表面微生物檢測方法[1]

1、空氣、食品接觸面微生物檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)1、 目的：檢測生產(chǎn)車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機(jī)械設(shè)備的微生物指標(biāo)，生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境當(dāng)中病原微生物的監(jiān)控，達(dá)到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，以控制食品成品的質(zhì)量。2、 參照標(biāo)準(zhǔn)：中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB159791995、HACCP原理與實(shí)施、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)公共場所空氣微生物檢驗(yàn)方法細(xì)菌總數(shù)測定GB/T 18204.12000、中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、 出入境檢驗(yàn)檢疫局二000四年出入食品微生物檢驗(yàn)培訓(xùn)教材中出入食品生產(chǎn)廠衛(wèi)生細(xì)菌檢驗(yàn)方法、日本東

2、京冷凍食品檢驗(yàn)方法。3、 采樣與檢測方法：3.1空氣的采樣與測試方法3.1.1樣品采集：(1)取樣頻率：a)車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時(shí)，在加工前進(jìn)行采樣，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。b)全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進(jìn)行采樣。c)產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)及時(shí)對(duì)車間進(jìn)行采樣，如有檢驗(yàn)不合格點(diǎn)，整改后再進(jìn)行采樣檢驗(yàn)。d)實(shí)驗(yàn)性新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定頻率采樣檢驗(yàn)。e)正常生產(chǎn)狀態(tài)的采樣，每周一次。（2）采樣方法在動(dòng)態(tài)下進(jìn)行，室內(nèi)面積不超過30 m2，在對(duì)角線上設(shè)里、中、外三點(diǎn)，里、外點(diǎn)位置距墻1 m；室內(nèi)面積超過30 m2，設(shè)東、西、南、北、中五點(diǎn)，周圍4點(diǎn)距墻1 m。采樣時(shí)，將含平板計(jì)數(shù)瓊脂培

3、養(yǎng)基的平板(直徑9 cm)置采樣點(diǎn)(約桌面高度)，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5 min。采樣后必須盡快對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測，送檢時(shí)間不得超過6h，若樣品保存于04條件時(shí)，送檢時(shí)間不得超過24h。3.1.2菌落培養(yǎng)：（1）在采樣前將準(zhǔn)備好的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板置37±1 培養(yǎng)24 h，取出檢查有無污染，將污染培養(yǎng)基剔除。（2）將已采集樣品的培養(yǎng)基在6 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，細(xì)菌總數(shù)于37±1培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)平板上細(xì)菌菌落數(shù)。（3）菌落計(jì)算：a) 記錄平均菌落數(shù)，用“個(gè)/皿”來報(bào)告結(jié)果。用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用51

4、0倍放大鏡檢查，不可遺漏。b) 若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2 個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。3.2工作臺(tái)（機(jī)械器具）表面與工人手表面采樣與測試方法：3.2.1樣品采集：(1)取樣頻率：a)車間轉(zhuǎn)換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時(shí)，在加工前進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況。b)全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前，進(jìn)行全面擦拭檢驗(yàn)。c)產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果超內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)及時(shí)對(duì)車間可疑處進(jìn)行擦拭，如有檢驗(yàn)不合格點(diǎn)，整改后再進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)。d)實(shí)驗(yàn)新產(chǎn)品，按客戶規(guī)定擦拭頻率擦拭檢驗(yàn)。e)對(duì)工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時(shí)，進(jìn)行擦拭檢驗(yàn)。f)正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭，每周一次。（2） 采樣方法： a) 工作臺(tái)（機(jī)械器具

5、）：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面（取與食品直接接觸或有一定影響的表面）取25cm2 的面積，在其內(nèi)涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。b) 工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。（3）采樣注意事項(xiàng)：擦拭時(shí)棉簽要隨時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)，保證擦拭的準(zhǔn)確性。對(duì)每個(gè)擦拭點(diǎn)應(yīng)詳細(xì)記錄所在分場的具體位置、擦拭時(shí)間及所擦拭環(huán)節(jié)的消毒時(shí)間3.2.2 細(xì)菌·大腸菌群的檢測培養(yǎng):樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如污染

6、嚴(yán)重，可十倍遞增稀釋，吸取1ml 1：10樣液加9ml無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。 3.2.2.1 細(xì)菌總數(shù)：（1）以無菌操作，選擇12個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿（平行樣），將已融化冷至45左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。（2）待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36±1 培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。（3）結(jié)果報(bào)告：報(bào)告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù) 3.2.2.2大腸菌群：（1）平板法:a) 以無菌操作，選擇12個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿（平行樣），將已融化冷至45左

7、右的去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養(yǎng)基，約3-5 ml。b) 待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，置36±1 培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。c) 結(jié)果計(jì)算： 以平板上出現(xiàn)紫紅色菌落的個(gè)數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得出。d) 結(jié)果報(bào)告：報(bào)告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數(shù)（2）試管法:a) 以無菌操作，選擇3個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別接種到BGLB肉湯培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種三管。b) 置BGLB肉湯管于36±1培養(yǎng)48±2h。記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。c) 結(jié)果報(bào)告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每25cm2食品接觸面中或

8、每只手的大腸菌群值。3.2.3 金黃色葡萄球菌檢測（1）定性檢測a) 取1ml 稀釋液注入滅菌的平皿內(nèi)，傾注15-20ml的B-P培養(yǎng)基，（或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板），放進(jìn)36±1的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2小時(shí)。b) 從每個(gè)平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。c) 結(jié)果報(bào)告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)為陽性，即報(bào)告手（工器具）上有金黃色葡萄球菌存在。（2）定量檢測a) 以無菌操作，選擇3個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別接種到含10氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種三管。b) 置肉湯管于36±

9、1的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36±1 培養(yǎng)4548小時(shí)。c) 從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養(yǎng)基，36±1培養(yǎng)2024小時(shí)。d) 取肉湯培養(yǎng)物做血漿凝固酶試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。e) 報(bào)告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗(yàn)結(jié)果，查MPN表報(bào)告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。3.3工廠環(huán)境中病原體的檢測計(jì)劃與方法檢測計(jì)劃：為了保證食品安全，工廠應(yīng)該對(duì)生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進(jìn)行檢測和評(píng)估，檢測項(xiàng)目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗(yàn)室應(yīng)該按照一定的計(jì)劃對(duì)生產(chǎn)場所環(huán)境中的病原體進(jìn)行檢測，其中包括地面、下

10、水道、 排水溝、墻壁、天花板、設(shè)備框架、運(yùn)輸?shù)闹Ъ埽洳匮b置、速凍機(jī)、傳送帶、設(shè)備的螺絲、維修工具等部位。當(dāng)某個(gè)點(diǎn)檢測到病員微生物時(shí)，應(yīng)該對(duì)環(huán)境中的相似點(diǎn)加大檢測頻率；在把所有的預(yù)定點(diǎn)檢測完后，應(yīng)該對(duì)環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進(jìn)行全面評(píng)估，在下一次環(huán)境檢測循環(huán)過程中加強(qiáng)檢測容易出現(xiàn)病原體的環(huán)境點(diǎn)，達(dá)到持續(xù)改進(jìn)的目的。檢測頻率: 每月兩次,每次每個(gè)區(qū)域至少選取5個(gè)檢測點(diǎn),分別進(jìn)行檢測。3.3.1 環(huán)境李斯特菌的檢測方法（3MTM PetrifilmTM 環(huán)境李斯特菌的測試片）3.3.1.1 用涂抹棒，海綿或者其他采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。3.3.1.2 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，

11、將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫（20-30）1小時(shí)，最久不超過1.5小時(shí)，以修復(fù)損傷的李斯特菌。3.3.1.3 將測試片放在平坦處，掀起上層膜。3.3.1.4 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。3.3.1.5 輕輕將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上，不要壓，扭轉(zhuǎn)或者滑動(dòng)壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。3.3.1.6 將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37±1培養(yǎng)26-30小時(shí)，可以用標(biāo)準(zhǔn)菌落記數(shù)器或者其他光學(xué)放大器判讀，不要記數(shù)圓形輪廓上的菌落，因?yàn)樗麄儾皇苓x擇性培養(yǎng)基的影響。3.3.1.7 對(duì)于定性檢測，根據(jù)紫紅色菌落是

12、否存在，結(jié)果記為檢出或者未檢出。3.3.2 環(huán)境中沙門氏菌的檢測方法3.3.2.1采樣地點(diǎn): 選取采樣點(diǎn)時(shí)因盡量選取微生物容易滋生的地方 冷凍車間FD車間東區(qū)初加工傳遞窗口表面、排水溝、排水溝出口、墻壁、地面卸料間墻壁、墻角、地面、天花板、物料車表面東區(qū)精加工地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動(dòng)機(jī)鏈條、天花板暫存間墻壁、地面、天花板、墻角、墻縫西區(qū)初加工傳遞窗口表面、地面、墻壁、排水溝、排水溝出口挑選間墻壁、地面、天花板、墻角、墊板西區(qū)精加工地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動(dòng)機(jī)鏈條、天花板包裝室墻壁、地面、天花板、金探傳送帶表面、落地料存放處3.3.2.2 操作步驟3.3.2.2

13、.1采樣應(yīng)在生產(chǎn)開始后進(jìn)行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉(zhuǎn)涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。 3.3.2.2.2將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，每5個(gè)點(diǎn)混合成一個(gè)樣品, 登記編號(hào),按照SN0170-92標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)檢測，若有陽性結(jié)果出現(xiàn)，應(yīng)逐步對(duì)所混合的每個(gè)點(diǎn)分別檢測。物體表面涂抹菌落總數(shù)計(jì)算方式：物體表面細(xì)菌總數(shù)（cfu/c）=平皿上菌落的平均數(shù)*采樣液稀釋倍數(shù)/采樣面積（cm2）根椐GB159792002一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn),生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生指標(biāo)1 裝配與包裝車間空氣中細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)2 500 cfu/m3。2 工作臺(tái)表面細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)20 cfu/cm2。3. 工人手表面細(xì)

14、菌菌落總數(shù)應(yīng)300 cfu/只手，并不得檢出致病菌。人員和環(huán)境衛(wèi)生檢測方法一、        空氣采樣及檢驗(yàn)方法1培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂平板，按GB4789.28中3.7條配制2采樣（空氣沉降法）2.1布點(diǎn)：面積小于30平方米的車間，設(shè)一對(duì)角線，在線上取3點(diǎn)，即中心一點(diǎn)，兩端在距墻1米處各取一點(diǎn)；面積大于30平方米的車間，設(shè)東、西、南、北、中5個(gè)點(diǎn)，其中東、西、南、北點(diǎn)均距墻1米。2.2采樣高度：與地面垂直高度80-150厘米。2.3采樣方法；用直徑為9厘米的普通營養(yǎng)瓊脂平板在采樣點(diǎn)上暴露20分鐘蓋上送檢培養(yǎng)。3培養(yǎng)：于37培養(yǎng)24小時(shí)

15、。4檢測頻率：每周空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：生車間、熟車間、成品車間：低于100個(gè)半成品庫、成品庫：低于10個(gè)二、設(shè)備的采樣與檢驗(yàn)方法根據(jù)生產(chǎn)過程所要求的重點(diǎn)衛(wèi)生部位，實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行涂抹采樣，進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)。1采樣方法1.1涂抹法（適用于表面平坦的設(shè)備和工器具產(chǎn)品接觸面）取經(jīng)過滅菌的鋁片框（框內(nèi)面積為50平方厘米）放在需檢查的部位上，用無菌棉球蘸上無菌生理鹽水擦拭鋁片中間方框部分，擦完后立即將棉球投入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。1.2貼紙法（適用于表面不平坦的設(shè)備和工器具接處面）將無菌規(guī)格紙（5×5厘米，紙質(zhì)要薄而軟）用無菌生理鹽水泡濕后，于需測部分分別貼上兩張

16、，兩張紙面積共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。2檢驗(yàn)方法2.1細(xì)菌總數(shù)的檢驗(yàn)將上述樣液充分振搖，根據(jù)衛(wèi)生情況，相應(yīng)地做10倍遞增稀釋，選擇其中2-3個(gè)合適的稀釋度作平皿傾注培養(yǎng)，培養(yǎng)基用普通營養(yǎng)瓊脂，每個(gè)稀釋度作2個(gè)平皿，每個(gè)平皿注入1毫升樣液，于37培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)菌落數(shù)。結(jié)果計(jì)算表面細(xì)菌總數(shù)（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均數(shù)×樣液稀釋倍數(shù)/30×22.2致病菌的檢驗(yàn)沙門氏菌，參照GB4789.4進(jìn)行金黃色葡球菌，參照GB7918.5進(jìn)行4.檢驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)菌總數(shù)10100個(gè)cm2，5.關(guān)鍵點(diǎn)：細(xì)菌總數(shù)10個(gè)cm2

17、一般區(qū)域：細(xì)菌總數(shù)100個(gè)cm2三、人員手表面細(xì)菌污染情況的檢驗(yàn)1.        采樣方法：用一支蘸有無菌生理鹽水的棉拭子涂擦被檢對(duì)象手的全部，反復(fù)兩次，涂擦的時(shí)候棉拭子要相應(yīng)地轉(zhuǎn)動(dòng)，擦完后，將手接觸部分剪去，將棉拭子放入裝有10毫升無菌生理鹽水的試管內(nèi)送檢培養(yǎng)。2.        檢驗(yàn)方法：同工器具表面細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法。3.        結(jié)果計(jì)算：每只手表面的細(xì)菌總數(shù)（cfu/只手）=平皿上菌落的平均數(shù)

18、5; 樣液稀釋倍數(shù)四、消毒液藥效的微生物學(xué)鑒定法1采樣對(duì)象：正常使用的消毒液，和已知配制好備用的消毒液2采樣及檢驗(yàn)方法在無菌條件下，用無菌吸管吸取1毫升樣液，加入9毫升稀釋液中混勻，對(duì)于醇類與酚類消毒劑，稀釋液用普通營養(yǎng)肉湯即可；對(duì)于含氯消毒劑、含碘消毒劑，需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉，對(duì)洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在肉湯中加入3%（W/V）土溫80和0.3%卵磷脂；對(duì)醛類消毒劑，需在肉湯中加入0.3%甘氨酸；對(duì)于含有表面活性劑的各種復(fù)方消毒劑，需在肉湯中加入（W/V）土溫80，以中和被檢樣液中的殘效作用，將注入了樣液的稀釋液充分搖勻，取1毫升注入平皿，隨之倒入普通營養(yǎng)瓊脂，待瓊脂凝固后，翻

19、轉(zhuǎn)平皿，將平皿于37條件下培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)平板上生長的菌落數(shù)。3結(jié)果分析平板上有菌生長，表明被檢樣液中有殘存活菌，若每個(gè)平板菌落數(shù)在10個(gè)以下，仍可用于消毒，若每個(gè)平板菌落數(shù)超過10個(gè)，說明每毫升被檢樣液含菌量已超過100個(gè)，即不宜在用于消毒。該公式是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)公式.它的理論模式依據(jù)是:100CM2的面積上10MIN降落的菌落數(shù),等于1升空氣中所含的細(xì)菌總數(shù).系數(shù)50000基于上述假說和單位換算而來.細(xì)菌總數(shù)(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT    5/10T:實(shí)際放置了5MIN;    100/A:A單一培養(yǎng)皿面積;    1000:1M3=1000L啊,換算成m31、空氣細(xì)菌落菌數(shù)單位既然是cfu/m3，那采樣時(shí)應(yīng)該還要記錄放置平皿的高度。2、食品安全管理體系中罐頭行業(yè)有個(gè)標(biāo)準(zhǔn)如下：   落下菌數(shù)