微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、1、更改文件審批表頭、格式。2、在文件開始處增加“主文件”和“文件變更說明及內(nèi)容”。3、細(xì)化文件內(nèi)容。1 目的建立微生物限度檢查的操作規(guī)程，為微生物檢查人員提供正確的標(biāo)準(zhǔn)操作方法。2 范圍適用于原輔材料、內(nèi)包裝材料、半成品、成品的微生物限度檢查。3 責(zé)任 QA對本規(guī)程的有效執(zhí)行承擔(dān)監(jiān)督檢查責(zé)任，QC對本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。4 程序4.1 簡述: 微生物限度檢查法系指檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。螨，屬于節(jié)肢動(dòng)物門，蛛形綱，蜱螨目。種類繁多，分布甚廣。其生活習(xí)性各異，分為自由生活和寄生生活兩種類型。在土壤、池沼、江河和湖海里，動(dòng)、植物體上，

2、貯藏食品和藥品中，都可能有它們的存在。藥品可因其原料、生產(chǎn)過程或包裝、運(yùn)輸、貯存、銷售等條件不良，受到螨的污染。螨可蛀蝕損壞藥品，使藥品變質(zhì)失效，并可直接危害人體健康或傳播疾病。能引起皮炎及消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等的疾病。因此，藥品特別是中成藥，必須進(jìn)行活螨檢查。4.2 器皿、儀器及用具。 玻璃器皿：250ml錐形瓶、250ml具塞三角燒瓶、研缽（陶瓷制，直徑10-12cm）、培養(yǎng)皿（90mm）、量筒（100ml）、試管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01,10ml分度0.1）、注射器(20或30ml)、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）。 用具：大、小

3、橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%-75%乙醇溶液浸泡）,無菌衣、帽、口罩、手套滅菌，備用, 顯微鏡、放大鏡（5-10倍）、實(shí)體顯微鏡、解剖針（尖端宜尖細(xì)且粗糙，否則不易挑取體表光滑的螨體）、發(fā)絲針（由一根長約10cm的小金屬棒，將其一端磨成細(xì)尖，另取長約1.5cm的頭發(fā)一根，以其長度的一半緊貼在金屬棒的尖端上，用細(xì)線將其纏緊，然后粘上加拿大樹膠或油漆，即得。適用于挑取行走緩慢且體表剛毛較多的螨體）、小毛筆（即繪圖毛筆。適用于挑取活動(dòng)快的螨類，筆鋒宜尖細(xì)，以免螨體夾在筆毛之間）、載玻片、蓋玻片、酒精燈、培養(yǎng)皿或小搪瓷盤（內(nèi)襯黑色紙片）、扁形稱量瓶（高3cm、寬6cm）。 儀器：勻

4、漿儀、培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥箱、臺式滅菌器、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、菌落計(jì)數(shù)器、微波爐等。4.3 培養(yǎng)基及試液：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基；靛基質(zhì)試液、甲基紅指示液、-萘酚乙醇試液、30%甘油溶液，PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。4.4 供試品抽樣、保存及檢驗(yàn)量； 抽樣：.1 一般采用隨機(jī)抽樣方法，抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量（以備復(fù)試）。.2 抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠罚瑧?yīng)選取有疑問的樣品，但機(jī)械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。.3 凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口

5、周圍）外觀看出長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無需再抽樣檢驗(yàn)。 保存.1 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死，損傷或繁殖。.2 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。 檢驗(yàn)量.1 所有劑型的檢驗(yàn)量均需取2個(gè)以上最小包裝單位。.2 固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗(yàn)量為10g。4.5 操作方法： 試驗(yàn)前準(zhǔn)備.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿罐、試管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀釋劑等移至無菌室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入操作間。

6、.2 開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣過濾裝置，并使其工作時(shí)間不低于30min。.3 操作人員用洗手液洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈及空氣過濾裝置，打開鼓風(fēng)機(jī)。進(jìn)入一更，更換工作服，二更穿戴工作服、口罩，進(jìn)入緩沖間。再用0.1%新潔爾滅或用75%乙醇進(jìn)行手消毒后，進(jìn)入操作間。.4 操作前先用75%乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用75%乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。 供試液的制備.1 固體、半固體或粘稠供試品稱取供試品10g，置勻漿罐或具塞三角瓶中，加PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜方法分散混勻。作為1：10的供試液。必要時(shí)

7、加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。.2 供試液的稀釋取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成1：102、1：103等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45的培養(yǎng)基約15ml20ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級應(yīng)作2-3個(gè)平皿。 檢查法：.1 細(xì)菌、霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)。A 培養(yǎng)：a 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)。b 菌數(shù)測定陰性對照試驗(yàn) 取供試驗(yàn)用的稀釋劑各1ml，置2個(gè)無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。c 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵

8、母培養(yǎng)5天, 逐日觀察菌落生長情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長成片的平板，不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級供試品溶液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)定報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差一倍或以上。B 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則a 細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告1g、1ml或10cm2供試品中所含菌數(shù)。如各稀釋級的平板無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板

9、有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1乘以最低稀釋級倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。 .2 控制菌檢查a大腸埃希菌檢查法取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時(shí)，必要時(shí)可延長至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。如MUG陽性、靛基質(zhì)陽

10、性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性，靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18-24小時(shí)。若平板上無菌落生長或生長的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。表1大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，

11、濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂 鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤b大腸菌群（Escherichia coli） 取含適量（不少于10ml）乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或0. 1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)18-24小時(shí)。膽鹽乳糖發(fā)酵管若無菌生長或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅

12、亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。若平板上無菌落生長，或生長的菌落數(shù)與表2所列的菌落形態(tài)特征不符合或?yàn)榉歉锾m陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落形態(tài)特征與表2所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。 表2大腸菌群菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤確證試驗(yàn)：從上述分離平板上挑選45個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該膽鹽乳糖發(fā)酵管檢出大腸菌

13、群，否則判未檢出大腸菌群。 根據(jù)大腸菌群的檢出灌輸，按表3報(bào)告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。表3 可能的大腸菌群數(shù)表各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群數(shù)N（個(gè)/g或ml）0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+103+-102N103+-10N102-10注：+代表檢出大腸菌群；-代表未檢出大腸菌群。.3活螨檢查A 螨的形態(tài)特征：螨的體形微小，多在1mm以下。一般呈卵形或橢圓形，無頭胸腹界限。幼螨足三對，成螨足多數(shù)為四對。足通常由六節(jié)組成?？谄飨蚯岸送怀觯３黍Q狀，有齒，由2-3節(jié)組成。須枝節(jié)數(shù)因種類而異，由1-2節(jié)到5節(jié)組成。有些種類在軀體前端或兩

14、側(cè)有1-2對眼。軀體兩側(cè)對稱，表面被有堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)的板。體表有剛毛，它的形狀、數(shù)目及彼此間長短比例和排列位置因種類而異。螨與蜘蛛、昆蟲（如書虱）相比，其外形比較近似，因此，必須注意它們之間的主要區(qū)別（見表4）。B 活螨的一般檢查方法：a 直檢法：取供試品先用肉眼觀察，有無疑似活螨的白點(diǎn)或其他顏色的點(diǎn)狀物，再用5-10倍放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡檢視。有螨者，用解剖針或發(fā)絲針或小毛筆挑取活螨放在滴有一滴甘油溶液的載玻片上，置顯微鏡下觀察。表4 螨與蜘蛛、昆蟲主要形態(tài)鑒別表特征成螨（如腐食酪螨）蜘蛛昆蟲（如書虱）分類蛛形綱、蜱螨目蛛形綱、蜘蛛目昆蟲綱、嚙蟲目足4對4對3對斛角無無1對體段頭、胸、腹無界限分

15、頭胸部和腹部分頭、胸、腹三部分b 漂浮法：取供試品放在盛有飽和食鹽水的扁形稱量瓶或適宜的容器內(nèi)，加0.9%無菌氯化鈉溶液至容器的三分之二處，攪拌均勻，置10倍放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡下檢查，或繼續(xù)加0.9%無菌氯化鈉溶液至瓶口處（為防止鹽水和樣品溢出污染桌面，宜將上述容器放在裝有適量甘油溶液的培養(yǎng)皿中），用潔凈的載玻片蓋在瓶口，使玻片與液面接觸，沾取液面上的漂浮物，迅即反轉(zhuǎn)玻片，置顯微鏡下檢查。c 分離法：也稱烤螨法。取供試品放在附有孔徑大小適宜的篩網(wǎng)的普通玻璃漏斗里，利用活螨避光、怕熱的習(xí)性，在漏斗的廣口上面放一個(gè)60-100W的燈泡，距離藥品約6cm處，照射1-2h?；铗裳刂┒穬?nèi)的底部細(xì)頸內(nèi)

16、壁向下爬，用小燒杯裝半杯甘油溶液，放在漏斗的下口處，收集爬出的活螨。在上述三種方法中，以前兩種方法操作簡便、效果好、檢出率高，固多采用。而后一種方法操作較繁瑣、費(fèi)時(shí)、效率低，較少采用。C 藥品的活螨檢查方法:a 供試品取樣量，每批抽取兩盒,每盒檢查3-4個(gè)最小包裝單位。必要時(shí)，可再次抽樣，或選取有疑問的樣品進(jìn)行檢查。b 膠囊劑 先直接檢查藥瓶內(nèi)蓋及塑料薄膜袋的內(nèi)側(cè)有無活螨。后將藥品放在襯有潔凈黑紙的培養(yǎng)皿或搪瓷盤里，使成薄層，直接檢查。必要時(shí)可再用漂浮法檢查。并注意檢查藥瓶口內(nèi)壁是否有螨。D 注意事項(xiàng)：a 螨在春夏和秋冬相交季節(jié)，繁殖旺盛，爬行活躍，易于檢出，在寒冬時(shí)則活動(dòng)微弱甚至不動(dòng)。鑒別時(shí)

17、，可在燈光下檢查，光和熱的刺激促使其活動(dòng)，利于檢查。b 活螨多為略帶白色，晶亮的囊狀小體，以暗色背景相襯，十分明顯，故檢查時(shí)一定要注意與背景的反差，白色的背景常常掩蓋螨的發(fā)現(xiàn)。c 漂浮法檢螨用的稱量瓶，以高3cm，口徑6cm為宜，由于液面較寬，便于直接用放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡檢查。用載玻片沾取檢樣時(shí)，接觸面積大，檢出率高,亦可用其他適當(dāng)容器代替。d 每次檢查后的供試品、器皿和用具，特別是陽性供試品，應(yīng)即時(shí)用焚燒、加熱等法處理，殺滅活螨、以免污染操作環(huán)境及人體。e 為保留陽性結(jié)果備查，可將檢出的活螨制成臨時(shí)觀察標(biāo)本和長期保存標(biāo)本。f 臨時(shí)觀察標(biāo)本：挑取檢出的活螨，放在預(yù)先滴有1滴75%乳酸溶液的載玻片上，加蓋玻片，置于酒精燈小火焰上，來回移動(dòng)，緩緩加熱片刻，使其適當(dāng)透化，即可鏡檢。鑒定后的螨體，亦可放入50-70%的乙醇溶液中保存，或作適當(dāng)處理。4.6 結(jié)果判斷 細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌（酵母菌）菌落數(shù)、控制菌三項(xiàng)均符合該品種微生物限度項(xiàng)下規(guī)定，應(yīng)判供試品合格；其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下規(guī)定，應(yīng)判供試