生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移

1、BRET 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)簡(jiǎn)介：生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）技術(shù)是近10年來(lái)出現(xiàn)的一種新的檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù).它的最大優(yōu)勢(shì)是能在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，因此能夠進(jìn)行相互作用動(dòng)力學(xué)的研究。在應(yīng)用這個(gè)系統(tǒng)研究感興趣的蛋白前，首先需要將Rluc或者EYFP 融合到每個(gè)蛋白或者他們的輔蛋白上。在細(xì)胞中，融合蛋白共表達(dá)，然后和熒光素酶和其底物腔腸素反應(yīng)，當(dāng)能量供體Rluc，能量受體EYFP 之間距離比較近的時(shí)候(10-100Å)，那么光將從Rluc(峰值480nm發(fā)射)傳遞到EYFP，形成它的激發(fā)，并且發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)在530nm 的發(fā)射光，BRET 量化的程度以發(fā)射光53

2、0nm 和480nm 的比率表示。實(shí)驗(yàn)流程1、用于BRET的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；2、融合蛋白表達(dá)檢測(cè)；3、BRET實(shí)驗(yàn)；4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告客戶提供1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆）2、用于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞（如果我公司細(xì)胞庫(kù)有可不需提供）公司提供詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟、使用儀器、及結(jié)果分析等詳細(xì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。服務(wù)周期和價(jià)格具體咨詢本公司熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移-FRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer）指兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能

3、量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。 （1）FRET發(fā)生條件：    能量匹配：供體分子的發(fā)射光譜可以被受體分子吸收并產(chǎn)生熒光信號(hào)。供體分子的發(fā)射光譜應(yīng)與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊（>30%）；    作用距離：供體分子與受體分子的作用距離為1-10nm；    FRET效率公式：用于計(jì)算分子/基團(tuán)間作用距離R     偶極-偶極作用：供體分子與受體分子作用時(shí)的向量必須滿足一定條件。（2）FRET的應(yīng)用：通過(guò)FRET技術(shù)可以獲得有關(guān)兩個(gè)蛋白分子之間相互作用

4、的空間信息（作用距離、作用方向、能量傳遞效率）。常用于解決如下問(wèn)題：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合體；轉(zhuǎn)錄機(jī)制；轉(zhuǎn)化途徑；分子運(yùn)動(dòng)；蛋白折疊等生物學(xué)問(wèn)題。（3）FRET常見(jiàn)的供體-受體熒光分子對(duì)：熒光蛋白類：                                

5、0;                       染料類：FRET檢測(cè)HIV附屬蛋白與細(xì)胞膜CD分子相互作用摘自：A Flow Cytometry-Based FRET Assay to Identify and Analyse Protein-Protein Interactions in Living CellsCarina Banning, Jo¨ r

6、g Votteler, et al. 圖釋：流式細(xì)胞儀FACSAria檢測(cè)FRET信號(hào)。（a）活的293T細(xì)胞分別單獨(dú)轉(zhuǎn)入CFP、YFP、CFP/YFP 、CFP/YFP融合蛋白作為對(duì)照，確定最好的圈門(mén)方式為CFP/FRET。（b）293T細(xì)胞經(jīng)過(guò)2%PFA處理后，YFP熒光強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降。篩選有相互作用的未知蛋白質(zhì)的流程 圖釋：流式細(xì)胞儀FACSAria進(jìn)行FACS-FRET高通量篩選感興趣蛋白相互作用的未知蛋白。（a）FACS-FRET篩選流程。（b）在活的293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Vpu-YFP作為誘餌，與等量的CFP融合蛋白（蛋白的cDNA庫(kù)）相互作用36小時(shí)后，分選FE

7、RT+細(xì)胞。 FRET研究蛋白酶功能摘自：Detection of Infective Poliovirus by a Simple, Rapid, and Sensitive Flow Cytometry Method Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer TechnologyJason L. Cantera  et al. Applied and environmental  microbiology, Jan. 2010, p. 584-588 圖釋：流式細(xì)胞儀 FACSAria檢測(cè)脊髓灰質(zhì)

8、炎病毒（PV1）10倍感染BGM-PV細(xì)胞，8小時(shí)后上機(jī)檢測(cè)。AC病毒濃度分別為0.40.004，D為陰性對(duì)照。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation）是將熒光報(bào)告蛋白按照規(guī)則分成沒(méi)有熒光的兩段，分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合，只有在誘餌蛋白和捕獲蛋白發(fā)生相互作用的情況下，兩段不完整的熒光報(bào)告蛋白才會(huì)形成完整的報(bào)告蛋白，發(fā)出熒光?；罴?xì)胞收集后，在流式細(xì)胞儀中的檢測(cè)是實(shí)時(shí)進(jìn)行的，只要細(xì)胞中有熒光產(chǎn)生就會(huì)被捕捉到信號(hào)，因此，不論是親和力較弱的結(jié)合還是暫時(shí)性的結(jié)合都不會(huì)被遺漏。 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)原理示意圖(a) 誘餌和捕

9、獲蛋白分別攜帶CYFP和NYFP兩段YFP熒光蛋白片段(b) 誘餌和捕獲蛋白結(jié)合同時(shí)CYFP與NYFP形成YFP (c) 形成的YFP發(fā)出熒光（1）BiFC檢測(cè)的特點(diǎn)：    活細(xì)胞分析；    可以用于研究2種或2種以上的啟動(dòng)子調(diào)控之下的蛋白質(zhì)相互作用；    具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以檢測(cè)到（>7nm）。（2）可用于BiFC的熒光蛋白：    GFP、BFP、CFP、YFP，生理?xiàng)l件可用的黃色的Venus和citrine，青色的cerulean；

10、0;   紅色系統(tǒng)：mRFP2Q66T、mCherry；Venus（EYFP的變體）是目前用于 BiFC分析最多的熒光蛋白，因?yàn)槠錈晒鈴?qiáng)且背景敏感度降低，是BiFC分析理想的熒光蛋白。 常見(jiàn)的用于雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的熒光蛋白BiFC研究復(fù)合體中亞基間的相互作用摘自：Detection and Characterization of Influenza A Virus PA-PB2 Interaction through a Bimolecular Fluorescence Complementation AssayJoseph N. Hemerka, Dan Wa

11、ng,et al. JOURNAL OF VIROLOGY, Apr. 2009, p. 3944-3955圖釋：流式細(xì)胞儀 FACSCalibur檢測(cè)流感病毒復(fù)合體中亞基PA-PB2間的相互作用。（B）流式檢測(cè)同時(shí)轉(zhuǎn)入PA/PB2的COS-1細(xì)胞及單轉(zhuǎn)入PA-VC的細(xì)胞的Venus熒光信號(hào)，顯示轉(zhuǎn)入24小時(shí)后的熒光強(qiáng)度。（C）螢火蟲(chóng)熒光蛋白酶顯示，轉(zhuǎn)入單或雙質(zhì)粒的細(xì)胞，螢火蟲(chóng)熒光蛋白酶活性一致。BiFC研究信號(hào)傳導(dǎo)通路中蛋白質(zhì)間的相互作用摘自：Characterization of the latent membrane protein 1 signaling complex of Epst

12、ein-Barr virus in the membrane of mammalian cells with bimolecular fluorescence complementationPooja Talaty, Amanda Emery, et al. Virology Journal 2011, 8:414 圖釋：流式細(xì)胞儀FACSLSRII檢測(cè)BiFC信號(hào)。LMP1-NYFP和LMP1-NYFP突變體分別與CYFP-TRAF2、CYFP-TRAF3轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)其相互作用。曲線藍(lán)色部分為出現(xiàn)YFP的熒光陽(yáng)性表達(dá)，表明LMP1與CYFP、CYFP均存在相互作用?？破找幌耂C

13、I科學(xué)引文索引（Science Citation Index, 簡(jiǎn)稱 SCI ）于1957 年由美國(guó)科學(xué)信息研究所（Institute for Scientific Information, 簡(jiǎn)稱 ISI）在美國(guó)費(fèi)城創(chuàng)辦，是由美國(guó)科學(xué)信息研究所(ISI)1961年創(chuàng)辦出版的引文數(shù)據(jù)庫(kù)。SCI(科學(xué)引文索引 )、EI(工程索引 )、ISTP(科技會(huì)議錄索引 ) 是世界著名的三大科技文獻(xiàn)檢索系統(tǒng)，是國(guó)際公認(rèn)的進(jìn)行科學(xué)統(tǒng)計(jì)與科學(xué)評(píng)價(jià)的主要檢索工具。1976 年，ISI 在 SCI 基礎(chǔ)上引出期刊引用報(bào)告（journal citation report,JCR），提供了一套統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，展示科學(xué)期刊被引用

14、情況、發(fā)表論文數(shù)量以及論文的平均被引用情況。在 JCR 中可以計(jì)算出每種期刊的影響因子（Impact Factor,IF）。影響因子的高低，在一定程度上可以反應(yīng)一個(gè)期刊的影響力。（百度百科）期刊的影響因子(Impact factor；IF)計(jì)算方式：IF 2014 = (該雜志2012-2013年發(fā)表文章在2014年被引用的次數(shù) /  (該雜志2012-2013年發(fā)表文章的總數(shù))附件是最近兩年的SCI期刊列表，2014年植物學(xué)類我紅色標(biāo)注了部分，不過(guò)期刊名都是縮寫(xiě)， 2013年的是全稱期刊名。影響因子從高到低排列，大體代表了期刊的水平檔次。三大國(guó)際頂尖期刊CNS， 指CELL， NATURE， SCIENCE。國(guó)際植物學(xué)專業(yè)期刊中，最好的研究論文期刊是Plant Cell （ IF2004=9.338），當(dāng)然今年新創(chuàng)刊的NATUR