實(shí)驗(yàn)一 簡(jiǎn)單染色3ppt課件

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)余雪冰實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用和細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容顯微鏡介紹油鏡的使用原理染色原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序作業(yè)作業(yè)顯微鏡的使用細(xì)菌簡(jiǎn)單染色的流程實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造并掌握其使用方法，重點(diǎn)掌握油鏡的使用方法 掌握簡(jiǎn)單染色的原理及方法 學(xué)習(xí)并掌握無菌操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理顯微鏡介顯微鏡介紹紹 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡(NIKON) 歐林巴斯歐林巴斯OLYMPUS生物顯微鏡生物顯微鏡 麥克奧林生物顯微鏡麥克奧林生物顯微鏡顯微鏡的構(gòu)造顯微鏡的構(gòu)造機(jī)械裝置機(jī)械裝置光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)鏡座鏡座載物臺(tái)載物臺(tái)鏡臂鏡

2、臂標(biāo)本夾和標(biāo)本移動(dòng)尺標(biāo)本夾和標(biāo)本移動(dòng)尺粗調(diào)螺旋和細(xì)調(diào)螺旋粗調(diào)螺旋和細(xì)調(diào)螺旋聚光鏡升降螺旋聚光鏡升降螺旋接目鏡接目鏡接物鏡及鏡頭轉(zhuǎn)換器接物鏡及鏡頭轉(zhuǎn)換器聚光鏡聚光鏡虹彩光圈虹彩光圈反光鏡反光鏡顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率1.放大倍數(shù)放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù)放大倍數(shù) 2. 顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率 是表示顯微鏡辨析是表示顯微鏡辨析物體兩端兩點(diǎn)之間距離的能力，可物體兩端兩點(diǎn)之間距離的能力，可用公式表示為：用公式表示為： D=/2nsin(/2 ) 式中式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。距離。 ：可見光的波長(zhǎng)平

3、均：可見光的波長(zhǎng)平均0.55m) n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 ：鏡口角即入射角）。：鏡口角即入射角）。實(shí)驗(yàn)原理油鏡使用的原實(shí)驗(yàn)原理油鏡使用的原理理 油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油若中間的介質(zhì)是一層油其折射率與玻片的相其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，

4、從增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。而使物象更加清晰。油浸沒物鏡油浸沒物鏡 介質(zhì)：左空氣；右香柏油介質(zhì)：左空氣；右香柏油實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原理理回目錄頁回目錄頁 由于微生物細(xì)胞含有大量水分一般在由于微生物細(xì)胞含有大量水分一般在80-90%以上），對(duì)以上），對(duì)光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和直接計(jì)算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，和直接計(jì)算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡

5、下進(jìn)行觀察。但是，任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但是，任何一項(xiàng)技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化，不能完全代表其生生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意?；罴?xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意。 微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué)因素的作用而微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、進(jìn)行的。物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、浸透、吸附作用等。浸透、吸附作

6、用等。 化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸引等。引等。實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原理理 染色劑染色劑 染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型：染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型： 1. 酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。 2. 堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 3. 中性復(fù)合染料：如伊紅、美蘭等，中性復(fù)合染料：如伊

7、紅、美蘭等，Wright染料和染料和Gimsa染料等常用于細(xì)胞核染色）。染料等常用于細(xì)胞核染色）。 4. 單純?nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，單純?nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類Sudan b)的染料。的染料。 細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，pH值大約在值大約在25之間，故在中性、堿性之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性離時(shí)染料離子帶陽電。因

8、此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。 實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原實(shí)驗(yàn)原理染色劑和染色原理理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌的三種基本形實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌的三種基本形態(tài)態(tài)球菌球菌Spherical coccus）:包括雙球菌、鏈球菌、葡萄球包括雙球菌、鏈球菌、葡萄球菌、四鏈球菌、八疊球菌等菌、四鏈球菌、八疊球菌等桿菌桿菌(Rod-shaped bacillus)：短小、粗大、細(xì)長(zhǎng)、棒狀、分短小、粗大、細(xì)長(zhǎng)、棒狀、分支支螺旋菌螺旋菌(Spired-shaped spirallu

9、m)：弧菌、螺菌弧菌、螺菌球菌球菌肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌淋球菌淋球菌化膿性鏈球菌化膿性鏈球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (division)桿菌桿菌破傷風(fēng)桿菌破傷風(fēng)桿菌肉毒芽孢桿菌肉毒芽孢桿菌炭疽桿菌炭疽桿菌大腸桿菌大腸桿菌桿菌桿菌變形桿菌變形桿菌大腸桿菌大腸桿菌綠膿桿菌綠膿桿菌螺菌螺菌鉤端螺旋體鉤端螺旋體幽門螺桿菌幽門螺桿菌霍亂弧菌霍亂弧菌Spirulina sp. - Filamentous Cyanobacterium實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 器材：顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、器材：顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、載波片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈、載波片、蓋玻片、接

10、種環(huán)、酒精燈、廢液缸、洗瓶等。廢液缸、洗瓶等。 細(xì)菌形態(tài)的染色標(biāo)本。細(xì)菌形態(tài)的染色標(biāo)本。 菌種：菌種： 大腸桿菌大腸桿菌E.coli）、）、 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 染色液和試劑：呂氏美藍(lán)、香柏油、染色液和試劑：呂氏美藍(lán)、香柏油、二甲苯二甲苯(或者乙醇乙醚溶液等或者乙醇乙醚溶液等-實(shí)驗(yàn)程序顯微鏡的使實(shí)驗(yàn)程序顯微鏡的使用用1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。 2.調(diào)節(jié)光亮度調(diào)節(jié)光亮度 3.低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào)低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào) 4.依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察 5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本油

11、鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。象為止。 6.換片：另換新片，必須從第三條開始操作。換片：另換新片，必須從第三條開始操作。 7.用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯或者乙醇乙醚溶液擦去殘然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯或者乙醇乙醚溶液擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。主要是油鏡的

12、使用主要是油鏡的使用顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)：顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)：1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。以免損壞。 2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度，用鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度，用完油鏡必須進(jìn)行完油鏡必須進(jìn)行“三擦三擦”。 3.觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。免壓碎玻片或損傷鏡面。 4.觀察時(shí)，兩眼睜

13、開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛觀察時(shí)，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。 5.拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。更不可傾斜拿。 6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。實(shí)驗(yàn)程序細(xì)菌簡(jiǎn)單染色蒸餾水蒸餾水涂片涂片接種環(huán)接種環(huán)自然干燥自然干燥固定固定呂式美蘭呂式美蘭染色染色1min水洗水洗枯燥枯燥擦拭擦拭水洗時(shí)不要直接沖菌膜水洗時(shí)不要直接

14、沖菌膜每位學(xué)生一人一組，取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，各做一塊涂片。每位學(xué)生一人一組，取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，各做一塊涂片。染色注意事項(xiàng)染色注意事項(xiàng) 1.涂片過程中，去生理鹽水和細(xì)菌不宜過多，涂菌要均勻，不宜過厚。 2.固定時(shí)溫度不可過高，以載玻片背面不燙手背為宜，因?yàn)闇囟冗^高會(huì)破壞細(xì)胞的形態(tài)。 3.水洗時(shí)，不應(yīng)直接沖洗細(xì)菌涂面，水流不應(yīng)過大、過急，以免細(xì)菌涂面被沖掉。錯(cuò)誤操作示范錯(cuò)誤操作示范實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告 根據(jù)觀察結(jié)果，畫出大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖，并注明菌體染色后的顏色。 繪圖的幾點(diǎn)要求： 繪圖要如實(shí)反映觀察到的情況； 圖必須要用鉛毛繪制； 如有要求注明各個(gè)構(gòu)造的名稱，須用引線平等引至圖的左右側(cè)再行標(biāo)注；要標(biāo)出圖的名稱并注明觀察時(shí)所用的放大倍數(shù)思考題思考題 油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應(yīng)特別注意些什么？些什么？ 使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？觀察微生物不用使用油鏡時(shí)，為什么必須用鏡頭油？觀察微生物不用油鏡頭的話，微生物和普通鏡頭的鏡片之間相隔了空油鏡頭的話，微生物和普通鏡頭的鏡片之間相隔了空氣，會(huì)因蓋玻片折射的光線導(dǎo)致無法得到清晰圖像，氣，會(huì)因蓋玻片折射的光線導(dǎo)致無法得到清晰圖像，這都是由于微生