第六章酶與細(xì)胞固定

1、第六章第六章 酶與細(xì)胞固定化酶與細(xì)胞固定化直接應(yīng)用酶的不足之處直接應(yīng)用酶的不足之處: :(1)(1)酶的穩(wěn)定性差酶的穩(wěn)定性差; ;在溫度、在溫度、pHpH和無(wú)機(jī)離子等外界因素和無(wú)機(jī)離子等外界因素的影響下的影響下, ,容易變性失活容易變性失活(2)(2)酶的一次性使用；酶通常在水溶液中與底物反應(yīng)，酶的一次性使用；酶通常在水溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，即使仍有較高酶活力，也難于回收利用，反應(yīng)結(jié)束后，即使仍有較高酶活力，也難于回收利用，成本較高，不便連續(xù)化生產(chǎn)成本較高，不便連續(xù)化生產(chǎn)(3)(3)產(chǎn)物分離困難；酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起產(chǎn)物分離困難；酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起, ,增加分離純

2、化的困難增加分離純化的困難發(fā)展歷史發(fā)展歷史19531953年年, ,德國(guó)德國(guó),Grubhofer,Grubhofer、Schleith,Schleith,聚氨基苯乙烯樹脂為載聚氨基苯乙烯樹脂為載體，重氮法體，重氮法; ;19691969年，日本，千年，日本，千煙煙一郎，固定化氨基?；?，從一郎，固定化氨基酰化酶，從DL-DL-氨基酸氨基酸連續(xù)生產(chǎn)連續(xù)生產(chǎn)L-L-氨基酸，首氨基酸，首次工業(yè)規(guī)模應(yīng)用固定化酶次工業(yè)規(guī)模應(yīng)用固定化酶，促使酶工，促使酶工程作為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科從發(fā)酵工程中脫穎而出程作為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科從發(fā)酵工程中脫穎而出; ;19711971年，第一次國(guó)際酶工程會(huì)議確定固定化酶統(tǒng)一英文名稱年

3、，第一次國(guó)際酶工程會(huì)議確定固定化酶統(tǒng)一英文名稱為為Immobilized EnzymeImmobilized Enzyme。19731973年，日本首次在工業(yè)上成功應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中年，日本首次在工業(yè)上成功應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-L-天門冬氨酸。天門冬氨酸。19761976法國(guó)首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精；法國(guó)首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精；19781978年，日本用固定化枯草桿菌細(xì)胞生產(chǎn)淀粉酶，年，日本用固定化枯草桿菌細(xì)胞生產(chǎn)淀粉酶，19791979年固定化毛地黃細(xì)胞和長(zhǎng)春花細(xì)胞成功；年固定化毛地黃細(xì)胞和

4、長(zhǎng)春花細(xì)胞成功；19821982年日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸。年日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸。(1)(1)固定化酶固定化酶(2)(2)固定化菌體固定化菌體( (死細(xì)胞死細(xì)胞) )(3)(3)固定化活細(xì)胞固定化活細(xì)胞( (增殖細(xì)胞增殖細(xì)胞) )(4)(4)固定化原生質(zhì)體固定化原生質(zhì)體(5)(5)固定化動(dòng)植物細(xì)胞固定化動(dòng)植物細(xì)胞種類種類優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) (1)(1)提高酶穩(wěn)定性；提高酶穩(wěn)定性； (2)(2)可反復(fù)或連續(xù)使用可反復(fù)或連續(xù)使用, ,成本降低成本降低; ; (3)(3)易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開, ,簡(jiǎn)化提純工藝簡(jiǎn)化提純工藝; ; （4 4）酶反應(yīng)過(guò)程可嚴(yán)格控制；

5、）酶反應(yīng)過(guò)程可嚴(yán)格控制； （5 5）較游離酶更適合多酶反應(yīng)；）較游離酶更適合多酶反應(yīng)； （6 6）增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量；）增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量；缺點(diǎn)缺點(diǎn)（1 1）固定化時(shí)酶活有損失；）固定化時(shí)酶活有損失；（2 2）增加了生產(chǎn)初始成本；）增加了生產(chǎn)初始成本；（3 3）只能用于可溶底物且）只能用于可溶底物且較小分子較小分子；（4 4）與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)；）與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)；第一節(jié)第一節(jié) 酶固定化酶固定化定義定義酶的固定化酶的固定化: :將酶或菌體與不溶性載體結(jié)合的過(guò)程將酶或菌體與不溶性載體結(jié)合的過(guò)程; ;固定化酶固定化酶: :固定在載體上并在一定空間內(nèi)進(jìn)行催化

6、反應(yīng)的固定在載體上并在一定空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。酶。概念發(fā)展概念發(fā)展“水不溶酶水不溶酶”（water insoluble enzyme)water insoluble enzyme)“固相酶固相酶”（solid phase enzyme)solid phase enzyme)19711971年第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議正式采用年第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議正式采用“固定化酶固定化酶（immobilized enzyme)”immobilized enzyme)”固定化酶制備原則固定化酶制備原則（1 1）維持酶的催化活性及專一性；）維持酶的催化活性及專一性；（2 2）有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化；載體要有一）有

7、利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化；載體要有一定的機(jī)械強(qiáng)度，以免攪拌而破碎。定的機(jī)械強(qiáng)度，以免攪拌而破碎。（3 3）應(yīng)有最小的空間位阻；盡可能不妨礙酶與）應(yīng)有最小的空間位阻；盡可能不妨礙酶與底物接近底物接近（4 4）酶與載體必須結(jié)合牢固；以便回收重復(fù)使）酶與載體必須結(jié)合牢固；以便回收重復(fù)使用用（5 5）應(yīng)有最大穩(wěn)定性，載體不與廢物、產(chǎn)物或）應(yīng)有最大穩(wěn)定性，載體不與廢物、產(chǎn)物或 反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（6 6）成本要低。）成本要低。1 1、吸附法、吸附法(link)(link)2 2、包埋法、包埋法(link)(link)3 3、結(jié)合法、結(jié)合法(link)(link)4 4、交聯(lián)法、交聯(lián)法

8、(link)(link)5 5、熱處理法、熱處理法(link)(link)一、酶固定化方法一、酶固定化方法go1、吸附法、吸附法 用固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面用固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使其固定的方法上而使其固定的方法; ; 固體吸附劑固體吸附劑: :活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等孔玻璃等; ;(1)(1)操作簡(jiǎn)單，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，操作簡(jiǎn)單，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，可反復(fù)使用載體廉價(jià)易得，可反復(fù)使用; ;(2)(2)物理吸附結(jié)合能力弱，酶與載體結(jié)合不牢固物理吸附結(jié)合能力弱，酶與載體結(jié)合不牢固易脫落易脫落

9、. .(3)(3)既能吸附酶也能吸附其它物質(zhì)，因此吸附的既能吸附酶也能吸附其它物質(zhì)，因此吸附的選擇性差。選擇性差。back2、包埋法、包埋法 將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中的固定化方法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中的固定化方法 多孔載體多孔載體瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯、聚丙烯酰胺、火棉膠等酰胺、火棉膠等(1)凝膠包埋法（網(wǎng)格包埋法）凝膠包埋法（網(wǎng)格包埋法）天然凝膠天然凝膠條件溫和，操作簡(jiǎn)便，對(duì)酶活影響小，強(qiáng)度較差條件溫和，操作簡(jiǎn)便，對(duì)酶活影響小，強(qiáng)度較差合成凝膠合成凝膠強(qiáng)度高，對(duì)溫度、強(qiáng)度高，對(duì)溫度、pHpH值變化的耐受性強(qiáng)。但因需值變化的耐

10、受性強(qiáng)。但因需聚合反應(yīng)而使部分酶變性失活聚合反應(yīng)而使部分酶變性失活適用性適用性：適用固定化微生物；適用固定化微生物；不適用于底物或產(chǎn)物分子很不適用于底物或產(chǎn)物分子很大的酶類的固定化大的酶類的固定化(2)半透膜包埋法半透膜包埋法半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔徑幾埃至幾半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔徑幾埃至幾十埃，比酶分子直徑小十埃，比酶分子直徑小適用性：底物和產(chǎn)物都是小分子物質(zhì)的酶適用性：底物和產(chǎn)物都是小分子物質(zhì)的酶微膠囊直徑一般只有幾微米至幾百微米微膠囊直徑一般只有幾微米至幾百微米? ?微膠囊型固定化酶微膠囊型固定化酶制制備備酶酶+親水性單體溶于水親水性單體溶于水疏水性單體溶于有機(jī)溶液疏水性單體溶

11、于有機(jī)溶液混合混合乳乳化化劑劑乳化乳化酶液分散成小水滴酶液分散成小水滴親水性、疏水性單親水性、疏水性單體在兩相界面上聚體在兩相界面上聚合成半透膜，將酶合成半透膜，將酶包埋包埋Tween -20 破乳破乳離心離心半透膜半透膜酶液滴酶液滴（3）膠格包埋法首先被采用的膠格包埋法是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N, N-甲叉雙丙稀酰胺, 丙稀酰胺引發(fā)劑inactiationback3、結(jié)合法、結(jié)合法選擇適宜的載體選擇適宜的載體, ,通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵( (非共價(jià)健非共價(jià)健) )與酶結(jié)合在一起的固定化方法與酶結(jié)合在一起的固定化方法酶酶載載體體(1)離子鍵結(jié)合法離子

12、鍵結(jié)合法載體載體:DEAE-:DEAE-纖維素、纖維素、TEAE-TEAE-纖維素、纖維素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝膠等葡聚糖凝膠等不溶于水的離子交換劑不溶于水的離子交換劑操作操作: :將酶液與載體混合攪拌幾個(gè)小時(shí)將酶液與載體混合攪拌幾個(gè)小時(shí); ;或?qū)⒚敢壕徛亓鬟^(guò)處理好的離子交換柱或?qū)⒚敢壕徛亓鬟^(guò)處理好的離子交換柱; ;條件溫和，操作簡(jiǎn)便，活力損失少；結(jié)合力較弱，條件條件溫和，操作簡(jiǎn)便，活力損失少；結(jié)合力較弱，條件(pH(pH值和離子強(qiáng)度值和離子強(qiáng)度) )改變時(shí)改變時(shí), ,酶易脫落酶易脫落(2)(2)共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法是載體結(jié)合法中報(bào)道最多的方法是載體結(jié)合法中報(bào)道最多的方法; ;

13、載體分類載體分類: :纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)等甲殼質(zhì)等; ;也可分三類也可分三類: :天然有機(jī)載體天然有機(jī)載體( (多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞）、胞）、無(wú)機(jī)物無(wú)機(jī)物（玻璃、陶瓷）、（玻璃、陶瓷）、合成聚合物合成聚合物（聚（聚酯、聚胺、尼龍）酯、聚胺、尼龍）優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :結(jié)合很牢固，酶可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合很牢固，酶可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間缺點(diǎn)缺點(diǎn): :操作復(fù)雜，共價(jià)結(jié)合可能影響酶的空間構(gòu)操作復(fù)雜，共價(jià)結(jié)合可能影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性象而影響酶的催化活性載體活化方法載體活化方法1 1、重氮法、重氮法; ;2 2、迭氮法、迭氮法; ;3

14、3、溴化氰法、溴化氰法; ;4 4、烷基化法、烷基化法. .載體活化載體活化: :借助某種方法，在載體上引進(jìn)某一活借助某種方法，在載體上引進(jìn)某一活潑基團(tuán)，該基團(tuán)能與酶分子上某一基團(tuán)反應(yīng)。潑基團(tuán)，該基團(tuán)能與酶分子上某一基團(tuán)反應(yīng)。重氮法重氮法將含有苯氨基的不溶性將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)生成載體與亞硝酸反應(yīng)生成重氮鹽衍生物，使載體重氮鹽衍生物，使載體引進(jìn)了活潑的重氮基團(tuán)引進(jìn)了活潑的重氮基團(tuán)迭氮法迭氮法含有酰肼含有酰肼基團(tuán)的載基團(tuán)的載體可用亞體可用亞硝酸活化，硝酸活化，生成迭氮生成迭氮化合物化合物溴化氰法溴化氰法含有羥基的載體，如纖維素等，可用溴化含有羥基的載體，如纖維素等，可用溴化氰活化

15、生成亞氨基碳酸衍生物氰活化生成亞氨基碳酸衍生物烷基化法烷基化法含羥基的載體可用三氯含羥基的載體可用三氯- -均三嗪等多鹵代物均三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體back4、交聯(lián)法、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是特點(diǎn)此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶的，所不同的利用共價(jià)鍵固定酶的，所不同的是不使用載體是不使用載體雙功能試劑戊二醛、己二胺、雙雙功能試劑戊二醛、己二胺、雙偶氮苯等偶氮苯等第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽第一篇報(bào)道是：戊二醛交

16、聯(lián)羧肽酶酶 得到一種分子間交聯(lián)的固定得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶化酶酶酶雙功雙功能劑能劑戊二醛戊二醛:(p.163）優(yōu)點(diǎn)結(jié)合牢固，可以長(zhǎng)時(shí)間使用優(yōu)點(diǎn)結(jié)合牢固，可以長(zhǎng)時(shí)間使用缺點(diǎn)因交聯(lián)反應(yīng)激烈，酶分子多個(gè)基缺點(diǎn)因交聯(lián)反應(yīng)激烈，酶分子多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活損失大，顆粒較小，團(tuán)被交聯(lián)，酶活損失大，顆粒較小，使用不便使用不便雙重固定化將其與吸附法、包埋法聯(lián)雙重固定化將其與吸附法、包埋法聯(lián)合使用合使用圖 711 酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶5、熱處理、熱處

17、理在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體體內(nèi)體內(nèi)適用性：熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化適用性：熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化嚴(yán)格控制加熱及其時(shí)間嚴(yán)格控制加熱及其時(shí)間back酶固定化方法示意圖酶固定化方法示意圖固定化酶方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較固定化酶方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較評(píng)估指標(biāo) 判斷固定化方法的優(yōu)劣及其固定化酶的實(shí)用性判斷固定化方法的優(yōu)劣及其固定化酶的實(shí)用性, ,常見的評(píng)估指標(biāo)有以下幾條常見的評(píng)估指標(biāo)有以下幾條: :(1)(1)相對(duì)酶活力相對(duì)酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力. .

18、 固定化酶活力固定化酶活力/ /（總酶活力未結(jié)合的酶活力）（總酶活力未結(jié)合的酶活力） 它與載體的結(jié)構(gòu)、顆粒大小、底物分子量大小及它與載體的結(jié)構(gòu)、顆粒大小、底物分子量大小及酶的結(jié)合效率有關(guān)相對(duì)酶活力低于酶的結(jié)合效率有關(guān)相對(duì)酶活力低于75%75%的固定的固定化酶化酶, ,一般沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值一般沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值 （2 2）酶結(jié)合效率（偶聯(lián)率）酶結(jié)合效率（偶聯(lián)率） （總酶活力未結(jié)合的酶活力（總酶活力未結(jié)合的酶活力)/)/總酶活力總酶活力 （總酶蛋白未結(jié)合的酶蛋白）（總酶蛋白未結(jié)合的酶蛋白）/ /總酶蛋白總酶蛋白 偶聯(lián)率偶聯(lián)率1 1時(shí)，表示反應(yīng)控制好，固定化或時(shí)，表示反應(yīng)控制好，固定化或擴(kuò)散限制引起的

19、酶失活不明顯；偶聯(lián)率擴(kuò)散限制引起的酶失活不明顯；偶聯(lián)率1 1時(shí)，擴(kuò)散限制對(duì)酶活力有影響；偶聯(lián)率時(shí)，擴(kuò)散限制對(duì)酶活力有影響；偶聯(lián)率1 1時(shí)，有細(xì)胞分裂或從載體排除抑制劑等原時(shí)，有細(xì)胞分裂或從載體排除抑制劑等原因。因。 (3)(3)酶活力回收率：酶活力回收率： 固定化酶的總活力與固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力的百分比稱為酶的用于固定化的酶的活力的百分比稱為酶的活力回收率。活力回收率。固定化酶總活力固定化酶總活力/ /用于固定化的總酶用于固定化的總酶活力活力 測(cè)定酶的活力回收率可以確定固定化的效測(cè)定酶的活力回收率可以確定固定化的效果一般情況下果一般情況下, ,活力回收率應(yīng)小于活力回收率應(yīng)小于

20、1,1,若大若大于于1,1,可能由于固定化活細(xì)胞增殖或某些抑可能由于固定化活細(xì)胞增殖或某些抑制因素排除的結(jié)果制因素排除的結(jié)果 (4)(4)固定化酶的半衰期固定化酶的半衰期 即固定化酶的活力即固定化酶的活力下降到為初始活力一半所經(jīng)歷的時(shí)間。它下降到為初始活力一半所經(jīng)歷的時(shí)間。它是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵其測(cè)是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵其測(cè)定方法可以通過(guò)長(zhǎng)期實(shí)際操作定方法可以通過(guò)長(zhǎng)期實(shí)際操作, ,也可以通過(guò)也可以通過(guò)較短時(shí)間的操作來(lái)推算較短時(shí)間的操作來(lái)推算1 1、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性( (linklink) )2 2、最適溫度、最適溫度( (linklink) )3 3、最適、最適pHpH( (l

21、inklink) )4 4、底物特異性、底物特異性( (linklink) ) go二、固定化酶的性質(zhì)二、固定化酶的性質(zhì)1、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性比游離酶的好比游離酶的好（1 1）對(duì)熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度）對(duì)熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度A固定化酶固定化酶B游離酶游離酶穩(wěn)定性穩(wěn)定性(續(xù)續(xù))（2 2）保存穩(wěn)定性好，保存時(shí)間延長(zhǎng)）保存穩(wěn)定性好，保存時(shí)間延長(zhǎng)（3 3）對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解）對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解（4 4）對(duì)變性劑）對(duì)變性劑( (如尿素、有機(jī)溶劑、鹽酸胍等如尿素、有機(jī)溶劑、鹽酸胍等) )的的耐受性提高，保留較高酶活耐受性提高，保留較高酶活（5

22、5）對(duì)酶抑制劑、對(duì)不同）對(duì)酶抑制劑、對(duì)不同pHpH穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高. .(back)2、最適溫度、最適溫度與游離酶差不多與游離酶差不多A固定化酶固定化酶B游離酶游離酶最適溫度最適溫度(續(xù)續(xù))例外例外用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游離酶高比游離酶高5-10;5-10;以共價(jià)結(jié)合法固定的色氨酸酶，比游離酶高以共價(jià)結(jié)合法固定的色氨酸酶，比游離酶高5-15 5-15 湯亞杰以交聯(lián)法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為湯亞杰以交聯(lián)法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為80 80 ，比固定化前提高了，比固定化前提高了30 30 。同一種酶，用不同一種酶，

23、用不同的方法或載體進(jìn)行固定化，其最適溫度可能不同同的方法或載體進(jìn)行固定化，其最適溫度可能不同不同方法和載體固定化氨基?；傅淖钸m溫度不同方法和載體固定化氨基?；傅淖钸m溫度(back)3、最適、最適pH值值酶固定化后，對(duì)底物作用的最適酶固定化后，對(duì)底物作用的最適pHpH和酶和酶pHpH曲線常發(fā)生偏曲線常發(fā)生偏移（見圖），原因是微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響移（見圖），原因是微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響pHpH對(duì)固定化前后天冬酰胺酶活力的影響對(duì)固定化前后天冬酰胺酶活力的影響帶負(fù)電荷的載體，帶負(fù)電荷的載體，固定化酶最適固定化酶最適pH值值比游離酶的高比游離酶的高(1)載體的帶電性質(zhì)對(duì)最適載體的帶電性質(zhì)對(duì)最適

24、pH的影響的影響原因原因:吸引作用吸引作用帶正電荷的載體，帶正電荷的載體，固定化酶最適固定化酶最適pH值值比游離酶的低比游離酶的低H+H+H+H+H+H+H+偏酸微偏酸微環(huán)境環(huán)境OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+H+大環(huán)境偏堿大環(huán)境偏堿酶酶不帶電荷的載體，固定化酶最適不帶電荷的載體，固定化酶最適pH值一般不變值一般不變(2)產(chǎn)物酸堿性對(duì)最適產(chǎn)物酸堿性對(duì)最適pH值的影響值的影響酸性酸性: :固定化酶的最適固定化酶的最適pHpH值比游離酶的高值比游離酶的高堿性堿性: :固定化酶的最適固定化酶的最適pHpH值比游離酶的低值比游離酶的低中性中性: :固定化酶的最適固定化酶的最適pHpH值一般不變

25、值一般不變?cè)蛟? :載體障礙產(chǎn)物的擴(kuò)散載體障礙產(chǎn)物的擴(kuò)散(back)4、底物的特異性、底物的特異性與底物分子量的大小有關(guān)與底物分子量的大小有關(guān); ;作用于低分子量底物的酶，沒(méi)有明顯變化，如氨基作用于低分子量底物的酶，沒(méi)有明顯變化，如氨基?；?、葡聚糖氧化酶等?；浮⑵暇厶茄趸傅? ;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往會(huì)發(fā)生變化。如，固定在羧甲基纖維素上酶，往往會(huì)發(fā)生變化。如，固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽的作用保持不變，而對(duì)的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽的作用保持不變，而對(duì)酪蛋白的作用僅為游離酶的酪蛋白的作用僅為游離酶

26、的3%3%左右左右原因原因: :載體的空間位阻作用載體的空間位阻作用(back)三、固定化酶的應(yīng)用三、固定化酶的應(yīng)用1 1、工業(yè)生產(chǎn)、工業(yè)生產(chǎn)(link)(link)2 2、酶?jìng)鞲衅?、酶?jìng)鞲衅?link)(link)3 3、藥物控釋載體、藥物控釋載體（link) link) go1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用(1)(1)氨基酰化酶氨基?；窤minoacylase首例，首例，19691969年，日本田邊制藥公司，年，日本田邊制藥公司，DEAE-DEAE-葡聚葡聚糖凝膠固定化酶糖凝膠固定化酶, ,拆分拆分DL-DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)產(chǎn)L-aaL-

27、aa，成本降低，成本降低40%40%左右。左右。DL-乙酰乙酰 Ala L Ala +乙酸乙酸泵泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)離心機(jī)消消旋旋反反應(yīng)應(yīng)器器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用(續(xù)續(xù))(2)(2)葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶規(guī)模最大。規(guī)模最大。19731973年。熱處理法，國(guó)內(nèi)外廣泛研究和應(yīng)用。年。熱處理法，國(guó)內(nèi)外廣泛研究和應(yīng)用。(3)(3)天門冬氨酸酶天門冬氨酸酶19731973年，日本，聚丙烯酰胺凝膠為載體固定化具高活力天冬氨年，日本，聚丙烯酰胺凝膠為載體固定化具高活力天冬氨酸酶的大腸桿菌體，

28、包埋法，將延胡索酸轉(zhuǎn)化成酸酶的大腸桿菌體，包埋法，將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-L-天冬氨酸。天冬氨酸。19781978年，角叉菜膠固定化純酶，離子鍵結(jié)合法。年，角叉菜膠固定化純酶，離子鍵結(jié)合法。(4)(4)青霉素酰化酶青霉素?；?9731973年，催化年，催化青霉素青霉素或或頭孢菌素頭孢菌素水解水解生成生成6-6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6-(6-APAAPA）或）或7-7-氨基頭孢霉烷酸氨基頭孢霉烷酸(7-ACA),(7-ACA),也可催化也可催化6-APA6-APA或或7-ACA+7-ACA+羧羧酸衍生物合成不同側(cè)鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素酸衍生物合成不同側(cè)鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素; ;6-氨基

29、青霉烷酸氨基青霉烷酸青霉素青霉素頭孢霉素頭孢霉素固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用(續(xù)續(xù))(5)(5)延胡索酸酶延胡索酸酶19741974年，由延胡索酸制年，由延胡索酸制L-L-蘋果酸，聚丙烯酰胺包埋蘋果酸，聚丙烯酰胺包埋法，產(chǎn)氨短桿菌體。法，產(chǎn)氨短桿菌體。19771977年，由延胡索酸制年，由延胡索酸制L-L-蘋果酸，角叉菜膠包埋法，蘋果酸，角叉菜膠包埋法，黃色短桿菌黃色短桿菌(6)(6)- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶19771977年，水解乳中的乳糖生產(chǎn)低乳糖奶年，水解乳中的乳糖生產(chǎn)低乳糖奶(7)(7)天門冬氨酸天門冬氨酸- - - -脫羧酶脫羧酶19821982年，天門冬氨

30、酸生產(chǎn)年，天門冬氨酸生產(chǎn)L-L-丙氨酸。假單孢菌，凝丙氨酸。假單孢菌，凝膠包埋膠包埋Back、固定化酶在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用、固定化酶在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用酶?jìng)鞲衅魇怯晒潭ɑ概c能量轉(zhuǎn)換器酶?jìng)鞲衅魇怯晒潭ɑ概c能量轉(zhuǎn)換器( (電極、電極、場(chǎng)效應(yīng)管、離子選擇場(chǎng)效應(yīng)管場(chǎng)效應(yīng)管、離子選擇場(chǎng)效應(yīng)管) )密切結(jié)合而密切結(jié)合而成的傳感裝置，屬于成的傳感裝置，屬于生物傳感器生物傳感器的一種的一種酶電極酶電極: :固定化酶固定化酶+ +電極，應(yīng)用最廣泛電極，應(yīng)用最廣泛; ;用途用途: :臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過(guò)程控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過(guò)程控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)go生物傳感器生物傳感器用生物活性材料（酶、蛋白質(zhì)、用生

31、物活性材料（酶、蛋白質(zhì)、DNADNA、抗體、抗、抗體、抗原、原、 生物膜等）與物理、化學(xué)傳感器有機(jī)結(jié)合生物膜等）與物理、化學(xué)傳感器有機(jī)結(jié)合的一門交叉學(xué)科，是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一的一門交叉學(xué)科，是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進(jìn)的檢測(cè)方法與監(jiān)控手段，也是物質(zhì)分子水種先進(jìn)的檢測(cè)方法與監(jiān)控手段，也是物質(zhì)分子水平的快速、微量分析方法平的快速、微量分析方法; ;在在2121世紀(jì)生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展中，生物傳感技術(shù)將是介世紀(jì)生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展中，生物傳感技術(shù)將是介于于信息和生物技術(shù)信息和生物技術(shù)之間的新增長(zhǎng)點(diǎn)之間的新增長(zhǎng)點(diǎn); ;中國(guó)生物傳感器中國(guó)生物傳感器的研究起步于的研究起步于 70 70年代末期年代末期 。早。早

32、期研究普遍采取氧電極作生物反應(yīng)中的換能器期研究普遍采取氧電極作生物反應(yīng)中的換能器 , ,以葡萄糖氧化酶為活性材料以葡萄糖氧化酶為活性材料一、概述一、概述生物傳感器生物傳感器(續(xù)續(xù))早期的血糖速測(cè)儀早期的血糖速測(cè)儀我國(guó)第一種實(shí)用化的生物傳感我國(guó)第一種實(shí)用化的生物傳感器器-SBA-30-SBA-30型乳酸分析儀型乳酸分析儀維生素維生素C C速測(cè)儀速測(cè)儀 生物傳感器生物傳感器(續(xù)續(xù)) 傳感器能將一種被測(cè)信號(hào)（參量）轉(zhuǎn)換成一種傳感器能將一種被測(cè)信號(hào)（參量）轉(zhuǎn)換成一種可輸出信號(hào)的裝置可輸出信號(hào)的裝置。 生物傳感器生物傳感器(biosensors):(biosensors):用生物成分作為感用生物成分作為

33、感受器的傳感器。由感受器、換能器、電子線器受器的傳感器。由感受器、換能器、電子線器組成組成二、生物傳感器組成和工作原理二、生物傳感器組成和工作原理感知固定化配基與感知固定化配基與待測(cè)物結(jié)合產(chǎn)生的待測(cè)物結(jié)合產(chǎn)生的微小變化，把這種微小變化，把這種變化轉(zhuǎn)化為其它可變化轉(zhuǎn)化為其它可識(shí)別信號(hào)，其質(zhì)量識(shí)別信號(hào)，其質(zhì)量好壞決定了傳感器好壞決定了傳感器的靈敏度。的靈敏度。換能器換能器是生物傳感器的心臟，整是生物傳感器的心臟，整個(gè)生物傳感器的核心技術(shù)個(gè)生物傳感器的核心技術(shù)也在此。制備分兩方面工也在此。制備分兩方面工作，一是選擇最佳載體材作，一是選擇最佳載體材料（需活化）；二是在載料（需活化）；二是在載體表面固定

34、化親和配基體表面固定化親和配基（非共價(jià)和共價(jià)）（非共價(jià)和共價(jià)）感受器感受器葡萄糖氧化酶電極葡萄糖氧化酶電極19621962年年 Clark Clark和和LyonsLyons提提出模型出模型19671967年年 Updike Updike和和HicksHicks首先制造首先制造聚丙烯酰胺凝膠包埋法固聚丙烯酰胺凝膠包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜定化葡萄糖氧化酶，酶膜強(qiáng)度強(qiáng)度2050um2050um基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)酶膜酶膜+ +多分子膜多分子膜( (聚四氟己烯等聚四氟己烯等)+)+氧電極氧電極圖圖5-1 葡萄糖氧化酶電極葡萄糖氧化酶電極感應(yīng)電極酶電極示意圖D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5內(nèi)酯H2O半

35、透膜半透膜酶膠層酶膠層GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根據(jù)反應(yīng)中消耗的根據(jù)反應(yīng)中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧電極、可以用氧電極、pHpH電極和電極和H H2 2O O2 2電極來(lái)測(cè)定葡萄糖的含量。電極來(lái)測(cè)定葡萄糖的含量。 脲電極Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶產(chǎn)生的產(chǎn)生的2NH4+為陽(yáng)離子電極感應(yīng)。為陽(yáng)離子電極感應(yīng)。此外還有：氨基酸電極醇電極尿酸電極乳酸電極青霉素電極亞硝酸離子電極：菠菜亞

36、硝酸還原酶產(chǎn)生NH3青霉素酶電極青霉素酶電極酶膜酶膜: :青霉素酶青霉素酶+ +聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠( (或光交聯(lián)樹脂或光交聯(lián)樹脂) )電極電極:pH:pH電極電極結(jié)合結(jié)合: :酶膜緊貼在玻璃酶膜緊貼在玻璃(pH)(pH)電極上電極上反應(yīng)反應(yīng): :青霉素青霉素+H2O 青霉烷酸青霉烷酸+H+青霉素酶青霉素酶表表5-1 一些常用的酶電極一些常用的酶電極back固定化酶在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用固定化酶在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用(續(xù)續(xù))圖圖4 4、SBA-40SBA-40型谷氨酸葡型谷氨酸葡萄糖雙功能分析儀萄糖雙功能分析儀 圖圖5 5、SBA-50SBA-50型糖化酶型糖化酶生物傳感分析儀生物傳感分析

37、儀SBA-70SBA-70型生物傳感在線血糖乳酸自動(dòng)分析系統(tǒng)型生物傳感在線血糖乳酸自動(dòng)分析系統(tǒng) 固定化酶在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用固定化酶在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用(續(xù)續(xù))Back藥物控釋載體藥物控釋載體藥物應(yīng)用臨床不順利的原因藥物應(yīng)用臨床不順利的原因: :蛋白類藥物被胃酸破壞蛋白類藥物被胃酸破壞被肝和血液中的酶系統(tǒng)清除被肝和血液中的酶系統(tǒng)清除藥物本身毒副作用藥物本身毒副作用免疫問(wèn)題免疫問(wèn)題藥物穩(wěn)定性差藥物穩(wěn)定性差建立合理的給藥體系，核心是從時(shí)建立合理的給藥體系，核心是從時(shí)間和空間分布上控制藥物的釋放間和空間分布上控制藥物的釋放控釋體系涉及到將藥物與聚合物載控釋體系涉及到將藥物與聚合物載體偶聯(lián)或固定于某種

38、聚合物載體上，體偶聯(lián)或固定于某種聚合物載體上，也稱載體藥物也稱載體藥物(1) (1) 聚合物修飾聚合物修飾(2)(2)凝膠包埋凝膠包埋(3)(3)微球制劑微球制劑(4)(4)脂質(zhì)體脂質(zhì)體(5)(5)導(dǎo)向藥物導(dǎo)向藥物Back第二節(jié) 細(xì)胞固定化 細(xì)胞特性比較概念： 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞.該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。增殖細(xì)胞。固定化細(xì)胞的特點(diǎn)固定化細(xì)胞的特點(diǎn)類型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞類型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)：生理狀態(tài)： 活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。 最多使用：顆粒狀珠體最多使用：顆粒狀珠體使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性，部活性， 只要載體不解體，不污染就可以長(zhǎng)期使用。只要載體不解體，不污染就可以