微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)程序

1、微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)程序1. 目的：建立個(gè)微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)程序。2. 范圍：適用于各種原輔料、部分成品及驗(yàn)證的微生物限度檢查的操作。3. 職責(zé)：檢驗(yàn)人員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。4. 程序：41 總則：411 本法是指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。412 供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量。413檢查全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。414除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為3035，霉菌培養(yǎng)溫度為2528，控制菌培養(yǎng)溫度為36±1。415檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告以1g、1ml或10cm2為單位。42供

2、試品的檢驗(yàn)量 每批供試品檢驗(yàn)量一般為10g或10ml。供試品須取自2個(gè)以上的包裝單位。43供試液的制備 按供試品的理化特性與生物學(xué)特性可采取適宜的方法制成供試液。431 液體供試品 取供試品10ml，加入稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。432 固體供試品稱取供試品10g，置0.9%無菌氯化鈉100ml中，用勻漿儀或其它適宜辦法，混勻后，作為供試液。在制備過程中，必要時(shí)可加適量聚山梨酯80，并適當(dāng)加溫，但不應(yīng)超過45。433 含抑菌成份供試品供試品如干擾控制菌檢驗(yàn)，可用下列方法處理后，依法檢查。4331 稀釋法 將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。4332 離心

3、沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液，離心（每分鐘3000轉(zhuǎn)）30min，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原規(guī)定量的供試液。如有不溶性藥渣，可將離心（每分鐘500轉(zhuǎn)）5min，取全部上層液，再行集菌處理。4333 薄膜過濾法取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm，孔徑不大于0.45um±0.2um微孔濾膜的薄膜過濾器內(nèi)，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50100ml，取出濾膜備檢。4334 中和法凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。44 對(duì)照用菌液 控制菌檢查均應(yīng)做相應(yīng)已知菌的對(duì)照試驗(yàn)。

4、對(duì)照菌株為大腸桿菌CMCC（B）44 102。取相應(yīng)菌株的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)1820小時(shí)，稀釋至1:106。對(duì)照菌的加入量為50100個(gè)。45 檢查法451 細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)4511 平皿菌落計(jì)數(shù)法45111 取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成1:102、1:103等適宜的稀釋級(jí)。分別取連續(xù)三級(jí)10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45的培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級(jí)應(yīng)作23個(gè)平皿。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，前者同時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌菌落數(shù)，后者同時(shí)點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)。4511

5、2菌數(shù)測(cè)定陰性對(duì)照試驗(yàn) 取供試驗(yàn)用的稀釋劑各1ml置于4個(gè)無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長(zhǎng)菌。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為48h，分別在24h及48h點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以48h菌落數(shù)為準(zhǔn)。霉菌培養(yǎng)時(shí)間為72h，分別在48h及72h點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以72h菌落數(shù)為準(zhǔn)。菌落如蔓延生長(zhǎng)成片，不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)后，計(jì)算各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)，按菌落報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。45113 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋級(jí)，霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30100之間的稀釋級(jí)作為報(bào)告菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。如有1個(gè)稀釋級(jí)在30300（30100）之間時(shí)，將該稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如

6、同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)在30300（30100）之間時(shí)，按下式計(jì)算兩級(jí)比值：高稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)比值=低稀釋級(jí)的平均菌落×稀釋倍數(shù) 當(dāng)比值2時(shí)，以兩稀釋級(jí)的均值報(bào)告，當(dāng)比值>2時(shí)，以低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如同時(shí)有3個(gè)稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均在30300之間時(shí)，以后2個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值報(bào)告；如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均不在30300之間，以最接近30或300的稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如各稀釋平均菌落數(shù)均小于30時(shí)，一般按最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。如當(dāng)1

7、:10（或1:100）稀釋級(jí)平均菌落數(shù)等于或大于原液（或1:10）稀釋級(jí)時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定，按測(cè)定結(jié)果報(bào)告菌數(shù)。4512 培養(yǎng)基稀釋法 取供試液（原液或1:10、1:100供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個(gè)平皿內(nèi)（每皿各0.2ml）。每1個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml注入的5個(gè)平板的菌落數(shù)之和，即為每1ml的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。如各稀釋級(jí)平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí)，則報(bào)告菌落數(shù)為小于10個(gè)。452 控制菌（大腸桿菌）檢查4521 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份各100ml，

8、2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌50100個(gè)作陽性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)1824h（必要時(shí)可延至48h）。陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。4522 取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5h、24h時(shí)，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽性對(duì)照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。4523當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無菌生長(zhǎng)，判未

9、檢出大腸桿菌。供試液MUG陽性，靛基質(zhì)陽性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。4524如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824h，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。或有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選23可疑菌落作靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）及革蘭染色、鏡檢，按表1規(guī)定判定結(jié)果。4525靛基質(zhì)試驗(yàn)（I） 取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為

10、陽性，呈試劑本色為陰性。甲基紅試驗(yàn)（M） 取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于管內(nèi)加入甲基紅指示液數(shù)滴，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于每2ml培養(yǎng)液中加入-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%KOH溶液0.4ml，充分振搖，在4h內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C） 取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，一般培養(yǎng)4872h，培養(yǎng)基斜面有菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽性，培養(yǎng)

11、基顏色無改變?yōu)殛幮?。結(jié)果判斷見表1。對(duì)與MUG-I反應(yīng)不符的可疑菌株（見注、），應(yīng)重新分離培養(yǎng)，再作生化試驗(yàn)證實(shí)。表1 MUG的結(jié)果判斷MUG-I曙紅亞甲藍(lán)瓊脂IMVic結(jié) 果+ +檢出大腸桿菌- -未檢出大腸桿菌+ -無菌生長(zhǎng)未檢出大腸桿菌+ -有菌生長(zhǎng)-+-檢出大腸桿菌- +有菌生長(zhǎng)+-檢出大腸桿菌注：、如出現(xiàn)+-或出現(xiàn)-+-，均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-I和IMVic試驗(yàn)。 革蘭陰性桿菌。5儀器和用具51 操作臺(tái)：檢驗(yàn)操作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。工作臺(tái)設(shè)在半無菌操作室內(nèi)，室內(nèi)設(shè)有紫外線燈使室內(nèi)滅菌，室內(nèi)裝有空調(diào)設(shè)備，控制室溫在2025。52 恒溫培養(yǎng)箱：兩臺(tái)，各設(shè)定在3537及2426，分別作細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)用。53 高壓蒸汽滅菌鍋54 電熱干燥箱：50300。55 扭力天平56 酒精燈57 玻璃器皿：培養(yǎng)皿、刻度吸管、三角燒瓶、毛細(xì)滴管、刻度離心管、試管等。6試液（試劑）610.9% 無菌氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，121滅菌20分鐘。62 95%乙醇。63 靛基質(zhì)試液 取對(duì)二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊滴邊振搖，以