ATP熒光法微生物細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)系統(tǒng)

1、ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)使用說明書第一部分 ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)介1、系統(tǒng)原理32、組成部件及相關(guān)功能43、應(yīng)用領(lǐng)域、特點(diǎn)、效益44、檢測(cè)注意事項(xiàng)及操作步驟45、ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)及故障排除96、對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線107、有關(guān)食品安全和衛(wèi)生檢測(cè)的問答118、具體樣品檢測(cè)的操作方法及方案14第二部分 ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)使用說明1、技術(shù)參數(shù)及性能232、儀器操作說明242. 1開機(jī)、初始化242.2參數(shù)設(shè)置24*2. 2. 1 選擇 RLU 方式252. 2. 2選擇其它樣品名方式252. 2. 3設(shè)置文件類型262. 2. 4設(shè)

2、置日期時(shí)間272. 2. 5設(shè)置檢測(cè)時(shí)間272. 2.6 U盤格式化272.3測(cè)試272.4查詢282. 4.1查詢測(cè)試結(jié)果282. 4. 1. 1刪除測(cè)試結(jié)果292. 4. 1. 2冊(cè)U除文件292. 4. 2查詢文件信息302. 4. 3查詢儀器信息302. 4. 4查詢電池電量302. 4. 5快速查詢302.5通訊323、上位機(jī)軟件333.1 軟件安裝333.2 驅(qū)動(dòng)程序的安裝363.3 軟件啟動(dòng)383.4 軟件運(yùn)行393.5 樣品及回歸方程設(shè)定403.6 6 “文件名”說明413. 7文件、記錄操作和數(shù)據(jù)庫424、電池充電435、保修43第一部分ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)

3、系統(tǒng)簡(jiǎn)介1、系統(tǒng)原理螢火蟲會(huì)發(fā)光是由于它能合成將化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎?螢火蟲熒光素酶（簡(jiǎn)稱蟲光素酶，luciferase）、蟲熒光素（D-luciferin）以及所有 細(xì)胞生物都產(chǎn)生的生物能量物質(zhì)一三磷酸腺首（ATP）。在有氧的條件下，蟲光素 酶催化蟲熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光，其生化 反應(yīng)式如下：.“0ATP+D-Luciferin+O2 Mg+> AMP+Oxyluciferin+PPi + CO2+LightLuciferase上式表明，只要具備適當(dāng)條件，不僅螢火蟲，即使在試管中也能發(fā)出熒光。當(dāng) 反應(yīng)系統(tǒng)中，蟲光素酶和蟲熒光素處于過量

4、的情況下，熒光的強(qiáng)弱取決于ATP的數(shù) 量。以檢測(cè)含細(xì)菌的樣品為例，細(xì)菌細(xì)胞越多，ATP量越高，發(fā)出的熒光也就越強(qiáng)。 由于蟲光素酶對(duì)ATP的反應(yīng)非常靈敏，熒光強(qiáng)弱可通過熒光儀1015秒內(nèi)計(jì)量。所 以，在排除樣品中非細(xì)菌ATP干擾的情況下，通過熒光值就能確定樣品中細(xì)菌ATP 的含量，從而確定細(xì)胞數(shù)量，因此，此系統(tǒng)為半定量快速檢測(cè)系統(tǒng)。維持胞內(nèi)ATP濃度的相對(duì)恒定，是ATP在細(xì)胞代謝中發(fā)揮中心作用的關(guān)鍵。每 個(gè)細(xì)胞的ATP量與胞內(nèi)容積成正比，但ATP量與菌落形成單位（colony-forming units二cfu）之間卻常常偏離這種關(guān)系，主要原因是樣品中細(xì)菌細(xì)胞與細(xì)胞碎片彼 此聚集成團(tuán)，這種效應(yīng)曾

5、在大腸桿菌培養(yǎng)物這種單一菌群模式系統(tǒng)中有過描述，一 個(gè)菌落有可能由單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增形成；另一種原因是檢測(cè)者沒有對(duì)樣品作適當(dāng) 的預(yù)處理，比如沒有去除胞外游離ATP。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，不同種類細(xì)菌中的ATP 含量不同，由于細(xì)菌ATP含量都處于10-由01數(shù)量級(jí)，細(xì)微差別忽略不計(jì)，均值約 為2.5X10-i8mo1。對(duì)于同種細(xì)菌，影響細(xì)胞內(nèi)ATP含量的因素也很多，生長(zhǎng)階段、 培養(yǎng)基種類、有氧無氧以及代謝抑制物的存在，都會(huì)影響細(xì)胞數(shù)和熒光值的對(duì)應(yīng)關(guān) 系。實(shí)測(cè)表明處于同一生長(zhǎng)狀態(tài)和批次樣品中的ATP是相對(duì)恒定的，即在同一環(huán)境 中微生物種類及生長(zhǎng)情況固定，其ATP含量也相對(duì)恒定。2、組成部件及相關(guān)功能2

6、.1 試劑組，按檢測(cè)操作順序分為：（1）體細(xì)胞裂解試劑（TRA）,能專一而有效地裂解樣品中的非細(xì)菌細(xì)胞（主 要為體細(xì)胞）并釋出ATP，然后通過過濾比色杯底部的濾膜將其排除。（2）細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑（XRA），能專一而有效地裂解樣品中細(xì)菌細(xì)胞并釋出 ATP。（3）熒光反應(yīng)試劑組（LLR），能與細(xì)菌ATP相互作用并有效地發(fā)出熒光。（4）物表清潔度檢測(cè)試劑組（SCR），能與物體表面ATP相互作用并有效地發(fā)出熒光。Q2.2 微量熒光檢測(cè)儀（也稱微量光度計(jì)），準(zhǔn)確計(jì)量檢樣的熒光值。2.3 可供100次測(cè)定的樣品預(yù)處理耗材。（1）過濾比色杯的杯架一個(gè)，用于固定過濾比色杯。V-/（2）加壓器一個(gè)，用于加壓、排

7、出體細(xì)胞ATP和試劑組。（3）帶濾膜熒光反應(yīng)比色杯100個(gè)，為熒光反應(yīng)容器。（4）專用無菌吸水紙，置于過濾比色杯架，吸收加壓后流出的液體。（5）帶密封圈專用無菌濃縮器，用于濃縮樣品。（6）自備微生物學(xué)無菌操作所需常規(guī)用具、器皿，樣品采集無菌、無ATP的 容器、塑料袋、手套、鑷子等。3、應(yīng)用領(lǐng)域、特點(diǎn)、效益使用ATP熒光法細(xì)菌快檢儀實(shí)施食品、飲料、乳品加工等全程衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè)生產(chǎn)程序監(jiān)測(cè)內(nèi)容加工生產(chǎn)前生產(chǎn)設(shè)施清潔、消毒效果檢測(cè)，原、輔料細(xì)菌總數(shù)檢 測(cè)U，以保障原料質(zhì)量或明確原料品質(zhì)級(jí)別。加工生產(chǎn)過程中生產(chǎn)設(shè)備關(guān)鍵控制點(diǎn)（例如供水、通風(fēng)閥門）衛(wèi)生學(xué) 監(jiān)測(cè)，影響乳品發(fā)酵飲料、酒類特殊微生物總數(shù)檢測(cè)。加工

8、生產(chǎn)后制成品污染細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)。廢棄物排放、環(huán)境、人員衛(wèi)生學(xué)及細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)。4、檢測(cè)注意事項(xiàng)及操作步驟4.1 試劑的準(zhǔn)備和注意事項(xiàng)：4.1.1 本公司提供的“ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快檢系統(tǒng)”所含試劑組與微量熒光 檢測(cè)儀需匹配使用，不可用其它試劑替代。4.1.2 LLR試劑（含螢火蟲熒光素酶和D-熒光素）應(yīng)在冰箱冷凍室-20中貯存， 有效期6個(gè)月。LLR試劑組易變質(zhì)，室溫下不高于25時(shí)不得超過24小時(shí)，在0-4 有效期為5天。4.1.3 試劑（LLR）在用于檢測(cè)前按規(guī)定低溫存放，檢測(cè)前20分鐘取出平衡到 室溫方可應(yīng)用。如果超過有效期，應(yīng)棄用，重新購置。體細(xì)胞裂解試劑（TRA）及 細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑（X

9、RA）可處于室溫下保存，2-8下保存效果最佳。4.1.4 ，螢火蟲熒光素酶對(duì)ATP極其敏感，生物材料容易引起ATP交叉污染， 所以檢測(cè)應(yīng)盡量滿足微生物學(xué)常規(guī)無菌操作，才能取得準(zhǔn)確、真實(shí)的檢測(cè)數(shù)據(jù)。4.2 樣品采集和預(yù)處理簡(jiǎn)介J非生理?xiàng)l件下，細(xì)菌細(xì)胞的ATP濃度將急速下降，但也同樣擁有快速補(bǔ)償機(jī)制 以維持胞內(nèi)ATP濃度相對(duì)穩(wěn)定，保障生命活動(dòng)正常進(jìn)行。因此，在采集細(xì)菌樣品或 進(jìn)行預(yù)處理時(shí)要注意下列事項(xiàng)。4.2.1 為避免離心濃縮一類非生理狀況的步驟出現(xiàn)，可使用注射器將樣品轉(zhuǎn)移到 一次性濾膜上。如需洗滌細(xì)胞，應(yīng)用無菌、無ATP的PBS緩沖液淋洗，以免影響 胞內(nèi)ATP濃度。4.2.2 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)時(shí)，常用

10、涂抹法或用棉拭子擦拭采集樣品，但此法對(duì)于有生物膜 結(jié)構(gòu)的細(xì)菌并非最佳方式，其一，細(xì)胞收集率不高；其二，棉花纖維干擾光檢測(cè)。 可改進(jìn)為用滴瓶將ATP提取液滴加到待檢表面，用海綿簽收集ATP后進(jìn)行光檢。4.2.3 細(xì)胞的ATP含量與細(xì)胞大小成正比，體細(xì)胞和酵母細(xì)胞的ATP含量大約 分別是細(xì)菌細(xì)胞的1000倍和100倍，但ATP量和菌落形成單位（cfu）之間常常偏 離這種關(guān)系，理論上每個(gè)活細(xì)胞都形成一個(gè)菌落，而實(shí)際上細(xì)胞彼此聚集常常出現(xiàn) 二個(gè)或幾個(gè)活細(xì)胞形成一個(gè)菌落的情況。4.2.4 樣品預(yù)處理?？捎肁TP降解酶如三磷酸酶（apyrase）去除非細(xì)菌ATP, 用溫和的去污劑如TritonX-100去

11、除樣品中體細(xì)胞ATP,也可使用上述兩種制劑同 時(shí)處理。不同試劑的處理效果因樣品而異，試劑的選擇和搭配需經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定。4.3 檢測(cè)樣品的預(yù)處理：（操作過程中需配戴一次性無菌手套）必須用無菌、無ATP的PBS溶液:磷酸二氫鉀34g； 1mol/L氫氧化鈉溶液175mL； 蒸餾水825mL； pH7.2；使用時(shí)將上述溶液吸取1.25ml，定容至1000ml，滅菌后備 用。小實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌：在室溫條件下用不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗滌樣品細(xì)胞3次，最后用1ml同種PBS緩沖液懸浮樣品細(xì)胞。物表清潔程度：將無菌棉簽頭部用TRA試劑潤濕，在10cmX 10cm范圍內(nèi)進(jìn) 行涂抹，涂抹時(shí)需不斷旋

12、轉(zhuǎn)棉簽頭部，用1ml PBS緩沖液（不含鈣、鎂離子）浸泡 棉簽頭部，從PBS緩沖液中吸出50 l待測(cè)。液體樣品：純凈水、自來水等細(xì)菌含量較低的樣品需按比例濃縮；牛乳、果汁 等濃度較大無法通過濾膜洗滌的樣品需按比例稀釋，稀釋液應(yīng)使用PBS （如使用國 標(biāo)生理鹽水，檢測(cè)數(shù)值會(huì)偏低）。液體被檢樣品含細(xì)菌細(xì)胞數(shù)若高于1000cfu/ml,可 直接抽取50可被檢樣品進(jìn)行測(cè)試；液體被檢樣品含細(xì)菌細(xì)胞數(shù)若低于1000cfu/ml, 應(yīng)進(jìn)行濃縮處理。濃縮方法如下：打開專用濃縮器，用無菌鑷子取無菌過濾比色杯放入專用濃縮器內(nèi)，注意上下膠圈 放好，以免濃縮樣品時(shí)發(fā)生泄露，擰緊濃縮器。用一次性無菌醫(yī)用針管抽取10ml

13、 或其整倍數(shù)的被檢樣品，接到專用濃縮器上進(jìn)行濃縮，用適當(dāng)?shù)膲毫従彽赝峦?注射器的柱塞（此時(shí)被檢液體樣品中的細(xì)菌被過濾比色杯的微孔濾膜截留，液體部 分通過濾膜被排出）直到注射器與濃縮器中的液體部分完全被推出；擰開濃縮器， 用消毒過的鑷子從濃縮器中取出過濾比色杯備用。固體樣品處理：無菌操作稱取25g被檢固體樣品溶于225mlPBS溶液中，然后 把處理好的懸濁液用滅菌后的濾紙進(jìn)行粗濾，抽取過濾后基本澄清無肉眼可見懸濁 物液體進(jìn)行測(cè)試。（注：溶于PBS后所測(cè)結(jié)果為每克樣品稀釋10倍后所得光值）。特殊樣品處理：如需檢測(cè)高鹽、高糖、深加工產(chǎn)品，含抑菌劑、色素類樣品需增加TRA洗滌次數(shù)，洗滌5次為佳。冷

14、藏或冷凍樣品中微生物所含ATP會(huì)降低，如 需檢測(cè)冷凍的肉類、面食等，需使樣品完全解凍至室溫后再進(jìn)行檢測(cè)。4.4 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線制定步驟4.4.1 用雙蒸水將濃度為1mM的ATP溶液，按1： 10梯度比例制備成10011mol、 10pmol、1pmol、100nmol、10nmol 及 1nmol 系列溶液。4.4.2 用微量移液器吸取50可熒光反應(yīng)試劑組（LLR），加入熒光反應(yīng)比色杯中， 然后分別加入5可稀釋后的各梯度ATP溶液，用微量熒光檢測(cè)儀檢測(cè)RLU值，重 復(fù)上述步驟，得到系列ATP溶液數(shù)據(jù)。.4.4.3 以RLU值為縱座標(biāo)，對(duì)應(yīng)ATP濃度系列為橫座標(biāo)作圖。在1nmol-1pmolAT

15、P 濃度范圍內(nèi)，ATP濃度與相應(yīng)RLU之間存在線性關(guān)系。了標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液可以作為鑒定LLR試劑組是否失效及失效程度的陽性對(duì)照。如 按4.4.2步驟加入1nmolATP溶液時(shí)RLU值低于200，表示開始失效，應(yīng)棄用。4.5 樣品檢測(cè)步驟：X J4.5.1 開機(jī)4.5.1.1 打開儀器電源前，拉開儀器抽屜，確保抽屜小槽內(nèi)清潔無異物，關(guān)閉抽 屜。4.5.1.2 打開電源，進(jìn)行初始化及參數(shù)設(shè)置。（詳見操作說明）4.5.1.3 準(zhǔn)備測(cè)試時(shí)，返回到主菜單界面（如下圖），光標(biāo)移動(dòng)到“測(cè)試”選項(xiàng)。測(cè)試查 詢 參數(shù)設(shè)置 通 訊4.5.2 試劑組本底的測(cè)定4.5.2.1 取出比色杯架，中間墊放5張專用吸水紙，將未

16、放置樣品的過濾比色杯 放入架孔內(nèi)。4.5.2.2 拿起TRA體細(xì)胞裂解試劑，向杯中滴加4滴，再用加壓器置杯頂加壓， 排出杯中所有液體，由吸水紙吸凈。重復(fù)上述步驟一次。4.5.2.3 拉開抽屜后，屏幕顯示準(zhǔn)備測(cè)試狀態(tài)（如下圖）。從杯架上取下過濾比 色杯置于儀器可拉動(dòng)抽屜小孔內(nèi)。準(zhǔn)備測(cè)試74.5.2.4 拿起XRA細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，垂直滴加2滴于杯中。4.5.2.5 用移液器從LLR試劑瓶吸取熒光反應(yīng)試劑50可加入杯底，緩和地吸擠 三次混勻。關(guān)閉抽屜，開始測(cè)試。（注意：加入LLR試劑后，反應(yīng)已經(jīng)開始，所以 操作應(yīng)該迅速，務(wù)求操作時(shí)間一致，對(duì)樣品測(cè)試達(dá)到平行數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。測(cè)量完畢 前不可再拉動(dòng)抽屜。

17、）4.5.2.6 本底空白R(shí)LU讀數(shù)應(yīng)低于200，如讀數(shù)過高，則提示過濾比色杯或試劑 有污染。J* NO4.5.3 樣品測(cè)定4.5.3.1 取出比色杯架，中間墊放5張專用吸水紙，將含濃縮后樣品的過濾比色 杯放入架孔內(nèi)（不需濃縮的液體樣品用移液器直接吸取被檢樣50可注入過濾比色杯 內(nèi)進(jìn)行測(cè)試）。*4.5.3.2 拿起TRA體細(xì)胞裂解試劑，向杯中滴加4滴，再用加壓器置杯頂加壓， 排出杯中所有液體，由吸水紙吸凈。重復(fù)上述步驟一次。4.5.3.3 拉開抽屜后，屏幕顯示準(zhǔn)備測(cè)試狀態(tài)（如下圖）。從杯架上取下過濾比 色杯置于儀器可拉動(dòng)抽屜小孔內(nèi)。準(zhǔn)備測(cè)試4.5.3.4 拿起XRA細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，垂直滴加2

18、滴于杯中。4.5.3.5 用移液器從LLR試劑瓶中吸取熒光反應(yīng)試劑50可加入杯底，緩和地吸 擠三次混勻。關(guān)閉抽屜，開始測(cè)試。（注意：加入LLR試劑后，反應(yīng)已經(jīng)開始，所 以操作應(yīng)該迅速，務(wù)求操作時(shí)間一致，對(duì)樣品測(cè)試達(dá)到平行數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵）4.5.3.6 根據(jù)“參數(shù)設(shè)置”所選測(cè)定模式，屏幕顯示相應(yīng)的測(cè)試結(jié)果。4.6 清潔程度標(biāo)準(zhǔn)快速制訂步驟：4.6.1 確定質(zhì)控點(diǎn)和關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)。4.6.2 清潔產(chǎn)品表面，重復(fù)二到三次以到達(dá)最佳清潔度。4.6.3 建議結(jié)合平皿計(jì)數(shù)和RLU值設(shè)定自己的初始化數(shù)值。4.6.4 連續(xù)幾天在不同位置進(jìn)行ATP衛(wèi)生監(jiān)控檢測(cè)，得出20-50個(gè)結(jié)果。計(jì)算這些RLU數(shù)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏

19、差（s.d）。4.6.5 計(jì)算通過標(biāo)準(zhǔn)RLU平均數(shù)值。4.6.6 將通過標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量增加2到3倍即為不合格值。4.6.7 警告值介于合格與污染值之間。4.6.8 定期重新計(jì)算以更新限定值，不斷提高標(biāo)準(zhǔn)。人5、ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)、故障排除5.1 ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)：入J5.1.1 檢測(cè)完畢后，須將微量熒光檢測(cè)儀做適當(dāng)清潔以免下次使用時(shí)交叉污染。 儀表外部可用干凈的微濕布巾擦拭，可拉動(dòng)抽屜可用沾有少許異丙醇或酒精的棉簽 擦拭。5.1.2 為保持檢測(cè)工作臺(tái)不受污染，可用75%醫(yī)用酒精擦拭桌面，或在超凈臺(tái)內(nèi) 操作。5.1.3 操作時(shí)要戴一次性無菌手套，或用75%醫(yī)用酒精擦拭雙手以免試劑、臺(tái)

20、面 污染。5.1.4 臨用前套上無菌移液管尖，使用移液器吸取或轉(zhuǎn)移試劑、樣品時(shí)務(wù)求準(zhǔn)確， 避免移液器與樣品或試劑交叉污染。5.1.5 完成檢測(cè)后，立即取下過濾比色杯。未取出前，避免晃動(dòng)或倒置微量熒光 檢測(cè)儀以免杯內(nèi)試劑濺出污染光學(xué)部件。5.1.6 冷藏或冷凍樣品將導(dǎo)致其中微生物（細(xì)菌）細(xì)胞ATP量變化明顯，應(yīng)于 避免，或待完全解凍平衡至室溫后再做檢測(cè)并設(shè)置對(duì)照。5.1.7 高鹽、高離子、高糖或高油脂組份將干擾ATP檢測(cè)，重復(fù)加入體細(xì)胞裂 解試劑（TRA）可改善。5.2 故障排除：故障可能原因排除方法在無過濾比色杯或樣品情況下，可拉動(dòng)抽屜1、抽屜被樣品污染2、光敏部件有誤1、用酒精擦抽屜去除污染

21、2、更換或檢修測(cè)光儀1、電池電量不足2、斷電3、可拉動(dòng)抽屜關(guān)閉不嚴(yán)1、如顯示電池電量不足，需充電2、查對(duì)供電情況3、重新關(guān)閉抽屜1、試劑過期，失效2、加入LLR試劑后沒 有立即關(guān)閉抽屜讀數(shù)3、樣品經(jīng)冷凍或冷藏后 使其中的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi) ATP量顯著降低1、及時(shí)更換試劑2、更換樣品，重新試驗(yàn)讀數(shù)3、待樣品及試劑恢復(fù)到室溫 后再測(cè)定推入后，仍顯示高背景 讀數(shù)有樣品的可拉動(dòng)抽屜推入后無讀數(shù)給出的讀數(shù)顯著低于應(yīng)有讀數(shù)6、對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線26.1 ATP濃度和相應(yīng)熒光值（RLU）關(guān)系曲線(In七)刨泥聯(lián)友哭ATP 儂度（attorned）與分別表示采用本公司提供的微量熒光檢測(cè)儀及美國New Horizons公司

22、 PROFILE-1-3560微量熒光檢測(cè)儀所得結(jié)果。分別以log相對(duì)熒光值（RLU）、logATP濃度（atto mol）值為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)作圖（y = 0.8362x + 1.175, R2= 0.9866）。上圖表明，在ATP濃度為 1pmol1nmol范圍內(nèi)，ATP濃度與RLU呈線性關(guān)系。6.2 不同濃度多種細(xì)菌混合物熒光值和相應(yīng)細(xì)胞數(shù)關(guān)系曲線圖io2io4106108io10細(xì)窗總數(shù)（CFU/ml）、分別表示三批次不同濃度大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的混合 物,進(jìn)行平皿計(jì)數(shù)和相對(duì)熒光值檢測(cè)（本公司微量熒光檢測(cè)儀），并分別以log相對(duì)熒光值（RLU） 和log平皿計(jì)數(shù)值（c

23、fu/ml）為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)作圖。由上述關(guān)系圖推演的RLU-CFU （相對(duì)熒 光值對(duì)應(yīng)細(xì)菌菌落總數(shù)）可供參考。7、有關(guān)食品安全和衛(wèi)生檢測(cè)的問答Cj 了一問：哪些因素可能影響食品安全和衛(wèi)生？/生物（如細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)、致病菌污染等）、化學(xué)（農(nóng)藥殘留、有毒添加劑等）、 物理（放射污染等）及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品（有害遺傳效應(yīng)等）四大因素。其中，以細(xì)菌污 染食物、飲用水引發(fā)食源性中毒最為常見，其危害的范圍最廣。二問：國內(nèi)外通常采用什么方法進(jìn)行食品細(xì)菌總數(shù)和衛(wèi)生、防疫檢測(cè)？“常規(guī)法”和“ATP熒光快檢法”。常規(guī)法是我國衛(wèi)生部規(guī)定至今仍然沿用的 方法，因此，又稱“國標(biāo)法”，即（細(xì)菌）活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法。三問：“常規(guī)法”和

24、“ATP熒光快檢法”的共同點(diǎn)和主要差別是什么？?jī)煞N方法都能用于檢測(cè)樣品中的細(xì)菌總數(shù)，提供有關(guān)衛(wèi)生防疫數(shù)據(jù)。主要差別 在“時(shí)效性”，常規(guī)法至少要12天才能得到結(jié)果，快檢法能在15分鐘內(nèi)得到 實(shí)時(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)。四問：為什么兩種方法在“時(shí)效性”上有這樣大的差異呢？因?yàn)樗鼈兯罁?jù)的基本原理各不相同?！俺Ｒ?guī)法”是讓檢樣中原先看不見的細(xì) 菌細(xì)胞，在稀釋涂布后通過在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37, 48小時(shí)的保溫培育，這樣， 一個(gè)活的細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)多次分裂繁殖形成數(shù)以億計(jì)，肉眼可見的細(xì)菌集群（菌落）， 然后通過計(jì)數(shù)得到結(jié)果，即菌落形成單位/毫升（克）CFU/ml （g）。“ATP熒光快檢法”則基于蟲光素酶能催化細(xì)菌細(xì)胞的AT

25、P發(fā)出熒光，熒光檢 測(cè)儀能快速、準(zhǔn)確計(jì)量熒光值的原理。因此，檢樣中細(xì)菌細(xì)胞越多，ATP量就越大， 發(fā)出的熒光就越強(qiáng)。這樣，在排除檢樣中非細(xì)菌ATP干擾的情況下，檢測(cè)熒光值（RLU）就能確定細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)CFU/ml（g）。五問：兩種檢測(cè)方法哪一種更準(zhǔn)確？?jī)煞N檢測(cè)方法得到的數(shù)據(jù)一致嗎？在回答這一問題前，讓我們重溫微生物學(xué)的兩個(gè)基本概念：細(xì)菌或微生物對(duì)人 類生活，生產(chǎn)造成的有利（如用于抗菌素生產(chǎn)）或有害影響（如污染食品、引發(fā)疾 病）都非單一或少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的作用，而是單位體積內(nèi)數(shù)以十萬、百萬細(xì)胞群體的 效應(yīng)。其次在適宜條件下，細(xì)菌每2030分鐘就能分裂繁殖一代。以大腸桿菌為 例，10萬個(gè)細(xì)胞/毫升二小

26、時(shí)后就成了 640萬細(xì)胞/毫升。因此，正確的回答是，兩種方法都能滿足特定時(shí)期細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)和衛(wèi)生監(jiān)測(cè)的 需求，但時(shí)效性有重大差異?？鞕z方法更有利于保障食品安全水平的全面提高。通 過常規(guī)法和ATP熒光快檢法實(shí)際檢測(cè)建立一個(gè)兩者之間可以互相參照，符合食品安 全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的有效范圍（如合格、警告、不合格）是發(fā)達(dá)國家的通用做法。六問：在食品安全方面國外有哪些值得借鑒的經(jīng)驗(yàn)和措施？上世紀(jì)90年代后，美、英、日等國就已依據(jù)螢火蟲發(fā)光原理，研制并推廣使 用ATP熒光法快檢設(shè)備用于檢測(cè)食品細(xì)菌總數(shù)或衛(wèi)生防疫監(jiān)測(cè)。這些設(shè)備既能提供 實(shí)時(shí)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，又有準(zhǔn)確、便攜、使用容易等特點(diǎn)。不僅彌補(bǔ)了 “常規(guī)法”時(shí)效 性差的不

27、足，又能發(fā)揮防患于未然的預(yù)警作用。有效地保障了食品安全總體水平的 提高，也促進(jìn)了如HACCP等食品衛(wèi)生理念的誕生。七問：HACCP認(rèn)證體系的主要涵義和作用是什么？HACCP是“危害分析關(guān)鍵控制點(diǎn)”一詞的英語縮寫，源于上世紀(jì)70年代美國 太空總署提出的有關(guān)食品安全基本理念，即（1）危害食品安全的可能因素包括生 物（轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品）、化學(xué)、物理四個(gè)方面；（2）從原料到食品通常經(jīng)歷加工生產(chǎn)一 產(chǎn)品包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸一配發(fā)銷售等環(huán)節(jié)；（3）食品原料的品質(zhì)、生產(chǎn)環(huán)境、設(shè)施、 操作人員的衛(wèi)生水平都將影響終產(chǎn)品一食品的安全衛(wèi)生水平。因此，只有將所有可 能影響食品安全的危害因子全部納入監(jiān)控范圍，采用快檢方法實(shí)施監(jiān)控

28、才能從源頭開始，從而有效地保障食品，并留有補(bǔ)救時(shí)間防患于未然。美、日、歐盟等國已將實(shí)施HACCP認(rèn)證體系列為法定措施。我國衛(wèi)生部已于 2002年頒發(fā)食品加工企業(yè)的HACCP實(shí)施指南衛(wèi)法監(jiān)發(fā)174號(hào)。八問：“ATP熒光快檢法”和實(shí)施食品安全的HACCP預(yù)警、溯源管理制度有何關(guān) 系？在建立和推廣使用ATP熒光法快檢技術(shù)前，只能靠目測(cè)或平皿計(jì)數(shù)法評(píng)估產(chǎn)前 或清潔消毒后生產(chǎn)線、食品接觸表面的衛(wèi)生水平。這兩種方法要不是靈敏度不夠， 就是取得結(jié)果的時(shí)間太長(zhǎng)，無法滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。換一句話說，只有采用ATP 熒光法快檢一類方法才能實(shí)施HACCP和食品安全的溯源和預(yù)警制度。九問：美、日、歐盟各國如何評(píng)價(jià)AT

29、P熒光快檢法和建立相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)？通過ATP熒光快檢法得到的是來自食物殘?jiān)臀⑸锛?xì)胞兩個(gè)部分ATP的總 值。多數(shù)情況下，來自微生物細(xì)胞的比例較小。但是，由于食物殘?jiān)仁俏⑸锷?長(zhǎng)的培養(yǎng)基，又起抵消滅菌效果的作用。因此，關(guān)鍵在確定避免重新污染的ATP臨 界值，而非單純依據(jù)細(xì)菌細(xì)胞ATP值折算的細(xì)菌菌落數(shù)（cfu）。這就是多數(shù)衛(wèi)生監(jiān) 測(cè)試劑盒不設(shè)置通用ATP標(biāo)準(zhǔn)，也不必期望ATP與CFU之間有確定相關(guān)關(guān)系，容 易引起初用者疑慮的原因。統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí)，凡ATP熒光法顯示衛(wèi)生水平改善，則平 皿計(jì)數(shù)結(jié)果也一定改善。如果檢測(cè)點(diǎn)ATP水平高，即便是無菌的，次日早上必然大 量滋生細(xì)菌導(dǎo)致食品污染。因此，發(fā)達(dá)國

30、家的普遍做法是:首先通過ATP快檢步驟對(duì)食品原料及經(jīng)過清潔、 消毒后食品原料接觸表面是否達(dá)到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)作出有數(shù)字依據(jù)的評(píng)價(jià)。其次，對(duì)易于 引發(fā)微生物污染的關(guān)系部位實(shí)施重點(diǎn)監(jiān)控。最后，制訂出符合本單位情況，又符合 衛(wèi)生要求的ATP數(shù)值范圍。十問：具備什么條件有利于在我國普遍實(shí)施HACCP認(rèn)證體系？（1）發(fā)展擁有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的食品安全關(guān)鍵技術(shù)，提供準(zhǔn)確、有效、便 攜、操作容易、價(jià)格能為國內(nèi)廣大用戶接受的食品安全檢測(cè)設(shè)備和試劑系統(tǒng)。（2）建立與快檢技術(shù)相匹配的國家、企業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。（3）普及與快檢技術(shù)相關(guān)的衛(wèi)生學(xué)和衛(wèi)生監(jiān)督指導(dǎo)新理念、新知識(shí)。8.具體樣品檢測(cè)的操作方法及方案飲用水細(xì)菌指標(biāo)ATP生物熒

31、光快速檢測(cè)法和分級(jí)判定（草案）1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飲用水細(xì)菌指標(biāo)ATP （三磷酸腺甘）生物熒光快速檢測(cè)法的術(shù)語和定義、試驗(yàn) 方法、細(xì)菌指標(biāo)的分級(jí)及判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用飲用水細(xì)菌指標(biāo)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。2術(shù)語和定義上2.1 相對(duì)發(fā)光值 RLU （relative light unit）樣品與試劑反應(yīng)經(jīng)微量熒光檢測(cè)儀檢測(cè)后，所顯示在儀器上的讀數(shù)。f3原理Al在有氧的條件下，蟲光素酶催化D-熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)，形成氧化熒光素并 發(fā)出熒光，其生化反應(yīng)式如下：ATP+D-Luciferin+O2Mg2+. AMP+Oxyluciferin+PP.+CO2+LightLuciferase當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中，蟲

32、光素酶和D-熒光素處于過量的情況下，熒光的強(qiáng)弱取決于ATP的數(shù)量。 以檢測(cè)含細(xì)菌的樣品為例，細(xì)菌細(xì)胞越多，ATP量越高，發(fā)出的熒光也就越強(qiáng)。在排除樣品中 非細(xì)菌ATP干擾的情況下，通過熒光值就能確定樣品中細(xì)菌ATP的含量，通過測(cè)量相對(duì)熒光 值從而快速得知被檢飲用水的細(xì)菌指標(biāo)。4試驗(yàn)設(shè)備和材料4.1微量熒光檢測(cè)儀:量程范圍0-1010cfu/mL實(shí)際檢測(cè)靈敏度（ATP）5 X 10Tsmol檢測(cè)時(shí)間1秒-99秒自由設(shè)定精確誤差±5%由儀器生產(chǎn)廠家米岬定的C14放射源進(jìn)行定標(biāo)、校準(zhǔn)可檢波長(zhǎng)300nm650nm2.2 試劑組，按檢測(cè)操作順序分為：體細(xì)胞裂解試劑：主要成份是非離子去污劑及表面

33、活性劑，能專一而有效地裂解樣品中的 非細(xì)菌細(xì)胞（體細(xì)胞）并釋出ATP,然后使用過濾比色杯底部的濾膜將體細(xì)胞裂解試劑、 體細(xì)胞碎片及游離ATP排除，試劑可室溫保存。細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑：主要成份是陽離子去污劑及表面活性劑，能專一而有效地裂解樣品中 細(xì)菌細(xì)胞并釋出ATP,試劑可室溫保存。熒光反應(yīng)試劑組：主要成份是D-熒光素、蟲熒光素酶、鎂離子，能與樣品中的細(xì)菌ATP相 互作用并發(fā)出熒光,一20低溫避光貯藏。2.3 樣品預(yù)處理耗材。過濾比色杯的杯架一個(gè)，用于固定過濾比色杯。加壓器一個(gè)，用于加壓、排出體細(xì)胞ATP和體細(xì)胞裂解試劑。帶0.45 m濾膜熒光反應(yīng)過濾比色杯，為熒光反應(yīng)容器。專用無菌吸水紙，置于過

34、濾比色杯架，吸取加壓后流出的液體。帶密封圈無菌濃縮器，用于濃縮樣品。自備微生物學(xué)無菌操作所需常規(guī)用具、器皿、樣品采集無菌、無ATP的容器、塑料袋、手 杳 短字箋 套、鑷丁等。5分析步驟5.1 打開微量熒光檢測(cè)儀電源，使微量熒光檢測(cè)儀進(jìn)入系統(tǒng)初始化。5.2 飲用水的濃縮處理：用注射器從樣品中取出10ml的待測(cè)飲用水。打開微量熒光檢測(cè)儀檢查過濾比色杯讀數(shù)為0后，將過濾比色杯放入無菌濃縮器內(nèi)，并使注 射器接到濃縮器上，用適當(dāng)?shù)膲毫従復(fù)葡伦⑸淦髦?，直到注射器中的溶液推凈。用消毒過的鑷子從濃縮器中取出過濾比色杯，放在墊有吸水紙的過濾比色杯架上。5.3 樣品檢測(cè)步驟：5.3.1 取出過濾比色杯架，底層

35、墊放5張專用無菌吸水紙，并將帶濾膜比色杯放入架眼內(nèi)， 用移液器吸取檢樣50gL注入杯底。檢測(cè)前打開熒光檢測(cè)儀電源，此時(shí)液晶顯示屏顯“0” 值。5.3.2 將體細(xì)胞裂解試劑向杯中滴加4滴，加壓器置杯頂加壓，使杯中非細(xì)菌ATP、游離 ATP通過底部濾膜排出，由吸水紙吸凈。重復(fù)加壓步驟一次。（5.3.3 將細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑向杯中滴加2滴，取下比色杯置于可拉動(dòng)抽屜內(nèi)。5.3.4 用移液器從熒光反應(yīng)試劑瓶吸取熒光反應(yīng)試劑50M加入杯底，緩和地吸擠三次，混 勻反應(yīng)液。（關(guān)閉抽屜）5.3.5 設(shè)置檢測(cè)時(shí)間為10s，屏幕顯示的相對(duì)熒光值（RLU）對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合格及不合格判 定。6細(xì)菌指標(biāo)分級(jí)及判定分級(jí)及判定見

36、表1。RLU潔凈度分級(jí)判 定<400清 潔合 格401-1000警 告不合格>1000污 染ATP生物熒光快速檢測(cè)衛(wèi)生學(xué)方面監(jiān)測(cè)（草案）衛(wèi)生監(jiān)測(cè)方面檢測(cè)可以使用中西公司生產(chǎn)的ATP熒光法餐飲具及清潔度快檢試劑。范圍、術(shù)語和定義、原理、試驗(yàn)設(shè)備和材料參照“飲用水細(xì)菌指標(biāo)ATP生物熒光快速檢測(cè)法和分級(jí)判定”。簡(jiǎn)易操作如下：(1)帶上一次性無菌手套，打開餐飲具清潔度快檢試劑包裝袋(鋁膜復(fù)合包裝)，取出1根 無菌棉簽，并掰下一個(gè)透明檢測(cè)杯，注意不要污染杯內(nèi)白色檢測(cè)膜。(2)取無菌棉簽，在棉簽頭部滴加5滴細(xì)菌細(xì)胞釋放劑(XRA)，使棉簽頭部濕潤，然后用此 棉簽在被測(cè)處橫豎往返均勻涂擦，并隨之

37、轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽，采樣總面積100cm2。(3)將透明檢測(cè)杯放入可拉動(dòng)抽屜小孔內(nèi)，再向棉簽頭部滴加1滴細(xì)菌細(xì)胞釋放劑(XRA) 后置于透明檢測(cè)杯中的白色檢測(cè)膜上，使液體全部被吸收。(4)立即關(guān)閉抽屜，進(jìn)行測(cè)試操作。操作應(yīng)該迅速，務(wù)求試驗(yàn)操作時(shí)間一致以得到平行測(cè)試 數(shù)據(jù)。測(cè)量完畢前不可再拉動(dòng)抽屜。二、Z(5)屏幕顯示相應(yīng)的測(cè)試結(jié)果。RLU潔凈度分級(jí)判 定<300清 潔合 格301-900警 告敖不合格>900污 染ATP熒光法應(yīng)用于化妝品微生物的比對(duì)試驗(yàn)方案根據(jù)國外知名ATP快檢企業(yè)Celsis在其網(wǎng)站上提過的相關(guān)資料可以知道，當(dāng)檢 測(cè)化妝品時(shí)使用Rapiscreen系統(tǒng)一般需要24-48小

38、時(shí)，這個(gè)過程主要是一個(gè)微生物 的富集和增殖的過程。通過24小時(shí)增殖的過程可以檢測(cè)到1 cfu/g的微生物，所 以微生物的污染程度很低的時(shí)候理論上低于1000cfu/g就有必要進(jìn)行這種富集和 增殖的過程。對(duì)于低微生物污染的情況一般的富集和增殖的過程只需要簡(jiǎn)單的三個(gè)步驟：把樣品用培養(yǎng)基稀釋成(1% - 10% w/v)，可根據(jù)國標(biāo)1： 10進(jìn)行稀釋。在32培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)樣品判定標(biāo)準(zhǔn)和試劑靈敏度確定。經(jīng)過培養(yǎng)后取均勻的50微升用ATP熒光法進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行樣品微生物富集和增殖的培養(yǎng)基也是關(guān)鍵，培養(yǎng)基要能保證適合各種微生 物生長(zhǎng)并且能夠中和樣品中的防腐劑和去污劑成分，同時(shí)培養(yǎng)基

39、本身的ATP背景要 保證非常低。Letheen牌的改良肉湯培養(yǎng)基是個(gè)不錯(cuò)的選擇，如果沒有可用國標(biāo)法 的培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。先用LLR試劑檢測(cè)國標(biāo)法的培養(yǎng)基如果ATP背景較高， 則需要用apyrase處理使本底降低。目前國標(biāo)法中和劑為卵磷脂和吐溫80。 1實(shí)驗(yàn)儀器試劑人1.1樣品：市面上銷售的化妝品，每個(gè)樣品都需有無菌對(duì)照樣品 1.2儀器和試劑1.2.1 儀器/"X ZATP生物發(fā)光快速檢測(cè)系統(tǒng)配套儀器，包括：BLW0401微量光度計(jì)、過濾比 色杯、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、1ml移液槍及槍頭。1.2.2 試劑發(fā)光反應(yīng)試劑(LLR)、細(xì)菌細(xì)胞ATP釋放試劑(XRA)、卵磷脂吐溫

40、80營養(yǎng) 瓊脂培養(yǎng)基、液體石蠟和吐溫80、PBS緩沖液。卵磷脂、吐溫80一營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g、瓊脂15g、卵磷脂1g /吐溫80 7g蒸餾水1000mL現(xiàn)在有商售的，可直接加水配制。卵磷脂、吐溫80一營養(yǎng)液體培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g卵磷脂1g 吐溫80 7g 蒸餾水 1000mL 制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80,將其他成分加到其 余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻，調(diào)pH值為7.1 7.4, 103.43kPa (121 15 lb) 20min高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。0.5%氯化三苯四氮唑

41、(2,3,5-triphenyl terazolium chloride, TTC)成分：TTC 0.5g蒸餾水100mL溶解后過濾，103.43kPa (121 15 lb) 20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4 冰箱備用。2實(shí)驗(yàn)方法取化妝品10g置于滅菌的錐形瓶中，用培養(yǎng)基稀釋成(1% - 10% w/v)可根 據(jù)國標(biāo)1： 10進(jìn)行稀釋，對(duì)于油包水型化妝品還應(yīng)加液體石蠟和吐溫80助溶劑， 充分震搖樣品使其充分混合均勻，在32培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。2.1 平板菌落計(jì)數(shù)法人按照化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2007年版)中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。2.2 ATP熒光法2.2.1 用移液槍抽取50

42、p l樣品加入到過濾比色杯；2.2.2 再滴力口 2滴XRA；/2.2.3 用移液槍加50p l匕匕口，推入儀器抽屜讀數(shù)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 平板菌落計(jì)數(shù)法根據(jù)化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2007年版)中微生物檢驗(yàn)法一總則 中的相關(guān)菌落計(jì)數(shù)方法進(jìn)行平板菌落的計(jì)數(shù)。3.2 ATP熒光法的標(biāo)準(zhǔn)確定將ATP熒光法測(cè)的熒光值與相應(yīng)的菌落計(jì)數(shù)法所得的數(shù)值進(jìn)行比較，初步確定 出ATP熒光法檢測(cè)化妝品菌落總數(shù)的判定標(biāo)準(zhǔn)。然后再通過3-4個(gè)批次的ATP熒光 法檢測(cè)結(jié)果與國標(biāo)法得到的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比對(duì)來修正判定標(biāo)準(zhǔn)。ATP熒光法應(yīng)用于乳品微生物的應(yīng)用指南一、背景資料ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)方法是乳品中細(xì)菌總數(shù)快檢中較為成型的

43、方法， 已經(jīng)在歐美普遍推廣，我國的臺(tái)灣地區(qū)于1999前后引進(jìn)并推廣該技術(shù)。目前國際上 比較有名的Celsis M4000 system是這個(gè)方面的先驅(qū)，但價(jià)格極為昂貴售價(jià)約為人民 幣50萬左右，難于得到廣泛應(yīng)用和推廣。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周劍忠、董明盛發(fā)表的生物熒光技木在乳品工業(yè)中的應(yīng)用及 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)田波、霍貴成等發(fā)表的乳與乳制品中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)技術(shù)，分別 18屬于國家科技攻關(guān)項(xiàng)目(2002BA518A12)和“十五”重大攻關(guān)項(xiàng)目(2002 BA518A06) 均把ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)方法作為一個(gè)乳品中細(xì)菌總數(shù)快檢的一個(gè)成型技 術(shù)和發(fā)展方向加以介紹和推廣。中西公司自主開發(fā)生產(chǎn)的ATP熒光法細(xì)

44、菌總數(shù)快速 檢測(cè)已經(jīng)達(dá)到了國外先進(jìn)水平，并在東北農(nóng)大教育部乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和國家食品質(zhì) 量監(jiān)督檢驗(yàn)中心進(jìn)行了相關(guān)原料奶的相關(guān)技術(shù)性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果是工作性 能比較穩(wěn)定，對(duì)周圍環(huán)境要求低(電流、電壓、噪聲、溫度等)，體積小，易操作， 工作流程簡(jiǎn)捷、清晰，操作結(jié)果可儲(chǔ)存并以文件記錄的方式查詢，可與電腦連接實(shí) 時(shí)檢測(cè)并傳輸檢測(cè)結(jié)果，可直接將檢測(cè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成EXCEL文件，便于統(tǒng)計(jì)、匯總。 經(jīng)過對(duì)比在原料乳的檢測(cè)中可有效排除原奶中的游離體細(xì)胞干擾，ATP檢測(cè)結(jié)果與 國標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果基本相符合。7二、乳品檢測(cè)中應(yīng)用的方向1 .在未經(jīng)處理的原料乳質(zhì)量控制中的應(yīng)用.用ATP生物熒光法對(duì)原奶中的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢

45、測(cè)，可以便于乳品企業(yè)在收奶的過程 中對(duì)原奶的品質(zhì)做出快速判斷，不合格的原奶當(dāng)場(chǎng)拒收，合格的可根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì) 其進(jìn)行分級(jí)。2 .在巴氏殺菌奶質(zhì)量控制中的應(yīng)用制定貨架期，控制巴氏殺菌后牛奶的二次污染對(duì)公眾的健康有著重要意義。用ATP 生物熒光法測(cè)得選擇性培養(yǎng)牛奶中的ATP量后，就可預(yù)測(cè)巴氏殺菌奶的貨架期，這 種試驗(yàn)和最近歐洲委員會(huì)介紹的保證質(zhì)量試驗(yàn)的結(jié)果一致。3 .用于UHT奶和其他乳制品的無菌檢測(cè)用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)無菌UHT奶耗時(shí)長(zhǎng)，等檢測(cè)結(jié)果出來后，產(chǎn)品已經(jīng)上市流通造成 的影響也很難挽回。ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快檢方法可以在產(chǎn)品出廠前就得到產(chǎn)品的 衛(wèi)生安全情況，而且這種方法對(duì)UHT巧克力奶特別有用

46、。另外生物熒光檢測(cè)也常被 用來檢測(cè)奶粉中的細(xì)菌總數(shù)。4 .牛奶中抗生素或噬茵體殘留的快速檢測(cè)牛奶中的乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌，在含抗生素或被噬菌體污染的牛奶中乳酸菌的 生長(zhǎng)受到了抑制，其抑制程度與抗生素含量或噬菌體污染程度有關(guān)。通過乳酸菌在 牛奶中生長(zhǎng)時(shí)ATP變化的檢測(cè)，可以很快檢出牛奶中的抗生素或噬菌體的殘留，在 90 min內(nèi)可檢測(cè)到低于0.005 U/mL的青霉素。5 .在衛(wèi)生監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用在乳制品的生產(chǎn)過程中，加強(qiáng)對(duì)設(shè)備衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生、個(gè)人衛(wèi)生的管理，可以防 止產(chǎn)品的二次污染，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。利用ATP生物熒光檢測(cè)，可以在5 min內(nèi)檢 出結(jié)果，及時(shí)知道清洗消毒的狀況，如果不符合標(biāo)準(zhǔn)，

47、可以重新進(jìn)行清洗消毒。這 樣就可以保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量，起到事先控制的作用。ATP生物熒光監(jiān)測(cè)也可用來 監(jiān)測(cè)奶制品生長(zhǎng)過程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)，及時(shí)了解關(guān)鍵控制點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，將事故隱 患消滅在萌芽之中，從而確保產(chǎn)品的安全可靠。人三、ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快檢方法在乳品中的應(yīng)用3.1 原奶樣品制備7 AX無菌條件下將原奶樣品稀釋適宜濃度，當(dāng)原奶中的脂肪含量不高于國家標(biāo)準(zhǔn)1.5倍按1： 10用滅菌PBS溶液稀釋；當(dāng)原奶中的脂肪含量高于國家標(biāo)準(zhǔn)1.5倍按1： 20 用滅菌PBS溶液稀釋。.3.2 UHT奶和其他要求商業(yè)無菌乳制品中菌落的富集培養(yǎng)及殘存抗菌素的中和 對(duì)于低微生物污染的情況一般的富集和增殖的過程只

48、需要二個(gè)簡(jiǎn)單步驟：把樣品用國標(biāo)法卵磷脂、吐溫80一營養(yǎng)液體培養(yǎng)基稀釋成10% w/v ，稀釋 方法參照國標(biāo)法微生物檢測(cè)操作。乳制品和卵磷脂、吐溫80一營養(yǎng)液體培養(yǎng)基10%稀釋液在32恒溫振蕩培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)。3.3 ATP熒光法檢測(cè)操作（1）按照標(biāo)準(zhǔn)化操作取50制備好的樣品加入到ATP檢測(cè)杯中，并將ATP 檢測(cè)杯置于比色杯架內(nèi)，底部鋪墊吸水紙。（2）向杯底滴加4滴TRA，用加壓器推擠液體，使含非細(xì)菌細(xì)胞的溶解物通 過杯底濾膜。重復(fù)上述步驟一次（如果是花式奶一般TRA洗滌過程需要5次可洗 凈糖類、食品添加劑、乳酸菌等干擾）。（3）手持XRA試劑瓶，棄去第一滴，然后向ATP檢測(cè)杯底垂直滴加兩滿

49、滴 XRA,從過濾比色杯架取下比色杯，并放進(jìn)光度計(jì)的抽屜內(nèi)。（4）用無菌的移液器從LLR試劑瓶吸取熒光反應(yīng)試劑組50 口1加入杯中， 和緩地吸擠3次，混勻反應(yīng)液。保持?jǐn)D吸時(shí)間、次數(shù)一致十分關(guān)鍵。默數(shù)從LLR 加入樣品直到關(guān)嚴(yán)抽屜的時(shí)間，并力求所有樣品的這段操作時(shí)間一致。（5）關(guān)上微量光度計(jì)抽屜，此時(shí)微量光度計(jì)自動(dòng)進(jìn)行熒光值測(cè)量，等微量光 度計(jì)顯示出熒光值后記錄屏幕顯示的相對(duì)熒光值（RLU）。3.4 國標(biāo)法：菌落總數(shù)按照GB/T4789.2-2003規(guī)定菌落總數(shù)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢 測(cè)。3.5 建立工作曲線：將每一試樣同時(shí)按照國標(biāo)法和ATP法進(jìn)行檢測(cè)，以國標(biāo)法 檢測(cè)的菌落總數(shù)（CFU/g）的對(duì)數(shù)值為

50、橫坐標(biāo)，以ATP法所得RLU值的對(duì)數(shù)值為縱 坐標(biāo)作圖并進(jìn)行線性回歸分析，得到兩種方法的相關(guān)關(guān)系，當(dāng)每一類試樣的相關(guān)系 數(shù)達(dá)到一定要求（r0.）8后，將其與以往的工作曲線進(jìn)行比較并修正，等到一個(gè)較 為科學(xué)的工作曲線并將回歸方程的系數(shù)添加到ATP熒光微量光度計(jì)中，用于后繼實(shí) 驗(yàn)。廠、y3.6 比對(duì)試驗(yàn)：用獲得的工作曲線把各樣品在檢測(cè)時(shí)得到的RLU換算成菌落 總數(shù)對(duì)數(shù)值，再與該樣品用國標(biāo)方法得到的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值作相對(duì)誤差來進(jìn)行比 較。3.7 添加劑影響實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)中得到的明顯偏離已有標(biāo)準(zhǔn)曲線的原料乳進(jìn)行抗生 素等添加劑的檢測(cè)，用以印證添加抗生素是否會(huì)引起發(fā)光值的偏離。同時(shí)某一樣品 添加不同濃度的抗生素

51、或其它乳品常見添加劑并檢測(cè)乳品中微生物的發(fā)光值。再將 添加不同濃度的抗生素或其它乳品常見添加劑乳品按國標(biāo)法檢測(cè)其中含有的菌落 總數(shù)。四、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：1 .經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本系統(tǒng)配備的細(xì)菌細(xì)胞ATP釋放試劑（XRA）對(duì)于處在抱子狀 態(tài)的細(xì)菌裂解率比較低，所以對(duì)奶品在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)經(jīng)37溫育30分鐘使抱子活化成 為營養(yǎng)細(xì)胞。2 .生乳放置時(shí)間過長(zhǎng)油脂析出分層，脂肪凝結(jié)破壞生乳的自然狀態(tài)，影響實(shí)驗(yàn) 結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此該儀器較適宜新鮮生乳的菌落總數(shù)檢測(cè)。3 .從冰箱取出的生乳樣品應(yīng)在室溫平衡一段時(shí)間，否則可能導(dǎo)致細(xì)菌中的ATP 沒有恢復(fù)到自然狀態(tài)而使檢測(cè)結(jié)果的熒光值偏低。4 .液態(tài)奶稀釋時(shí)應(yīng)充分混勻，否則影

52、響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照國 標(biāo)方法進(jìn)行平皿涂布，確保涂布平皿與熒光值有可比性。5 .如在ATP熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)某一樣品多次測(cè)量其RLU值均異常高超過200萬時(shí)，則應(yīng)再進(jìn)一步稀釋倍數(shù)，使其RLU值落在儀器最佳測(cè)量值范圍內(nèi)。6 .滴加TRA后，應(yīng)將體細(xì)胞完全排凈，否則影響最終數(shù)值。測(cè)量過程中保證光度 計(jì)電量充足，否則影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。第二部分 ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)使用說明1、技術(shù)參數(shù)及性能檢測(cè)時(shí)間1秒-99秒自由設(shè)定靈敏度5x108mol/L （標(biāo)準(zhǔn) ATP）檢測(cè)范圍0-1010cfu/ml 或 10-13mol/ml-10-9mol/ml （ATP）重復(fù)誤差

53、（批間差）<±5 %數(shù)據(jù)輸出RLU （細(xì)菌細(xì)胞ATP含量）、菌落總數(shù)存儲(chǔ)媒體FLASHROM 64KB數(shù)據(jù)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)以文件方式分類儲(chǔ)存數(shù)據(jù)內(nèi)容包括RLU （數(shù)值）、菌落總數(shù)、樣品名稱、文件名、記錄號(hào)、 日期、時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)度等菌落總數(shù)換算公式可自由設(shè)定儲(chǔ)藏空間1000個(gè)數(shù)據(jù)記錄顯示方式4行漢字LCD液晶顯示數(shù)據(jù)查詢以文件記錄方式查詢連續(xù)工作時(shí)間連續(xù)工作時(shí)間大于10小時(shí)計(jì)算機(jī)連接USB 接口電源充電鋰電池供電與PC連接可實(shí)時(shí)檢測(cè)并傳輸檢測(cè)結(jié)果PC機(jī)軟件數(shù)據(jù)存入ACCESS數(shù)據(jù)庫可以多種方式查詢、統(tǒng)計(jì)、匯總 等；可直接將檢測(cè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換EXCEL文件儀器尺寸165x 90 x 55 m

54、m儀器重量0.65Kg操作溫度5 - 60 相對(duì)濕度20-80%2、儀器操作說明2. 1開機(jī)、初始化開機(jī)后，儀器進(jìn)行系統(tǒng)初始化，如果日期、時(shí)間沒有設(shè)置，屏幕會(huì)提示（如圖1.1）,進(jìn)入 主菜單工作界面。特別提示：日期和時(shí)間是很重要的數(shù)據(jù)。請(qǐng)參照2. 2. 4主菜單工作界面（如圖1.2）測(cè)試查詢參數(shù)設(shè)置 通訊利用J或鍵可以選擇菜單項(xiàng)，然后按 鍵選擇“測(cè)試”，儀器進(jìn)行初始化。初始化的時(shí)間長(zhǎng)度設(shè)定請(qǐng)參照2.2.5說明，工作方式為倒計(jì)時(shí)。2. 2參數(shù)設(shè)置將圖1.2的光標(biāo)移到第3行，“參數(shù)設(shè)置”，按鍵后顯示（如圖2.1）。設(shè)置樣品設(shè)置文件名類型 設(shè)置日期時(shí)間 設(shè)置檢測(cè)時(shí)間 U盤格式化圖2.1“設(shè)置樣品”的

55、功能是將被測(cè)試的樣品以名字或符號(hào)的方式存儲(chǔ)在儀器中，以方便查詢測(cè)試結(jié)果?！皹悠访庇缮衔粰C(jī)軟件設(shè)定并傳輸給儀器，儀器中最多可以設(shè)定8個(gè)“樣品名”，詳細(xì) 說明見上位機(jī)軟件。2. 2. 1選擇RLU方式樣品名一 由上位機(jī)建立RLU方式水A牛奶SY圖2.2RLU方式是指儀器只將檢測(cè)結(jié)果以RLU數(shù)值顯示輸出，而無任何判定結(jié)果。顯示信息如下:圖2.2按樣品名：RLU 合格值：無 污染值：無K=無 b=無2. 2. 2選擇其它樣品名方式RLU方式水A牛奶SY圖2.4利用|或鍵，選擇“樣品名”，按 ）鍵。樣品名：牛奶SY合格值：400污染值：800K=0.8080 b=1.3420圖 2.5.該樣品的名稱為“牛奶SY”，當(dāng)RLU數(shù)值小于400時(shí)顯示“合格”，大于400而小于800 時(shí)顯示“報(bào)警”，大于800時(shí)顯示“污染”，詳細(xì)說明見上位機(jī)軟件說明。2. 2. 3設(shè)置文件類型J將圖2.1的光標(biāo)移到第2行，”設(shè)置文件名類型”，按 鍵。設(shè)置文件類型日 期單位、地點(diǎn)圖 2.6如選擇“日期”，則儀