Ch基因在大腸桿菌酵母中的高效表達

1、5.2.1.2 酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢 基因表達調(diào)控機理清楚，遺傳操作簡便 具有真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng) 大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉 能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中 不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素 酵母菌是最簡單的真核模式生物5.2.2 酵母菌的宿主系統(tǒng) 廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌 提高重組蛋白表達產(chǎn)率的突變宿主菌 抑制超糖基化作用的突變宿主菌 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌5.2.2.1 廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母菌包括：酵母屬 如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵

2、母（Kluyveromyces lactis）畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）漢遜酵母屬 如多態(tài)漢遜酵母（Hansenula polymorpha）4.2.2.2 提高重組蛋白表達產(chǎn)率的突變宿主菌ssc1 改善重組蛋白分泌 鈣離子依賴型的ATP酶ssc2 提高重組蛋白表達 轉(zhuǎn)錄后加工rgr1 提高重組蛋白表達 轉(zhuǎn)錄水平ose1 提高重組蛋白表達 轉(zhuǎn)錄水平ssc11 改善重組蛋白分泌 羧肽酶Yrho- 提高重組蛋白表達 轉(zhuǎn)錄水平突變類型生物效應(yīng)作用位點4.2.2.3 抑制超糖基化作用的

3、突變宿主菌能抑制超糖基化的突變類型mnn 甘露糖生物合成缺陷型alg 天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och 外側(cè)糖鏈添加缺陷型突變類型生物效應(yīng) 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。 酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。4.2.2.4 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lysubiquitin liga

4、se E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌共有四個泛素編碼基因：UBI 1 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數(shù)生長期表達 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 2 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數(shù)生長期表達 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 3 編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 對數(shù)生長期表達 穩(wěn)定期關(guān)閉UBI 4 編碼泛素五聚體 對數(shù)生長期關(guān)閉 穩(wěn)定期表達酵母菌共有七個泛素連接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7泛素降解途徑衰減的釀酒酵母在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達，UBI 4-突變株能

5、UBI 4缺陷型：正常生長，但細胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突變株是外源基因表達理想的受體UBA 1缺陷型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解Ubc4 - ubc5 雙突變型：七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效4.2.3 酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌克隆表達質(zhì)粒的構(gòu)建酵母菌中的野生型質(zhì)粒4.2.3.1 酵母菌中的野生型質(zhì)粒釀酒酵母中的2m環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達50至100個。同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB乳酸

6、克魯維酵母中的線狀質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同pGKL1 8.9 kbDNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亞基的雙鏈線狀質(zhì)粒pGKL1和pGKL1反向重復(fù)序列4.2.3.2 酵母菌克隆表達質(zhì)粒的構(gòu)建(1) 含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建 ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標(biāo)記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。 以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達200個，但培養(yǎng)幾代 以2m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp后，質(zhì)粒的丟失率高達50%-

7、70%，主要是由于分配不均勻所致。(2) 含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建 CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列 將CEN DNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1 - 5個(3) 含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建 在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為Yip（酵母整合型質(zhì)粒），目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中。 什么目的？ 目的基因能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域4.2.4 酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細胞

8、中的特點 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因(1) 酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是：一個受體細胞可同時接納多個質(zhì)粒分子4.2.4.1 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序(2) 堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細胞的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的完整細胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見(3) 酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法 酵母菌原生質(zhì)體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較很大的負作用。電擊

9、轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達105 / mg DNA。4.2.4.2 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細胞中的特點單雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進入細胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進入細胞后，能高效地同源整合入染色體克隆在YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因，含有受體細胞的染色體DNA的同源序列，會發(fā)生高頻同源整合4.2.4.3 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補基因和顯性標(biāo)記基因兩大類 營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但對

10、于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難(1) 營養(yǎng)缺陷型的互補基因 顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物主要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白(2) 顯性標(biāo)記基因 aph 氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶 抗G418 cat 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 抗氯霉素 dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子 suc2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 耐受高濃度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型4.2.5 酵母菌的表達系統(tǒng)外源基因在酵母菌中表達的限制因素酵母菌啟動子的可控性酵母菌表達系統(tǒng)的選擇4.2.5.1 酵母菌啟動子的可控性n 釀酒酵母PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開， P

11、HO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動子的正調(diào)控因子 n PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35時失活 啟動子下游的外源基因在35時關(guān)閉，23誘導(dǎo)表達(1) 溫度控制型啟動子- pho4TS-PHO5啟動子：釀酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1 GAL7和 GAL10基因編碼(2) 超誘導(dǎo)型啟動子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)效果不明顯，基因基底水平表達GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)時，GAL4高效表達，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達GAL10Promoter4.2.5.2 外源基因在酵母菌中表達的限制因素外源基因穩(wěn)

12、態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的4.2.5.3 酵母菌表達系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母的基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達。 釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統(tǒng)來彌補。A 釀酒酵

13、母表達系統(tǒng) 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。 乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達系統(tǒng)。B 乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達。 生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子、表達的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。 無合適的自主復(fù)制型載體，外源基因的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。（20余種重組蛋白）C 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制

14、序列HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達。D 多型漢遜酵母表達系統(tǒng)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母4.2.6 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽 顆粒內(nèi)的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）、病毒DNA聚

15、合酶、微量病毒蛋白4.2.6.1 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108 aa55 aa226 aapreS1preS2SS 多肽226 aaM 多肽281 aaL 多肽399 aa 乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞質(zhì)膜上提取出來的。 雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備 目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化，重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達細胞總蛋白量的1%-2%。 4.2.6.2 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母4.2.6.3

16、產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長。 重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導(dǎo)HBsAg表達，最終S蛋白的產(chǎn)量可達細胞可溶性蛋白總量的3%在大規(guī)模的生產(chǎn)過程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬份乙肝疫苗。4.2.6.3 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建PARS2Bgl II5 AOX1HBsAgPHIS43 AOX1Bgl IIpBSAG15111 kb

17、Bgl II5 AOX1 HBsAgPHIS43 AOX1his+的轉(zhuǎn)化子重組分子轉(zhuǎn)化his-的受體細胞染色體DNATHANK YOU !5.2.2 酵母菌的宿主系統(tǒng) 廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌 提高重組蛋白表達產(chǎn)率的突變宿主菌 抑制超糖基化作用的突變宿主菌 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌4.2.2.3 抑制超糖基化作用的突變宿主菌能抑制超糖基化的突變類型mnn 甘露糖生物合成缺陷型alg 天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och 外側(cè)糖鏈添加缺陷型突變類型生物效應(yīng) 許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。 酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。(1) 酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是：一個受體細胞可同時接納多個質(zhì)粒分子4.2.4.1 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序(2) 堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細胞的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的完整細胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差