3）激發(fā)光對(duì)分子-金屬（Molecule-Metal, m-M）體系的光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移的類共振增強(qiáng)（Photon-induced Charge-Transfer Enhancement, P

7、ICT）。這3種增強(qiáng)機(jī)理都表示體系極化率的變化對(duì)拉曼強(qiáng)度的影響，它們的區(qū)別在于CB增強(qiáng)是由于分子與表面化學(xué)吸附形成化學(xué)鍵，引起分子和金屬間的部分電荷轉(zhuǎn)移；該體系極化率的分子和分母項(xiàng)都沒有顯著變化，但是分子的HOMO和LUMO軌道展寬。SC增強(qiáng)是由于在表面上由部分帶正電的金屬原子組成的原子簇和帶部分負(fù)電荷的分子以及電解質(zhì)陰離子形成表面絡(luò)合物，這種絡(luò)合物作為新的分子體系，具有不同的HOMO和LUMO，在可見光激發(fā)下可以達(dá)到共振；該體系極化率的分子和分母項(xiàng)都有較大改變，特別是分母項(xiàng)由于滿足共振條件，其實(shí)部趨于零。PICT增強(qiáng)并不強(qiáng)調(diào)表面與分子有很強(qiáng)的化學(xué)作用，主要取決于金屬電極的費(fèi)米能級(jí)和分子HOM

8、O或LUMO的能量差；若該值與激發(fā)光能量相匹配，就會(huì)發(fā)生分子到金屬或者金屬到分子的電荷轉(zhuǎn)移；該體系極化率的改變主要體現(xiàn)在中間態(tài)r上，即體系的電荷轉(zhuǎn)移態(tài)。1.2 SERS的電磁場(chǎng)增強(qiáng)機(jī)理在SERS效應(yīng)的電磁場(chǎng)增強(qiáng)機(jī)理解釋中，表面等離子體共振（Surface plasmaon resonance, SPR）引起的局域電磁場(chǎng)增強(qiáng)被認(rèn)為是最主要的貢獻(xiàn)9-12。表面等離子體是金屬中的自由電子在光電場(chǎng)下發(fā)生集體性的振蕩效應(yīng)13, 14，特定粒徑的納米粒子金屬因?yàn)楦髯元?dú)特的等離子體共振吸收而顯現(xiàn)出豐富多彩的顏色效應(yīng)。這種等離子體的共振吸收早在19 世紀(jì)人們就開始了對(duì)其內(nèi)在機(jī)理進(jìn)行研究。Lorenz，Mie和

9、Debye各自獨(dú)立發(fā)展了相應(yīng)方法計(jì)算介質(zhì)球?qū)﹄姶挪ǖ纳⑸渥饔?，這樣的理論15-17被稱之為L(zhǎng)orenz-Mie-Debye理論，Lorenz-Mie理論或Mie理論。Mie首次解釋了各種粒徑的球形金納米粒子的顏色起源。Gans修正的Mie理論可以處理橢球或者類橢球粒子的光學(xué)性質(zhì)，較好地解釋了金納米棒的橫模和縱模等離子體吸收峰，以及縱模吸收峰隨粒子長(zhǎng)徑比變化的現(xiàn)象。由于早期Mie理論只是考慮孤立粒子的光學(xué)性質(zhì)，并沒有考慮臨近粒子的耦合作用，而納米粒子之間的耦合作用對(duì)其自身的光學(xué)性質(zhì)和SERS的增強(qiáng)作用都有很大的影響。當(dāng)粒子之間的距離小于粒子本身的尺度，甚至在發(fā)生團(tuán)聚時(shí)，等離子體共振峰（SPR）發(fā)

10、生紅移，同時(shí)在更長(zhǎng)波長(zhǎng)的位置出現(xiàn)吸收峰，這些譜峰被認(rèn)為是類似于納米棒中的縱模共振峰。為了克服Mie理論的缺陷。人們發(fā)展了有效介質(zhì)理論，特別是Maxwell-Garnett理論，很好地解釋了多粒子耦合的光學(xué)現(xiàn)象。除此之外還發(fā)展了存在解析解的廣義Mie理論，數(shù)值求解的時(shí)域有限差分方法（Finite Difference Time-Domain，F(xiàn)DTD）。例如，通過擬合金屬的介電常數(shù)，利用三維時(shí)域有限差分（3D-FDTD）方法模擬了不同形狀的純金屬納米粒子的電場(chǎng)分布，模擬了核殼結(jié)構(gòu)的異質(zhì)材料的光電場(chǎng)分布等。模擬結(jié)果表明可以利用SERS的電磁場(chǎng)增強(qiáng)的長(zhǎng)程效應(yīng)，采用“借力”的策略，以高SERS活性的A

11、u，Ag和Cu納米粒子為基底或核，分別在其表面沉積或者修飾上極薄層的非SERS活性或者弱SERS活性材料，從而獲得在這些材料上吸附的分子的高質(zhì)量SERS譜，以拓展SERS研究和應(yīng)用體系。此外，離散偶極近似方法（Discrete Dipole Approximation）也常用來數(shù)值求解特殊形狀的納米粒子的光學(xué)性質(zhì)。定量模擬電磁場(chǎng)增強(qiáng)的分布，并與納米粒子的表征技術(shù)相結(jié)合，可以指導(dǎo)人們合成具備某種光學(xué)性質(zhì)可控的納米結(jié)構(gòu)材料，并推動(dòng)SERS成為廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感和生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的有力工具。2. 新型SERS 活性基底20世紀(jì)80 年代SERS 的發(fā)展遇到了不少難題：僅有金、銀、銅3 種金屬和少數(shù)極

12、不常用的堿金屬（如鋰、鈉等）具有強(qiáng)的SERS效應(yīng)；金、銀、銅金屬尚需表面粗糙化處理之后才具有高SERS活性，故常用的平滑單晶表面皆無法用SERS研究；實(shí)驗(yàn)上所觀察到的很多復(fù)雜現(xiàn)象尚無法用現(xiàn)有的SERS理論進(jìn)行解釋。20世紀(jì)90年代以Kneipp和Nie S為代表的一些小組對(duì)上述問題進(jìn)行了理論與實(shí)驗(yàn)研究，取得了突破性的進(jìn)展：SERS增強(qiáng)因子從最初的104106提高到了10141016，SERS逐漸發(fā)展成為單分子科學(xué)研究手段之一18, 19；在系列純過渡金屬元素（第副族元素）以及其它體系中觀察到SERS效應(yīng)20, 21。目前吸附分子產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼散射的金屬有Ag、Au、Cu、Li、Na 、K、I

13、n、Al、Pt 、Rh、Ni、Ti、Hg、Cd、Pd等，化合物有TiO2、NiO等22。納米技術(shù)的發(fā)展給SERS技術(shù)的發(fā)展注入了活力，例如，某些納米粒子體系的SERS信號(hào)可以放大至百萬億倍，因此有望成為單分子科學(xué)中的重要檢測(cè)工具。19, 23近年來，SERS被廣泛地應(yīng)用于表面吸附24、電化學(xué)和催化反應(yīng)24, 25、化學(xué)和生物傳感器23, 26、生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)27-29及痕量檢測(cè)與分析30等領(lǐng)域。在發(fā)現(xiàn)SERS效應(yīng)之后，人們發(fā)現(xiàn)表面增強(qiáng)效應(yīng)也普遍存在于其它光譜學(xué)中，通過對(duì)各種表面增強(qiáng)光譜的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，它們都具有強(qiáng)烈依賴于特定的金屬納米結(jié)構(gòu)的共性。為了達(dá)到增強(qiáng)效果，應(yīng)選擇直徑10-100nm接近待

14、分析分子的金屬粒子。增強(qiáng)途徑很多，常用技術(shù)及使用的納米粒子均列于表1中。金銀溶膠，薄層和電極是最常用的增強(qiáng)基底。金納米粒子易控制大小分布，穩(wěn)定性好，與抗體、抗原蛋白質(zhì)，DNA及RNA有良好的生物相容性，它已經(jīng)成功的應(yīng)用于標(biāo)記技術(shù)，合適大小和粗糙度的金溶膠粒子很適合做SERS基底。因此，標(biāo)記免疫納米粒子通過各種生物反應(yīng)識(shí)別待測(cè)部分，可以很好的達(dá)到檢測(cè)要求。3. 生物分析應(yīng)用拉曼光譜具有靈敏度高、需樣量濃度低（10-310-5 mol·L-1）、反映信息量大以及不受水溶劑的干擾等優(yōu)點(diǎn)，此外還可以針對(duì)復(fù)雜分子的不同生色團(tuán)進(jìn)行選擇性共振激發(fā)（生物分子在250750 nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的吸收譜帶

15、），因此激光拉曼光譜被廣泛用于研究DNA、膽色素、卟啉等生物分子的結(jié)構(gòu)表征及其與藥物分子的相互作用31-33。采用表面增強(qiáng)拉曼光譜手段對(duì)幾種季銨鹽化合物與DNA之間的相互作用，結(jié)果表面拉曼光譜作為一種抗癌藥物篩選和藥物作用研究手段具有十分廣闊的應(yīng)用前景33。3.1 生物分子檢測(cè)3.1.1 氨基酸溶液SERS實(shí)時(shí)SERS觀測(cè)在生物分子研究領(lǐng)域有著卓越的應(yīng)用前景，如核酸和氨基酸識(shí)別。這項(xiàng)工作致力于對(duì)氨基酸的光診斷應(yīng)用研究。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)和酶的基礎(chǔ)物質(zhì)。要組成不同的蛋白質(zhì)需要多種氨基酸來組合。一個(gè)氨基酸通常大于100nm，所以這個(gè)氨基酸只有部分能連到Ag+基底上34，35。據(jù)此來推測(cè)Glu和As

16、p在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用36。3.1.2 肽鏈SERS肽鏈大多是通過羧基端與Ag+相連。一般會(huì)在930和1410cm-1處出峰。但是對(duì)于不同的氨基酸這些峰的位置和強(qiáng)度都會(huì)發(fā)生變化，揭示了可能是由于羧基端和銀表面相互作用的結(jié)果37。3.1.3 蛋白質(zhì)SERS蛋白質(zhì)SERS分析幾乎與氨基酸SERS同時(shí)展開。這些研究囊括對(duì)神經(jīng)傳遞38、血紅蛋白39、四黃素40、視網(wǎng)膜41、膽液42、視覺交叉神經(jīng)43等的研究。3.1.4 雙螺旋DNA SERS當(dāng)核酸吸附到金屬納米結(jié)構(gòu)上時(shí)就可被檢測(cè)到，與普通的基因診斷不同，這是一種直接測(cè)定技術(shù)。還有其它SERS報(bào)道用于DNA雜交1,3,7,9-6氯-6-羧基二氫熒

17、光素和羅丹明6G44，45。3.2 免疫測(cè)定SERS標(biāo)記免疫學(xué)創(chuàng)立于年代初期，開始以放射免疫分析為代表，以后相繼派生出許多其它的標(biāo)記免疫分析方法。在方法學(xué)的研究、開發(fā)和發(fā)展過程中，人們關(guān)注的焦點(diǎn)始終圍繞著如何提高靈敏度和特異性這兩大精髓問題。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，特別是近十余年來，新理論、新方法、新材料、新工藝、新產(chǎn)品不斷開發(fā)，使標(biāo)記免疫分析技術(shù)向縱深發(fā)展，目前已形成由多種標(biāo)記、多種反應(yīng)模式的綜合性標(biāo)記免疫分析體系。標(biāo)記免疫學(xué)是一門邊緣學(xué)科，其基本技術(shù)標(biāo)記免疫分析，是將多種標(biāo)記示蹤技術(shù)的高度靈敏性和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性相結(jié)合的產(chǎn)物，因此具有及其良好的微量分析效果，是生物活

18、性物質(zhì)分析方法上的新領(lǐng)域。這一分析方法不僅靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，而且操作簡(jiǎn)單，易于商品化。傳統(tǒng)的拉曼散射光譜信號(hào)較弱，作為信息讀出手段往往缺乏高靈敏性。70年代中后期Au、Ag、Cu上表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)，給拉曼光譜的研究應(yīng)用注入了新的活力。SERS標(biāo)記免疫檢測(cè)是一種將SERS免疫反應(yīng)中加入標(biāo)記示蹤物，與標(biāo)記免疫學(xué)相結(jié)合，利用SERS的高靈敏度和光譜選擇性，結(jié)合抗體抗原的特異反應(yīng)作用而進(jìn)行的納米標(biāo)記免疫分析技術(shù)。這種新發(fā)展起來的標(biāo)記免疫分析技術(shù)將生物分析技術(shù)、納米技術(shù)與SERS三者很好的結(jié)合。事實(shí)上，在一些納米銀“熱粒子”上，某些分子，如染料分子、血紅

19、蛋白等的信號(hào)靈敏度可與熒光光譜媲美，甚至超過熒光光譜，且拉曼譜峰寬度通常比熒光譜峰要窄一倍，對(duì)生物分子光損傷性很小，尤為適合水溶液物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。SERS的高選擇性、高靈敏度，使其在生物分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象、分子的界面行為和性質(zhì)、標(biāo)記分子與金屬納米粒子表面的相互作用等方面有良好的研究前景。SERS標(biāo)記免疫技術(shù)是在生物免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要基于類似三明治結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，基底上的固相抗體與標(biāo)記抗體通過與抗原的結(jié)合形成“固相抗體-待測(cè)抗原-標(biāo)記抗體”夾心復(fù)合物，通過對(duì)標(biāo)記分子SERS信號(hào)的識(shí)別進(jìn)行免疫分析。這項(xiàng)技術(shù)最早是由Rohr等人46于1989年創(chuàng)立，他們首先利用表面增強(qiáng)共振拉曼光譜(SERRS

20、)來研究生物分子之間的相互親和性，將二甲基偶氮苯胺以共價(jià)鍵與抗甲狀腺促進(jìn)激素(TSH)抗體相連，形成標(biāo)記抗體，以銀表面固定的anti-TSH抗體作為固相抗體，二者與待測(cè)液中TSH抗原形成夾心復(fù)合物，利用夾心復(fù)合物中標(biāo)記物的SERRS信號(hào)來進(jìn)行免疫分析，但這種固相抗體的均一性較難控制，重現(xiàn)性較差。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，SERS在酶聯(lián)免疫47和基因工程48領(lǐng)域也有了較大的研究進(jìn)展。Dou49和Mirkin50等人分別將SERS標(biāo)記免疫技術(shù)用于酶聯(lián)免疫分析與DNA序列識(shí)別。這些研究為以后SERS標(biāo)記免疫檢測(cè)打下了堅(jiān)實(shí)的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，引起了世界各研究小組的廣泛關(guān)注。Mirkin小組將SERS標(biāo)記免疫與

21、醫(yī)學(xué)上的銀染色技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行免疫識(shí)別，利用銀的強(qiáng)SERS效應(yīng)，在標(biāo)記免疫金納米粒子與固相抗體所捕獲的抗原發(fā)生免疫識(shí)別后進(jìn)行銀染色以獲得較好的活性。將標(biāo)記免疫分析的選擇性與表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)的靈敏度進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，對(duì)拉曼光譜在生物體系中的應(yīng)用有重要意義。免疫檢測(cè)建立在抗原與其對(duì)應(yīng)抗體的特異性反應(yīng)上，它是生化分析，醫(yī)學(xué)診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)中非常有用的分析手段。而最具代表性的研究當(dāng)屬Porter小組51于1999年首次將SERs標(biāo)記分子和羊抗小鼠IgG直接與金溶膠相作用形成標(biāo)記免疫溶膠，通過相應(yīng)小鼠抗原與固定在基底上的羊抗小鼠IgG相連，進(jìn)行SERs免疫檢測(cè)。采用雙官能團(tuán)標(biāo)記分子代替單官能團(tuán)標(biāo)記分子是提高

22、檢測(cè)靈敏度的方法之一。雙官能團(tuán)標(biāo)記分子一端通過巰基與金納米粒子相連，另一端與抗體相連，這種方法大大增加了金納米粒子表面吸附標(biāo)記分子的數(shù)量，提高了檢測(cè)的靈敏度，其待測(cè)抗原的檢出限達(dá)到了1 pg/mL。采用這種標(biāo)記免疫溶膠方法，金納米粒子表面產(chǎn)生的電磁場(chǎng)將直接影響相連的標(biāo)記分子，可產(chǎn)生較強(qiáng)的SERS信號(hào)，且不存在距離影響SERS信號(hào)的問題。因此無需選用特定的吸收光譜與入射光波長(zhǎng)相匹配產(chǎn)生共振效應(yīng)的分子，拓寬了標(biāo)記分子的選擇范圍，這種方法與Rohr、Dou等人采用的直接標(biāo)記法、酶標(biāo)法相比更體現(xiàn)了SERS其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。3.3 生物組織或細(xì)胞SERS分析近幾年，拉曼標(biāo)記與生化、免疫手段相結(jié)合定位檢測(cè)亞細(xì)

23、胞結(jié)構(gòu)甚至某種特定生物大分子的研究，正成為激光拉曼光譜拓展到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新切入點(diǎn)。不會(huì)導(dǎo)致生物變性的近紅外激光和高靈敏度的CCD檢測(cè)器的使用以及顯微拉曼光譜儀器的12m空間分辨率使單細(xì)胞的拉曼光譜檢測(cè)成為可能，自從Puppels等報(bào)道采用自行研制的激光共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞及染色體之后，單個(gè)細(xì)胞原位、無損檢測(cè)的報(bào)道層出不窮。鼠肝星狀細(xì)胞體內(nèi)外激活的拉曼光譜研究表明其活化過程中分子組成和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，基于模糊C均值和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等聚類分析法，構(gòu)建了自動(dòng)判別肝損傷程度的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和探索了早期預(yù)警肝纖維化的快速診斷方法52。采用化學(xué)方法將納米金與從病毒中提取的核定位肽連接，制成細(xì)胞核

24、靶向拉曼光譜檢測(cè)，成功地獲取了核內(nèi)生物大分子的大量結(jié)構(gòu)53信息。拉曼光譜因具有較高選擇性以及尤為適合水溶液物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究等特點(diǎn)，近年來己在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中顯示出獨(dú)特的潛在應(yīng)用前景，而被大量應(yīng)。基于組織在病變過程中分子組成和分子結(jié)構(gòu)的變化，拉曼光譜法另辟蹊徑試圖從分子層面區(qū)別病變和正常組織的差異，從而實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷。自從Alfano等首次證實(shí)了拉曼光譜可用于區(qū)分正常組織與癌癥組織后，各類器官的正常與癌變組織的拉曼檢測(cè)工作陸續(xù)開展起來，這些組織包括皮膚、腦、眼、口腔、食道、胃、肝、膀胱、子宮頸、結(jié)腸、骨等。目前，除乳腺、皮膚等體表組織以及胃腸道中的結(jié)腸、食道組織和婦科腫瘤中的子宮頸組織可以實(shí)現(xiàn)

25、體內(nèi)檢測(cè)外54，其他器官組織還停留在離體檢測(cè)階段。對(duì)正常與病變組織的拉曼光譜比對(duì)，并采用小波分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對(duì)所獲得的拉曼光譜譜圖進(jìn)行信號(hào)處理和特征信息的提取55。例如，對(duì)參與阿爾茨海默病變的海馬組織進(jìn)行拉曼光譜研究，發(fā)現(xiàn)在腦內(nèi)與-淀粉樣蛋白共存的分子伴侶-膽固醇的堆積以及tau蛋白異常磷酸化等新的拉曼光譜信息。以此作為一種新的多組分拉曼光譜判據(jù)，為了解阿爾茨海默癥的致病機(jī)理和藥物治療提供了新的視角。人眼翼狀胬肉拉曼光譜研究表明：拉曼光譜可作為一種簡(jiǎn)便直觀和信息豐富的新型病理學(xué)診斷手段，它所提供的關(guān)于翼狀胬肉的病理變化信息涵蓋了免疫學(xué)、超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)和脂類過氧化反應(yīng)三種病理學(xué)手段的檢測(cè)結(jié)果

26、。過氧化氫是醫(yī)用牙齒漂白劑的主要活性成分，其漂白機(jī)理及安全性一直存在爭(zhēng)論。采用激光拉曼光譜、激光誘導(dǎo)熒光光譜和紅外光譜對(duì)漂白前后的牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從多個(gè)視角了解了漂白劑在牙漂白過程中對(duì)牙釉質(zhì)/牙本質(zhì)的力學(xué)強(qiáng)度、礦物和有機(jī)成分的組成與結(jié)構(gòu)的影響56, 57，為漂白機(jī)理的探討和評(píng)估漂白劑使用的安全性提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)。單個(gè)培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC7901和胃黏膜組織中的正常與胃癌細(xì)胞的拉曼光譜比較顯示出維生素A和類胡蘿卜素在癌變過程中呈現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，這一發(fā)現(xiàn)為探討癌變機(jī)理提供了新的思路?；谇€擬合的重疊峰解析和小波分析等多種化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對(duì)單個(gè)培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC7901和胃黏

27、膜組織中的胃癌細(xì)胞的拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，大大提高了光譜數(shù)據(jù)的信噪比并得到了精確甄別出胃黏膜組織上胃癌細(xì)胞的拉曼光譜判據(jù)，為胃癌的早期診斷和胃癌手術(shù)中癌組織的準(zhǔn)確甄別與手術(shù)切除提供了一種可行的依據(jù)53。脊髓損傷（SCI）的發(fā)病率隨著交通與建筑業(yè)的發(fā)展而逐年增加，脊髓損傷引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)酥松機(jī)理尚未明晰。而采用激光共聚焦拉曼光譜從分子層面對(duì)脊髓損傷引發(fā)的骨質(zhì)變化進(jìn)行了初步的研究，證實(shí)了荷爾蒙的變化是引起骨質(zhì)流失的重要因素之一。表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）拓寬了生物分析這個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用，可使生物樣品的拉曼信號(hào)增強(qiáng)若干個(gè)數(shù)量級(jí)。SERS還被應(yīng)用到昆蟲病毒，抗濾過性病原體的藥物，泌尿系統(tǒng)細(xì)菌等方面的

28、研究。3.4 生物組織或細(xì)胞SERS成像將表面增強(qiáng)拉曼光譜與共聚焦拉曼顯微鏡結(jié)合，可以得到這種高光譜表面增強(qiáng)拉曼成像技術(shù)（HSERI）。這是一種采用激光共焦拉曼散射顯微三維掃描技術(shù)，在無擾、原位、實(shí)時(shí)情況下，對(duì)活細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)與分布狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定并三維成像的技術(shù)與方法。表面增強(qiáng)拉曼成像技術(shù)結(jié)合了SERS的靈敏度和共聚焦顯微拉曼的高空間分辨率，使得發(fā)展一種用于活細(xì)胞內(nèi)分子實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的成像手段成為可能。HSERI具有提高高通量分析和直接成像的能力，能為化學(xué)分析提供更多有用的信息58。激光拉曼光譜技術(shù)是一種非侵入性的光散射技術(shù)，能夠無損、無須任何標(biāo)記物標(biāo)記情況下提供豐富的分子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)成分的信息。特

29、別是激光共焦拉曼散射顯微三維掃描技術(shù)，可以100nm的橫向分辨率實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)有關(guān)分子的結(jié)構(gòu)組成，濃度與分布的二維以至三維分布的測(cè)定與成像，還可實(shí)現(xiàn)對(duì)這些參數(shù)隨細(xì)胞內(nèi)外有關(guān)條件改變的動(dòng)態(tài)變化作監(jiān)測(cè)。采用這種技術(shù)，對(duì)各種狀態(tài)的活態(tài)人紅細(xì)胞內(nèi)，其血紅蛋白的分布狀態(tài)，從脫氧到含氧狀態(tài)的動(dòng)態(tài)過渡；淋巴細(xì)胞在有關(guān)因子（如射頻電磁波、UV 射線等）作用下，其 DNA、蛋白、多肽等分子的結(jié)構(gòu)變化及其分布狀態(tài)的變化成像的有關(guān)技術(shù)與方法。包括對(duì)活態(tài)細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)與分布成像的掃描技術(shù)、掃描參數(shù)的優(yōu)化，以及為保證所得樣品拉曼譜線的真實(shí)、可靠性進(jìn)行的系統(tǒng)性能快速測(cè)試、校正方法研究。將顯微激光共焦拉曼光譜技術(shù)用于活態(tài)細(xì)胞

30、檢測(cè)時(shí)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)。在這些研究基礎(chǔ)上，結(jié)合小曝光積分時(shí)間對(duì)剔出譜線外來干擾，并以歸一化結(jié)合基線校正法對(duì)譜線作后處理的方法，建立一種將強(qiáng)度匹配技術(shù)和模型匹配技術(shù)相結(jié)合的二維拉曼成像技術(shù)。并發(fā)展出簡(jiǎn)易的活態(tài)紅細(xì)胞由T態(tài)到R態(tài)的躍遷速率測(cè)定技術(shù)，測(cè)量分析出血紅蛋白結(jié)構(gòu)隨有關(guān)條件變化而動(dòng)態(tài)變化的情況，由此證明不同胞齡紅細(xì)胞具有不同的攜氧能力；揭示了不規(guī)則細(xì)胞內(nèi)分子會(huì)在畸形位置處聚集的現(xiàn)象。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)與拉曼顯微成像相結(jié)合的表面增強(qiáng)拉曼顯微成像將為生物芯片的原位檢測(cè)提供有效手段54, 59, 60。結(jié)語在其他技術(shù)的配合下，SERS標(biāo)記免疫檢測(cè)將不斷地得到更新與進(jìn)步，從而作為一門獨(dú)特的新技術(shù)在生

31、物醫(yī)學(xué)及其他領(lǐng)域的研究中發(fā)揮越來越大的作用。表面增強(qiáng)拉曼光譜作為一種分子結(jié)構(gòu)表征手段，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用方興未艾。從近十年的研究進(jìn)展來看，不論是體表的乳腺和皮膚組織還是體內(nèi)的胃腸道等器官，都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)或者正在努力實(shí)現(xiàn)體內(nèi)檢測(cè)；不論是單個(gè)細(xì)胞的激光拉曼捕集檢測(cè)還是組織切片的二維拉曼掃描，都可以清晰地獲得與組織形態(tài)學(xué)相關(guān)的偽彩色拉曼圖像。因此可以預(yù)料，隨著表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，將會(huì)迎來它歷史上發(fā)展的第三個(gè)春天。參考文獻(xiàn)：1. Pettinger B. Adsorption at Electrode Surface M, New York: VCH, 1992: 2852

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