安捷倫1260高效液相色譜培訓20130305

1、2013.05.14 高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。l色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同在固定相中滯留時間不同從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法 高效液相色譜儀

2、的結構：一般可分為5個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。 一、高壓輸液系統(tǒng) 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液裝置、脫氣裝置、高壓輸液泵、過濾器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩

3、種，但是目前恒流泵已經(jīng)基本取代了恒壓泵。 1、輸液泵應具備性能: A、流量穩(wěn)定，其變異系數(shù)應小于0.5%，這對定性定量的準確性至關重要； B、流量范圍寬，分析型應該在01-10mL/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應能達到100mL/min； C、輸出壓力高，一般應能達到150-300kgf/cm2（kgf/cm2=98.0665kpa）； D、液缸溶劑小； E、密封性好，耐腐蝕。 高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起

4、往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。 1、進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜柱系統(tǒng)的壓力、流量影響小。 2、進樣方式：隔膜泵進樣、停留進樣、閥進樣、自動進樣。 色譜分離系統(tǒng)包括：色譜柱、固定相和流動相。其中，色譜柱是其核心部分。 1、色譜柱的構造 色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。 2、色譜柱的類型 色譜柱按照用途分為分析型和制備型兩類。 a、常規(guī)分析柱（常量柱）一般色譜柱長1030cm，內(nèi)徑為25mm（常

5、量4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達25mm 以上。 b、窄徑柱（細管徑柱、半微量柱）柱長1030cm，內(nèi)徑12mm A、避免溫度和壓力的急劇變化及任何機械振動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下會影響柱內(nèi)的填充情況；柱壓突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流量時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。B、應逐漸改變?nèi)軇┙M成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改為全部是水，反之亦然。C、一般情況下色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去柱內(nèi)雜質(zhì)，否則反沖會迅速降低柱效。D、選擇使用適宜的流動相（尤其是PH值），以避

6、免固定相被破壞。有時候可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠，預柱為硅膠，可是流動相在進入分析柱之前預先被硅膠飽和，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。F、經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)G、保存色譜柱時應將色譜柱中充滿乙腈或甲醇，柱接頭擰緊，防止溶劑會發(fā)干。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)，靜置過夜或更長時間。H、色譜柱使用過程中，如果壓力升高，可能的原因有：色譜柱進口過濾芯被污染、沖洗閥過濾芯被污染、色譜柱被污染、連接管路的毛細管堵塞、進樣器轉子上的凹槽被污染、進樣針或針座被堵塞。若發(fā)現(xiàn)壓力升高，進行分段檢查，排除故障。 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅

7、對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。現(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:（l）可變波長測器）可變波長測器 （2）熒光檢測器）熒光檢測器 (3) 示差折光率檢測器示差折光率檢測器 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達10-7gcm-3。主要缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 （4）二極管陣列檢測器）二極管陣列檢測器 性能/優(yōu)點：靈敏度高、有四種類型的DAD模塊選擇、具有1024個二極管和可變狹縫、可根據(jù)

8、需要選擇不同的流動池、可進行自動峰檢索、利用紫外譜圖可進行色譜峰定性。 (5)蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器常見色譜故障-基線噪音可能原因:a、檢測池臟 b、檢測池燈能量下降 c、由泵引起的脈沖 d、檢測器上的溫度效應 e、檢測其中有氣泡通過常見色譜故障-基線漂移可能原因:a、梯度洗脫所用溶劑有吸收 b、流動相臟 c、色譜柱沒有用流動相平衡 d、系統(tǒng)中污染物溢出 e、實驗溫度不穩(wěn)定 常見色譜故障-鬼峰 常見原因是流動相臟，尤其是水相。要求使用超純水，最多兩天就 常見色譜故障-雙峰 可能原因：a、柱頭塌陷或柱床運動 b、柱前濾芯堵塞 c、組分共流出 d、樣品量過大 f、進樣器的進樣流路存在分叉流路 常見色譜故障-峰擴展 可能原因：a、柱效降低或有柱塌陷 b、進樣體積過大 c、流動相粘度大 常見色譜故障-壓力過高 可能原因： a、色譜柱進樣口過濾芯被污染 b、沖洗閥過濾芯被污染 c、色