水稻轉基因組織培養(yǎng)步驟的具體事宜

1、農(nóng)桿菌介導的轉化一 試劑16-BA (6-BenzylaminoPurine)Sigma Cat No. B-58982KT (Kinetin)Sigma Cat No. K-07533NAA (Napthalene acetic acid)Sigma Cat N-06404IAA (Indole-3-acetic acid)Sigma Cat No. I-514852,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)Sigma Cat No. D-84076KanamycinUSB Cat No. 179247CH (Casein Enzymatic Hydrolys

2、ate)Sigma Cat No. C-72908Hn (hygromycin B)GiBco BRL Cat No. 10687-0109Cn (Carbenicillin)國產(chǎn)分裝10Nicotinic acidSigma Cat No. N-076511Pyridoxine HClSigma Cat No. P-866612Thiamine HClSigma Cat No. T-390213InositolSigma Cat No. I-301114PhytagelSigma Cat No. P-816915Dimethyl Sulfoxide-DMSOSigma Cat No. D-5

3、87916X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)Sigma Cat No. B-378317AS (Acetosringone)Aldrich chem., CO 01531 EG二 溶液1. MSmaxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO41.7gMgSO47H2O3.7gCaCl22H2O4.4g 或 CaCl2 3.32g逐一溶解藥品后，加dH2O定容到1000ml。2. MSmin母液(100)KI0.083gH3BO30.62gMnSO4 4H2O2.23g 或 MnSO4 H2O 1.69gZnSO4 7H2

4、O0.86gNa2MoO4 2H2O0.025gCuSO4 5H2O0.0025gCoCl2 6H2O0.0025g注意：Na2MoO4必須單獨溶解后再與其它組分混合。加dH2O定容到1000ml室溫保存。3. N6max母液(10)KNO328.3gKH2PO44.0g(NH4)2SO44.63gMgSO4 7H2O 1.85gCaCl2 2H2O1.66g 或 CaCl21.25g逐一溶解藥品后，加dH2O定容到1000ml。4. N6 min母液(100)KI0.08gH3BO30.16gMnSO4 4H2O0.44g 或 MnSO4 H2O0.3335gZnSO4 7H2O0.15g加

5、dH2O定容到1000ml室溫保存。5. Fe2+-EDTA(100)取一個燒杯加300ml dH2O以及FeSO4 7H2O 2.78g；在另一個燒杯中也加300ml dH2O加熱到70后加入Na2 EDTA 2H2O 3.73g；待到兩種藥品都溶解了，混合，70保溫2hr，然后加dH2O定容到1L，4保存。6. 維生素(100) Nicotinic acid0.1gPyridoxine HCl (VB6)0.1gThiamine HCl (VB1)0.1gGlycine0.2gInositol10g加dH2O定容到1000ml 4保存。7. AAmax母液(10)KCl29.50gNaH2

6、PO41.50g 或 NaH2PO4 2H2O 1.95gMgSO4 7H2O2.50gCaCl2 2H2O1.50g 或 CaCl21.13g 加dH2O定容到1000ml室溫保存。8. AA min母液(1000)MnSO4 H2O1.0gH3BO30.3gZnSO4 7H2O0.2gKI0.075gNaMoO4 2H2O0.025gCuSO4 5H2O0.0025gCoCl2 6H2O0.0025gNa2MoO4必須單獨溶解后再與其它組分混合，加dH2O定容到1000ml室溫保存。9. 2,4-D母液(1mg/ml)2,4-D100 mg先加1.0 ml 1N KOH 搖5min，然后加

7、10ml H2O 繼續(xù)搖直到2,4-D溶解，加水定容到100 ml室溫保存。10. 6-BA母液(1mg/ml)6-BA100mg加1.0 ml 1N KOH搖直到6-BA溶解，加水定容到100 ml室溫保存。11. NAA母液(1mg/ml)NAA100mg加1.0ml 1N KOH 并攪動直到NAA溶解，加水定容到100 ml室溫保存。12. IAA母液(1mg/ml)IAA100mg加1.0 ml 1N KOH搖直到IAA溶解，加水定容到100 ml室溫保存。13. 100mM AS母液(1mg/ml)AS0.196gDMSO10ml分裝到1.5 ml離心管4保存。14. 1N KOH母

8、液(1mg/ml)KOH5.6g用100ml H2O溶解后室溫保存。15. 羧芐青霉素2鈉(CN) （200mg/ml）CN干粉 1g用5ml滅菌dH2O溶解后，分裝到1.5ml Tub中（無菌操作）。或者用5ml 75酒精溶解，分裝到1.5ml Tub中（無菌操作）。 16.A stock solution （繼代A）: 硝酸銨 16.5g 硝酸鉀 19.0g 磷酸二氫鉀 1.7g 七水硫酸鎂 3.5g 二水氯化鈣 4g/無水氯化鈣 3g 加水依次溶解，定容1000ml，室溫保存 17.B stock solution （繼代B）: 四水硫酸錳 5.0g 硼酸 1.5g 七水硫酸鋅 2.0g

9、 碘化鉀 0.75g （未完） 二水鉬酸鈉 0.25g 五水硫酸銅 0.0389g 六水氯化鈷 0.025g 加水依次溶解，定容1000ml，室溫保存（二水鉬酸鈉單獨稱，單獨溶，緩慢加入，邊加邊攪）三 農(nóng)桿菌介導的水稻愈傷的遺傳轉化過程1 愈傷誘導1) 成熟種子脫殼后70%酒精滅菌1min，0.15% HgCl2處理15min；2) 滅菌單蒸水洗5-7次；3) 將種子接種到誘導培養(yǎng)基上，每瓶接6-8粒；4) 置黑暗中261處理約4-7周。2 愈傷繼代挑取淺黃、致密且相對較干的胚性愈傷接種到繼代培養(yǎng)基上261處理2周，不可接太多。3 預培養(yǎng)挑取致密且相對較干的胚性愈傷接種到預培養(yǎng)基上置黑暗中3至

10、4天。4 農(nóng)桿菌準備準備浸染的農(nóng)桿菌擴大培養(yǎng)。在相應抗性平皿中涂菌，28度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23天5 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)準備將農(nóng)桿菌轉移（粳稻：用接種環(huán)刮入半環(huán)-1環(huán)菌，秈稻：3環(huán)-4環(huán)菌 ）到100ml懸浮培養(yǎng)基中28搖瓶培養(yǎng)30-60min。6 農(nóng)桿菌侵染（共培養(yǎng)）1) 經(jīng)過預培養(yǎng)的愈傷轉移到一個滅菌的三角瓶中；2) 調整農(nóng)桿菌懸浮液的OD600值到0.8-1.0之間；3) 用農(nóng)桿菌懸浮液浸泡愈傷2030min；4) 倒去菌液，將三角瓶倒立于含濾紙的滅菌小皿中約15min；5) 愈傷放在滅菌的濾紙上晾干后，轉移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上去。培養(yǎng)物19-20黑暗處理2天。7 水洗和篩選1) 經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷轉移

11、到一個滅菌的三角瓶中；2) 用滅菌單蒸水洗5至7次愈傷；3) 用含有400ppm Cn（羧芐青霉素二鈉）的滅菌水浸泡愈傷30min（封好口后，可于28度，180至200RPM搖2030min）；4) 倒去含抗生素的滅菌水，將三角瓶倒立于含濾紙的滅菌小皿中約15min；5) 在滅菌的濾紙上晾干愈傷；6) 轉移愈傷到相應抗性的篩選培養(yǎng)基篩選2-3個循環(huán)（每個循環(huán)約2周）8 預分化與分化1) 經(jīng)過篩選得到的抗性愈傷轉到帶抗性的預分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，黑暗處理5-7天；2) 經(jīng)過預分化的愈傷轉移到100ml三角瓶里的分化培養(yǎng)基中，每瓶3粒愈傷，只選亮黃色的抗性愈傷，不必接入太多。；3) 26光照處理，

12、約需4060天。9 生根1) 從分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一塊愈傷所得的苗子只選一棵；2) 剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生組織；3) 將苗子轉入生根培養(yǎng)基，28光照處理7至10天。10 移栽移去生根管的封口膜，倒入約1cm深的自來水，在光照培養(yǎng)室煉苗34天，移栽至準備好的栽種處。四 培養(yǎng)基注意：所有的培養(yǎng)基必須現(xiàn)配現(xiàn)用。（一） 粳稻的轉化1. 誘導培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液(10) 100mlN6min母液(100) 10mlFe2-EDTA母液 (100) 10mlVitamin母液 (100)10ml2,4-D母液2.5ml脯氨酸0.3g水解酪蛋白 0.6g蔗糖 30gPhy

13、tagel3g加H2O 600-700ml并用KOH調節(jié)pH到5.9，煮沸后加H2O定容到1000ml，分裝到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口滅菌。2. 繼代培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液(10) 100mlN6min母液(100) 10mlFe2-EDTA母液 (100) 10mlVitamin母液 (100)10ml2,4-D母液2.0ml脯氨酸0.5g水解酪蛋白 0.6g蔗糖 30gPhytagel3g加H2O 900ml并用1N KOH調節(jié)pH到5.9，煮開后加H2O定容到1000ml，分裝到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口滅菌。3. 預培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于粳稻）

14、N6max母液(10) 12.5mlN6min母液(100) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100) 2.5mlVitamin母液 (100)2.5ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.15g蔗糖 5g瓊脂粉1.75g加H2O 250ml并用1N KOH調節(jié)pH到5.6，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS母液，然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。4. 共培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液(10) 12.5mlN6min母液(100) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100) 2.5mlVitamin母液 (1

15、00)2.5ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.2g蔗糖 5g瓊脂粉1.75g加H2O 250ml并調節(jié)pH到5.6，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS母液，然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。5. 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液(10) 5mlN6min母液(100) 0.5mlFe2-EDTA母液 (100) 0.5mlVitamin母液 (100) 1ml2,4-D母液 0.2ml水解酪蛋白 0.08g蔗糖 2g加H2O 100ml并調節(jié)pH到5.4，分裝到2個100ml三角瓶（50ml/瓶），封口膜

16、封口滅菌。使用前，加入1ml葡萄糖和100l AS母液。6. 篩選培養(yǎng)基（用于粳稻）N6max母液(10) 25mlN6min母液(100) 2.5mlFe2-EDTA母液 (100) 2.5mlVitamin母液 (100)2.5ml2,4-D母液 0.625ml水解酪蛋白 0.15g蔗糖 7.5g瓊脂粉1.75g加H2O 250ml并調節(jié)pH到6.0，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入250l Hn（潮霉素）和200ppm Cn（國產(chǎn)），然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。7. 預分化培養(yǎng)基（用于粳稻）MSmax母液(10) 25mlMSmin母液(100) 2.5mlFe2-EDT

17、A母液 (100) 2.5mlVitamin母液 (100)2.5ml6-BA母液 0.5mlKT母液 0.5mlNAA母液 50lIAA母液 50l水解酪蛋白 0.15g蔗糖 7.5g瓊脂粉1.75g加H2O 250ml并調節(jié)pH到5.9，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入250l Hn和200ppm Cn（國產(chǎn)），然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。8. 分化培養(yǎng)基（用于粳稻）MSmax母液(10) 100mlMSmin母液(100) 10mlFe2-EDTA母液 (100) 10mlVitamin母液 (100) 10ml6-BA母液 2.0mlKT母液 2.0mlNAA母液 0.

18、2mlIAA母液 0.2ml水解酪蛋白 1g蔗糖 30gPhytagel 3g加H2O 1000ml并用1N KOH調節(jié)pH到6.0，煮開后分裝到100ml三角瓶中（50ml/瓶），封口膜封口滅菌。9. 生根培養(yǎng)基MSmax母液(10) 50mlMSmin母液(100) 5mlFe2-EDTA母液 (100) 10mlVitamin母液 (100) 10ml蔗糖 20gPhytagel 3g加H2O 1000ml并用1N KOH調節(jié)pH到5.8，煮開后分裝到生根管中，封口膜封口滅菌。（二） 秈稻的轉化1. 誘導培養(yǎng)基（用于秈稻）MSmax母液(10) 100mlMSmin母液(100) 10m

19、lFe2-EDTA母液 (100) 10mlVitamin母液 (100)10ml2,4-D母液2.5ml脯氨酸0.5g谷氨酰胺 0.5g水解酪蛋白 0.6g蔗糖 30gPhytagel3g加H2O 600-700ml并用KOH調節(jié)pH到6.0，煮沸后加H2O定容到1000ml，分裝到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口滅菌。2. 繼代培養(yǎng)基（用于秈稻）繼代A (10) 100ml繼代B (100) 10mlFe2-EDTA母液 (100) 10mlVitamin母液 (100)10ml2,4-D母液3.0ml脯氨酸0.6g谷氨酰胺 0.5g水解酪蛋白 0.8g麥芽糖30gPhytag

20、el3g加H2O 900ml并用1N KOH調節(jié)pH到6.0，煮開后加H2O定容到1000ml，分裝到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口滅菌。3. 預培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于秈稻）MSmax母液(10) 12.5mlMSmin母液(100) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100) 1.25mlVitamin母液 (100)1.25ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.15g麥芽糖 5g瓊脂粉1.75g加H2O 250ml并用1N KOH調節(jié)pH到6.0，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS（乙酰丁香酮）母液，然后分

21、裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。4. 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基（用于秈稻）AAmax母液(10) 5mlAAmin母液(100) 0.5mlFe2-EDTA母液 (100) 0.5mlVitamin母液 (100) 1ml2,4-D母液 0.2ml谷氨酰胺 0.0876天冬酰胺 0.0216精氨酸 0.0176麥芽糖 2g葡萄糖 2g(葡萄糖可以配成50%的母液分開滅，在倒皿時加4ml/100ml瓶)加H2O 100ml并調節(jié)pH到5.4，過濾滅菌，加入100l AS母液，分裝到2個100ml三角瓶（50ml/瓶）。5. 共培養(yǎng)培養(yǎng)基（用于秈稻）MSmax母液(10) 6.25mlMSmin母液(100

22、) 1.25mlFe2-EDTA母液 (100) 2.5mlVitamin母液 (100)2.5ml2,4-D母液 0.75ml水解酪蛋白 0.2g麥芽糖 5g瓊脂粉1.75g加H2O 250ml并調節(jié)pH到5.6，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入5ml葡萄糖母液（滅菌的50%葡萄糖溶液）和250l AS母液，然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。6. 篩選培養(yǎng)基（用于秈稻）A母液(10) 25mlB母液(100) 2.5mlFe2-EDTA母液 (100) 2.5mlVitamin母液 (100)2.5ml2,4-D母液 0.625ml脯氨酸 0.15ml谷氨酰胺 0.1g水解酪蛋白

23、0.15g蔗糖 7.5g瓊脂粉1.75g加H2O 250ml并調節(jié)pH到6.0，封口膜封口滅菌。使用前，煮溶培養(yǎng)基，加入250l Hn（潮霉素）和200ppm CN（國產(chǎn)），然后分裝到培養(yǎng)皿中（25ml/皿）。（CN配方：10g/40ml滅菌雙蒸水，劇烈搖勻，后分裝于1.5ml離心管，-20度保存； CN加量：一篩400-500ul/250ml瓶，二篩300-350ul/250ml瓶，三篩250ul/250ml瓶）7. 預分化培養(yǎng)基（用于秈稻）N6max母液(10) 25mlN6min母液(100) 2.5mlFe2-EDTA母液 (100) 2.5mlVitamin母液 (100)2.5ml6-BA母液 0.5mlKT母液 0.5mlNAA母液 50lIAA母液 50l水解酪蛋白 0.