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1、拉曼光譜分析技術(shù)元元拉曼光譜分析技術(shù)拉曼光譜分析技術(shù)n拉曼光譜概述拉曼光譜概述n1n拉曼光譜的基本原理拉曼光譜的基本原理n2n激光拉曼光譜儀激光拉曼光譜儀n3n拉曼光譜技術(shù)的應用和發(fā)展拉曼光譜技術(shù)的應用和發(fā)展n41 拉曼光譜概述拉曼光譜概述 n1928年印度物理學家C.V.拉曼在實驗中發(fā)現(xiàn),當光穿過透明介質(zhì)被分子散射的光發(fā)生頻率變化,這一現(xiàn)象稱為拉曼散射,本人也因此榮獲1930年的諾貝爾物理學獎。 1.1 拉曼光譜的發(fā)展歷程拉曼發(fā)明的拉曼光譜儀拉曼發(fā)明的拉曼光譜儀n19281940年,受到廣泛的重視,曾是研究分子結(jié)構(gòu)的主要手段。這是因為可見光分光技術(shù)和照相感光技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來的緣故;n1940
2、1960年,拉曼光譜的地位一落千丈。主要是因為拉曼效應太弱(約為入射光強的10-6),并要求被測樣品的體積必須足夠大、無色、無塵埃、無熒光等等。所以到40年代中期,紅外技術(shù)的進步和商品化更使拉曼光譜的應用一度衰落;n1960年以后,激光技術(shù)的發(fā)展使拉曼技術(shù)得以復興。由于激光束的高亮度、方向性和偏振性等優(yōu)點,成為拉曼光譜的理想光源。隨探測技術(shù)的改進和對被測樣品要求的降低,目前在物理、化學、醫(yī)藥、工業(yè)等各個領域拉曼光譜得到了廣泛的應用,越來越受研究者的重視。1.2 拉曼光譜技術(shù)的優(yōu)越性n提供快速、簡單、可重復且更重要的是無損傷的定性定量分析,它無需樣品準備,樣品可直接通過光纖探頭或者通過玻璃、石英
3、和光纖測量。此外 1) 由于水的拉曼散射很微弱,拉曼光譜是研究水溶液中的生物樣品和化學化合物的理想工具。 2) 拉曼光譜一次可同時覆蓋50-4000波數(shù)的區(qū)間,可對有機物及無機物進行分析。相反,若讓紅外光譜覆蓋相同的區(qū)間則必須改變光柵、光束分離器、濾波器和檢測器 3) 拉曼光譜譜峰清晰尖銳,更適合定量研究、數(shù)據(jù)庫搜索以及運用差異分析進行定性研究。在化學結(jié)構(gòu)分析中,獨立的拉曼區(qū)間的強度可以和功能集團的數(shù)量相關(guān)。4) 因為激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米,常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。這是拉曼光譜相對常規(guī)紅外光譜一個很大的優(yōu)勢。5) 共振拉曼效應可以用來有選擇性地增強大生
4、物分子某個發(fā)色基團的振動,這些發(fā)色基團的拉曼光強能被選擇性地增強1000到10000倍。1.3 幾種重要的拉曼光譜分析技術(shù)n1、單道檢測的拉曼光譜分析技術(shù)n2、以CCD為代表的多通道探測器用于拉曼光譜的檢測儀的分析技術(shù)n3、采用傅立葉變換技術(shù)的FT-Raman光譜分析技術(shù)n4、共振拉曼光譜分析技術(shù)n5、表面增強拉曼效應分析技術(shù)拉曼光譜分析技術(shù)2 拉曼光譜的基本原理拉曼光譜的基本原理2 拉曼光譜的基本原理拉曼光譜的基本原理光的瑞利散射和拉曼散射光的瑞利散射和拉曼散射 一束頻率為0的單色光,當它不能被照射的物體吸收時,大部分光將沿入射光束通過樣品,約1/1051/106有強度的光被散射到各個方向,
5、并在與入射方向垂直的方向,可以觀察到兩種散射。瑞利散射為光與樣品分子間的彈性碰撞,光子的能量或頻率不變,只改變了光子運動的方向。拉曼散射為光與樣品分子間的非彈性碰撞,光子的能量或頻率以及方向都發(fā)生變化。瑞利散射不變拉曼散射變化2.1 瑞利散射和拉曼散射樣品池透過光不變?nèi)鹄⑸洳蛔兝⑸渥冊龃鬁p小CCl4的拉曼光譜 Stocks linesanti-Stockes linesRayleigh scattering/cm-1 拉曼效應的機制和熒光現(xiàn)象不同,并不吸收激發(fā)光,因此不能用實際的上能級來解釋,玻恩和黃昆用虛的上能級概念說明拉曼效應。假設散射物分子原來處于電子基態(tài),振動能級如上圖所示。當受
6、到入射光照射時,激發(fā)光與此分子的作用引起極化可以看作虛的吸收,表述為躍遷到虛態(tài)虛能級上的電子立即躍遷到下能級而發(fā)光,即為散射光。存在如圖所示的三種情況,散射光與入射光頻率相同的譜線稱為瑞利線,與入射光頻率不同的譜線稱為拉曼線。Rayleigh散射:散射: 彈性碰撞;無能量交換,僅改變方向;Raman散射:散射: 非彈性碰撞;方向改變且有能量交換;Rayleigh散射散射Raman散射散射E0基態(tài), E1振動激發(fā)態(tài); E0 + h 0 , E1 + h 0 激發(fā)虛態(tài);獲得能量后,躍遷到激發(fā)虛態(tài). h E0E1V=1V=0h 0h 0h 0h 0 + E1 + h 0E0 + h 0h( 0 -
7、)激發(fā)虛態(tài)2.2 拉曼效應 拉曼效應為光子與樣品中分子的非彈性碰撞,即光子與分子相互作用中有能量的交換。入射光子的能量為h0,當與分子碰撞后,可能出現(xiàn)兩種情況:第一種是分子處于基態(tài)振動能級,與光子碰撞后,分子從入射光子獲取確定的能量h達到較高的能級。則散射光子的能量變?yōu)閔(0)= h,頻率降低至0,形成頻率為0的譜線。另一種是分子處于激發(fā)態(tài)振動能級,與光子碰撞后,分子躍遷回基態(tài)而將確定的能量h傳給光子。則散射光子的能量變?yōu)閔(0)= h,頻率增加至0,形成頻率為0的譜線。兩種情況,散射光子的頻率都發(fā)生變化了,減小或增加了。 RamanRaman散射散射Raman散射的兩種躍遷能量差: E=h(
8、0 - )E=h(0 + )h( 0 + )E0E1V=1V=0E1 + h 0E2 + h 0 h h 0h( 0 - )Stokes線與反Stokes線將負拉曼位移,光子失去能量,頻率減小,即0稱為Stokes線(斯托克斯線)。將正拉曼位移,光子得到能量,頻率增大,即0稱為反Stokes線(反斯托克斯線)。 正負拉曼位移線的躍遷幾率是相等的,但由于反斯托克斯線起源于受激振動能級,處于這種能級的粒子數(shù)很少,因此反斯托克斯線的強度小,而斯托克斯線強度較大,在拉曼光譜分析中主要應用的譜線。2.3 拉曼位移Raman位移:位移:Raman散射光與入射光頻率差;ANTI-STOKES 0 - Ray
9、leighSTOKES 0 + 0 =| 0 s | 取決于分子振動能級的改變,因此是特征的拉曼位移的特點 對不同物質(zhì): 不同; 對同一物質(zhì):與入射光頻率無關(guān);只與分子振動或轉(zhuǎn)動頻率有關(guān),表征分子振-轉(zhuǎn)能級的特征物理量;定性與結(jié)構(gòu)分析的依據(jù) 拉曼位移產(chǎn)生的條件 拉曼散射不要求有偶極矩的變化,卻要求有極化率的變化,與紅外光譜不同,也正是利用它們之間的差別,兩種光譜可以互為補充。 分子在靜電場E中,如光波交變電磁場分子中產(chǎn)生了感應偶極距p正極負極核電子P=E 分子的極化率拉曼光譜與分子極化率的關(guān)系 P=E 分子的極化率n感應偶極矩與外電場的強度之比為 分子極化率n分子中兩原子距離最大時,也最大n拉
10、曼散射強度與極化率成正比例關(guān)系2.4 拉曼散射光譜的特征n拉曼散射光譜具有以下明顯的特征 a.拉曼散射譜線的波數(shù)雖然隨入射光的波數(shù)而不同,但對同一樣品,同一拉曼譜線的位移與入射光的波長無關(guān),只與樣品的振動轉(zhuǎn)動能級有關(guān); b. 在以波數(shù)為變量的拉曼光譜圖上,斯托克斯線和反斯托克斯線對稱地分布在瑞利散射線兩側(cè), 這是由于在上述兩種情況下分別相應的得到或失去了一個振動量子的能量。 c. 一般情況下,斯托克斯線比反斯托克斯線的強度大。這是由于Boltzmann分布,處于振動基態(tài)上的粒子數(shù)遠大于處于振動激發(fā)態(tài)上的粒子數(shù)。2.5 拉曼散射光譜的優(yōu)缺點n(1)拉曼光譜是一個散射過程,因而任何尺寸、形狀、透明
11、度的樣品,只要能被激光照射到,就可直接用來測量。由于激光束的直徑較小,且可進一步聚焦,因而極微量樣品都可測量。n(2)水是極性很強的分子,因而其紅外吸收非常強烈。但水的拉曼散射卻極微弱,因而水溶液樣品可直接進行測量,這對生物大分子的研究非常有利。n (3)對于聚合物及其他分子,拉曼散射的選擇定則的限制較小,因而可得到更為豐富的譜帶。SS,CC,C=C,N=N等紅外較弱的官能團,在拉曼光譜中信號較為強烈。n拉曼光譜研究高分子樣品的最大缺點是熒光散射 。 發(fā)光(熒光)的抑制和消除n在拉曼光譜測試中,往往會遇到熒光的干擾,由于拉曼散射光極弱,所以一旦樣品或雜質(zhì)產(chǎn)生熒光,拉曼光譜就會被熒光所淹沒。通常
12、熒光來自樣品中的雜質(zhì),但有的樣品本身也可發(fā)生螢光,常用抑制或消除螢光的方法有以下幾種:(1)純化樣品(2)強激光長時間照射樣品(3)加熒光淬滅劑 有時在樣品中加入少量熒光淬滅劑,如硝基苯,KBr, AgI等 ,可以有效地淬滅熒光干擾。(4)利用脈沖激光光源 當激光照射到樣品時,產(chǎn)生熒光和拉曼散射光的時間過程不同,若用一個激光脈沖照射樣品,將在10-11 10-13S內(nèi)產(chǎn)生拉曼散射光,而熒光則是在10-710-9S后才出現(xiàn)。(5)改變激發(fā)光的波長以避開熒光干擾 在測量拉曼光譜時,對于不同的激發(fā)光拉曼譜帶的相對位移是不變的,熒光則不然,對于不同的激發(fā)光,熒光的相對位移是不同的。所以選擇適當?shù)募ぐl(fā)光
13、,可避開熒光的干擾。在實際工作中常用這一方法識別熒光峰。2.6 拉曼光譜與紅外光譜比較 拉曼光譜與紅外光譜互稱為姊妹譜。因此,可以相互補充。n 相似之處: a 激光拉曼光譜與紅外光譜一樣,都能提供分子振動頻率的信息,對于一個給定的化學鍵,其紅外吸收頻率與拉曼位移相等,均代表第一振動能級的能量。 b 拉曼光譜的分析方法與紅外光譜相似n 不同之處:a 紅外光譜的入射光及檢測光都是紅外光,而拉曼光譜的入射光和散射光大多是可見光。拉曼效應為散射過程,拉曼光譜為散射光譜,紅外光譜對應的是與某一吸收頻率能量相等的(紅外)光子被分子吸收,因而紅外光譜是吸收光譜。b 機理不同:從分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化的角度看,拉曼
14、散射過程來源于分子的誘導偶極矩,與分子極化率的變化相關(guān)。通常非極性分子及基團的振動導致分子變形,引起極化率的變化,是拉曼活性的。紅外吸收過程與分子永久偶極矩的變化相關(guān),一般極性分子及基團的振動引起永久偶極矩的變化,故通常是紅外活性的。c 制樣技術(shù)不同:紅外光譜制樣復雜,拉曼光譜勿需制樣,可直接測試水溶液。拉曼光譜與紅外光譜分析方法比較拉曼光譜拉曼光譜紅外光譜紅外光譜光譜范圍光譜范圍40-4000Cm-1光譜范圍光譜范圍400-4000Cm-1水可作為溶劑水可作為溶劑水不能作為溶劑水不能作為溶劑樣品可盛于玻璃瓶,毛細管等容器樣品可盛于玻璃瓶,毛細管等容器中直接測定中直接測定不能用玻璃容器測定不能
15、用玻璃容器測定固體樣品可直接測定固體樣品可直接測定需要研磨制成需要研磨制成 KBR 壓片壓片拉曼光譜分析技術(shù)3 激光拉曼光譜儀激光拉曼光譜儀激光拉曼光譜儀示意圖3.1 儀器組成n激光拉曼光譜儀主要由光源、外光路系統(tǒng)、色散系統(tǒng)、接收系統(tǒng)和檢測記錄系統(tǒng)五大部分組成。3 激光拉曼光譜儀激光拉曼光譜儀光源n它的功能是提供單色性好、功率大并且最好能多波長工作的入射光。目前拉曼光譜實驗的光源己全部用激光器代替歷史上使用的汞燈。對常規(guī)的拉曼光譜實驗,常見的氣體激光器基本上可以滿足實驗的需要,常用氬離子激光器。最常用的兩條激發(fā)線的波長分別為 514.5 nm和 488.0 nm。外光路系統(tǒng)n外光路部分包括聚光
16、、集光、樣品架濾光和偏振等部件。 (1) 聚光:用一塊或二塊焦距合適的匯聚透鏡,使樣品處于匯聚激光束的中部,以提高樣品光的輻照功率,可使樣品在單位面積上輻照功率比不用透鏡匯聚前增強105倍。 (2) 集光:常用透鏡組或反射凹面鏡作散射光的收集鏡。通常是由相對孔徑數(shù)值在1左右的透鏡組成。為了更多地收集散射光,對某些實驗樣品可在集光鏡對面和照明光傳播方向上加反射鏡。 (3) 樣品架:樣品架的設計要保證使照明最有效和雜散光最少,尤其要避免入射光進入光譜儀的入射狹縫。 (4) 濾光:安置濾光部件的主要目的是為了抑制雜散光以提高拉曼散射的信噪比。 (5) 偏振:做偏振譜測量時,必須在外光路中插入偏振元件
17、。加入偏振旋轉(zhuǎn)器可以改變?nèi)肷涔獾钠穹较?。色散系統(tǒng)n色散系統(tǒng)使拉曼散射光按波長在空間分開,通常使用單色儀。主要作用是減少雜散光對測量的干擾,之后進入光電倍增管。 單色儀是拉曼光譜儀的心臟,要求環(huán)境清潔,灰塵對單色儀的光學元件鏡面的玷污是嚴重的,必要時要用洗耳球吹拂去鏡面上的灰塵,但切忌用粗糙的濾紙或布抹擦,以免劃破光學鍍膜。接收系統(tǒng)n拉曼散射信號的接收類型分單通道和多通道接收兩種。 光電倍增管接收屬于單通道接收。檢測記錄系統(tǒng)n為了提取拉曼散射信息,常用的電子學處理方法是直流放大、選頻和光子計數(shù),然后用記錄儀或計算機接口軟件畫出圖譜。3.2 激光拉曼光譜儀激光光源激光光源:He-Ne激光器,波長
18、632.8nm Ar激光器, 波長514.5nm, 488.0nm; 散射強度1/4 單色器單色器: 光柵,多單色器; 檢測器檢測器: 光電倍增管, 光子計數(shù)器;3.3 傅立葉變換-拉曼光譜儀 FT-Raman spectroscopy光源:Nd-YAG(釹-釔鋁石榴石)激光器;檢測器:高靈敏度的銦鎵砷探頭;特點:(1)避免了熒光干擾;(2)精度高;(3)消除了瑞利譜線;(4)測量速度快。拉曼光譜分析技術(shù)4 4 拉曼光譜技術(shù)的應用和拉曼光譜技術(shù)的應用和發(fā)展發(fā)展4.1 拉曼光譜的應用拉曼光譜分析技術(shù)是以拉曼效應為基礎建立起來的分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù),其信號來源于分子的振動和轉(zhuǎn)動。拉曼光譜的分析方向有以下三方面。n定性分析:不同的物質(zhì)具有不同的特征光譜,因此可以通過光譜進行定性分析。n結(jié)構(gòu)分析:對光譜譜帶的分析,又是進行物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的基礎。n定量分析:根據(jù)物質(zhì)對光譜的吸光度的特點,可以對物質(zhì)的量有很好的分析能力。4 4 拉曼光譜技術(shù)的應用和發(fā)展拉曼光譜技術(shù)的應用和發(fā)展水果表面殘留農(nóng)藥的監(jiān)測n從不同種類的水果表面得到的拉曼光譜可以看出,除了水果原本的拉曼峰外,農(nóng)藥的殘留能清晰地顯示出來,這表明這一方法是靈敏而適用的。定量地分析農(nóng)藥殘留可以從農(nóng)藥特征譜線和水果特征譜線的相對強度比獲得。生物分子鑒定 拉曼光譜法對于蛋白質(zhì)中的酪胺酸可以偵測出它是埋藏在內(nèi)或暴露于外。如果酪胺酸是被埋藏在內(nèi)部,則
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