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1、Chignolin蛋白的高壓變性研究（題目：小二號黑體加黑）王貞營（姓名：小四黑體）(德州學院物理系，山東德州253023)（院系：五號黑體）摘 要 隨著計算機模擬技術的發(fā)展，本文利用GROMACS軟件，對Chignolin在2000bar和10000bar兩個壓強下進行的獨立的分子動力學模擬，以揭示壓強對蛋白質(zhì)去折疊（變性）的影響并探討其機理。通過分析模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Chignolin蛋白在高溫下RMSD最大時去折疊程度明顯不同;小蛋白隨著壓強的增加其折疊與去折疊過程有一個反復階段;高壓下的蛋白質(zhì)去折疊不是完全折疊;高壓對Chignolin的構(gòu)象影響較大，變性明顯，甚至出現(xiàn)了完全去折疊的情況。

2、關鍵詞 Chignolin; 分子動力學模擬； 去折疊； 高壓（“摘要”和“關鍵詞”字樣用五號黑體字，后空一格用五號宋體字單倍行距打印摘要內(nèi)容，“摘要”兩字中間空兩空格，關鍵詞用五號宋體，每個關鍵詞后用“；”再空兩格。摘要內(nèi)容在200-300字之間，不分段。） 緒論（一級標題：小三號黑體，頂格寫）（正文部分均用小四號宋體，1.5倍行距）蛋白質(zhì)是一切生命活動的主要物質(zhì)基礎，結(jié)構(gòu)決定其功能。蛋白質(zhì)折疊和去折疊問題是當前生物信息學、生物物理學等生命科學領域面臨的一項長期而具有極其重要地位的課題。其重要任務之一便是通過施加外界驅(qū)動力（如溫度，壓強，機械力等）來致使蛋白質(zhì)變性，通過研究其去折疊過程探索蛋

3、白質(zhì)的折疊和去折疊機制。近年來隨著實驗手段和計算機水平的不斷提高，許多實驗儀器和理論方法被用來研究蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過程。從實驗上研究蛋白質(zhì)高壓去折疊存在著各種問題,如時間周期長，設備復雜、昂貴；且技術難度大等，無法在原子層次和飛秒分辨率下進行研究。用計算機模擬的理論方法研究蛋白質(zhì)的高壓去折疊是實驗研究的有利補充，可以在原子層次和很高的時間分辨率上研究實驗無法實現(xiàn)的新現(xiàn)象，對實驗研究有重要的指導作用。分子動力學模擬可以從原子水平和飛秒分辨率上研究蛋白質(zhì)的高壓去折疊，這一點目前實驗上無法實現(xiàn)。目前對蛋白質(zhì)折疊的研究采取的策略之一就是用加速去折疊過程來研究蛋白質(zhì)的折疊問題。蛋白質(zhì)去折疊可以通過誘

4、導變性條件加速其進程，這樣可以對蛋白質(zhì)構(gòu)象膨脹的早期階段進行觀察，而這種過程在一定程度上反映了蛋白質(zhì)的折疊過程1 。蛋白質(zhì)高壓去折疊（變性）的研究是當今蛋白質(zhì)工程中還未完全解決的一項重要內(nèi)容。對溫度導致去折疊過程已經(jīng)進行了廣泛的研究,而對壓強導致蛋白質(zhì)去折疊（變性）的研究相對較少，僅做了少量的模擬研究1。上角標1：表示參考文獻，要求與后面參考文獻標號一一對應，正文中的參考文獻按照先后順序從1、22蛋白質(zhì)和分子動力學模擬原理21 蛋白質(zhì)（二級標題：四號黑體，頂格寫） 蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，在體內(nèi)占有特殊的地位，是生命活動的主要承擔者，是生命現(xiàn)象的主要物質(zhì)基礎。它是由一系列-氨基酸通過縮水

5、過程而聚合成一種線性的高分子物質(zhì)。作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，自然界共有20種-氨基酸。它們具有相似的結(jié)構(gòu)特征，差別在于連接在殘基原子上的側(cè)鏈R的不同。不同的側(cè)鏈形成各種氨基酸各種不同的理化特性。根據(jù)它們在水溶液中的表現(xiàn)，可分為疏水性氨基酸和親水性氨基酸。為了表達蛋白質(zhì)的不同組織層次，經(jīng)常使用一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)（二、三、四級結(jié)構(gòu)）等術語對其分子結(jié)構(gòu)進行闡述。 從能量的角度看，蛋白質(zhì)系統(tǒng)有很多自由度，其能量曲面可看作是高維的曲面。蛋白質(zhì)折疊的過程可看作是順著折疊漏斗發(fā)生的過程。折疊被看成一個鏈狀分子系統(tǒng)的平行流的過程，就像很多溪水從具有復雜地形結(jié)構(gòu)的山坡上流下，而不僅僅是一條溪水從單一山谷中流下。

6、圖2-1 具有高低起伏的能量面（圖標：五號宋體）（所有圖標的標注以章節(jié)為基礎，如圖2-1、2-2、；3-1、3-2、）研究蛋白質(zhì)的折疊過程，對于了解蛋白質(zhì)的折疊機制，理解蛋白質(zhì)的快速折疊的來源，都是必不可少的一個方面。我們通過一個簡化的統(tǒng)計模型中勾畫出折疊過程的簡單圖像，通過引入短程相關的協(xié)作性特征，在一定程度上刻畫了蛋白質(zhì)動力學對折疊結(jié)構(gòu)的依賴性；并根據(jù)統(tǒng)計物理的方法討論了復溫度場中體系的配分函數(shù)的零點，并由此分析了體系相變的特征，這不僅重新檢驗了原有理論，為其提供了理論上的可靠性，而且提供了一條途徑，對蛋白質(zhì)的折疊轉(zhuǎn)變的熱力學性質(zhì)進行更為細致的刻畫，為不同模型之間的比較提供了有益的參考。2

7、2 分子動力學（MD） 生物大分子的分子動力學模擬方法，無論是在模擬算法和力場參數(shù)，還是在模擬體系的大小，模擬時間的長短上，都取得了巨大的進步。這些進步使得計算機模擬技術成為了除X射線晶體學方法和核磁共振波譜學方法外又一個研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關系的重要工具。通過對生物大分子的模擬，一方面我們可以從原子水平上解釋實驗現(xiàn)象和結(jié)果，另一方面我們可以得到一般實驗無法獲得的微觀信息。在分子動力學模擬中，我們把每個原子看作一個粒子，對于一個含有N個粒子的體系，我們把第i個粒子的質(zhì)量記為Mi，它的空間位置計作矢量ri，而空間坐標的一級和二級導數(shù)我們用和來表示。根據(jù)牛頓第二定律： （2.2）（重要公式的標注：

8、同圖標，以章節(jié)為基礎，如：2.1、2.1、等）這里的是所有其它粒子作用到粒子i 上的合力，這可以由N個粒子的位能函數(shù)V的負梯度表示，即： （2.3）在笛卡爾座標中，可以用它的3個分量來表示。若Xi(t)是時刻t粒子i在x方向的座標。使用泰勒（Taylor）展開，我們可以得到：（2.4）（2.5）其中和分別表示t時刻粒子i在方向的速度和加速度。上述兩式的方程是精確的，但是含有無限項。在實際中我們通常用Verlet方法進行近似求解。方法如下：將2.4和2.5兩式分別相加和相減得到：（2.6）其中：（2.7）由于在t和t-t時刻，第i個粒子位置是知道的，加速度可以從位能函數(shù)的負梯度求出。所以以后任何

9、時刻粒子的位置，速度和加速度都可迭代求解。這就是計算牛頓運動方程的Verlet方法3。23 經(jīng)驗力場和位能函數(shù) 分子動力學模擬方法是把分子體系看作在勢能面中質(zhì)點的運動4。為了便于描述往往選用某些與原子座標相關的函數(shù)對勢能面進行擬合，得到勢能面的近似解析表示。這種勢均力敵能面的表示方法稱為力場（force field）,而這和與坐標相關的函數(shù)稱為位能函數(shù)。 近10多年來已發(fā)展了多種力場，它們基本形式是相似的，只是在能量函數(shù)各項的選取和參量化上有差別。其中常用的有AMBER CHARMM GROMOS 和CVFF等力場。2.3.1 能量優(yōu)化（三級標題：小四黑體，前面空兩空格（一個漢字字符）分子動力

10、學模擬與能量優(yōu)化是緊密相關的，但又是存在明顯差別的兩種方法。兩者緊密的聯(lián)系是都使用相同的力場和位能函數(shù)，因而在程序化時，他們有大量相同的子程序。兩者最大的差別是與時間的關聯(lián)上。分子動力學模擬考慮體系結(jié)構(gòu)與能量的時間演化，而能量優(yōu)化則只是搜尋構(gòu)象空間的某個靜態(tài)點，在這一點上作用在每個原子上的力都達到平衡，因而體系是穩(wěn)定的。能量優(yōu)化得到的構(gòu)象僅是體系的局域極小構(gòu)象。盡管能量優(yōu)化不能給出構(gòu)象演化的信息和體系的總體能量極小構(gòu)象，但它可以用于優(yōu)化X射線晶體學，多維NMR波譜學方法所測定的實際驗結(jié)構(gòu)；它還可以用于研究生物大分子的局域構(gòu)象（如loop區(qū)等）；可以分析配體與受體的對接（docking）過程；可

11、以為分子動力學模擬準備初始構(gòu)象，等等5,6。3 Chignolin小蛋白的去折疊研究3. 1 分子動力學模擬的準備工作本實驗就是利用GROMACS這一軟件對Chignolin小蛋白進行高壓去折疊研究。本實驗的工作平臺是Linux。Linux系統(tǒng)作為GROMACS程序軟件包的工作平臺，分子動力學模擬的前期準備工作是做好本次模擬實驗至關重要的一個環(huán)節(jié)，其步驟如下：1、對pdb文件的轉(zhuǎn)換先將pdb文件轉(zhuǎn)化為GROMACS文件（*,gro）。Pdb文件中的原始數(shù)據(jù)經(jīng)常不完全，與碳原子相連的氫原子常常會漏掉。轉(zhuǎn)換工具pdb2gmx檢查結(jié)構(gòu)文件中每一個殘基并補充上所有缺失的氫原子。在轉(zhuǎn)換過程中它同時會生成

12、一個拓撲文件以記錄原子間的相互作用。在此過程中我們使用的是gromos9643a1力場（標準力場）。2、盒子的生成在模擬過程中我們要將蛋白質(zhì)置于含水的環(huán)境中。首先我們確定盒子的大小要適中，然后在盒子中加滿水。這兩個步驟分別是由Editconf和Genbox兩個子程序來完成。3、能量極小化能量極小化是由分子動力學程序mdrun來進行的。它的目的是用來除去蛋白質(zhì)中的氫原子產(chǎn)生的內(nèi)力，以及結(jié)構(gòu)過于緊密而導致的不正確的范德華力。Mdrun只輸入一個grompp結(jié)合拓撲文件（.top）、結(jié)構(gòu)文件（.gro）和參量文件（minim.mdp）而生成的軌跡文件（.tpr）。3. 2 Chignolin蛋白的系

13、統(tǒng)參數(shù)設置3.2.1 Chignolin小蛋白以人工設計的最小蛋白質(zhì)Chignolin（PDB代碼為1uao）為研究對象 。Chignolin是最近人工合成的迄今為止最小的蛋白，僅有十個殘基（GYDCPETGTWG），它的晶體結(jié)構(gòu)是由兩個片組成的發(fā)卡（圖1），是蛋白質(zhì)折疊/去折疊研究很好的模板，目前國內(nèi)外還尚未見有關chignolin高壓去折疊的有關報道。本文用充分含水模型對該蛋白在300K下，高壓影響去折疊過程進行研究，揭示壓強對蛋白質(zhì)去折疊（變性）的影響并探討其機理。3.2.2 系統(tǒng)參數(shù)的設置1、系統(tǒng)大小系統(tǒng)大小由程序editconf決定并將信息通過一個.out文件輸出。本次模擬將蛋白質(zhì)與

14、盒子邊沿距離設定為1.0nm，最終系統(tǒng)大小為3.95nm,3.72nm和3.11nm，系統(tǒng)體積為45.91nm。2、系統(tǒng)的組成由editconf生成的盒子限制了系統(tǒng)的大小后，經(jīng)過genbox填充了系統(tǒng)中未被蛋白質(zhì)分子占據(jù)的空間，可以從拓撲文件(.top)看出在這個過程中加入了1764個水分子。 由輸出的結(jié)果可以看出，系統(tǒng)中共有20個氨基酸殘基和1764個其它原子團，非氨基酸殘基原子團的數(shù)目恰好與拓撲文件中的水分子數(shù)目相等。在此之后，要對系統(tǒng)的典型進行中和，本次模擬是在系統(tǒng)中加入2個鈉離子，同時去掉一個水分子，最終系統(tǒng)有10個氨基酸、718個水分子和2個鈉離子組成。由于水的壓縮性系數(shù)隨著壓強的升

15、高而改變，在模擬中我們充分考慮了各高壓下壓縮性系數(shù)的改變情況（見表3-1）。表3-1 不同壓強下的壓縮性系數(shù)值（表頭：五號宋體，居中，其標注同圖標，以章節(jié)為基礎編號）Pressure (bar)Compressibility (bar-1)145.610-620003510-61000010.510-6 3. 3 實驗結(jié)果分析基于上述2000bar和10000bar兩個壓強下進行的獨立的分子動力學模擬，通過分析模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高壓對chignolin的構(gòu)象影響較大，變性明顯，甚至出現(xiàn)了完全去折疊的情況。進一步研究蛋白質(zhì)與周圍水分子的作用情況發(fā)現(xiàn)，水分子對chignolin的去折疊有著重要作用。

16、圖2給出了Chignolin在高壓2000bar和10000bar時的RMSD（root mean square deviations）和Rg(radius of gyration)隨時間變化圖。由圖2a可見，在2000bar時，Chignolin的RMSD在前5ns急劇增加，一致到13ns相對平穩(wěn)，在13ns達到第一個極大值，然后又一直到20ns平穩(wěn)上升，20ns左右急劇增加，達到極大值，此后出現(xiàn)劇烈震動，在30ns附近達到最大值，此時RMSD最大值為0.8（angstrom），圖3a給出了此時的構(gòu)象快照，可見此時Chignolin已經(jīng)完全去折疊。在10000bar時，從圖2a可以看出，RM

17、SD在前3ns一直上升，3ns后經(jīng)過一段時間的回落以后又持續(xù)上升在35ns附近到達最大值，由圖3b給出的在10000bar時Chignolin的構(gòu)象快照可見，在35.3ns小蛋白已經(jīng)完全去折疊。4 結(jié)論圖2是高壓影響下小蛋白去折疊的RMSD和Rg隨時間變化圖，由圖中可以發(fā)現(xiàn)，chignonlin在高壓影響下產(chǎn)生了比較明顯的變性，同時由圖2-a和圖2-b也可以看出，兩個壓強時RMSD和Rg變化趨勢較一致。圖3的結(jié)構(gòu)圖表明，小蛋白chignonlin在高壓下達到了完全去折疊。由于技術條件和其它因素的限制，對高壓誘導變性的研究相對較少，本論文研究的高壓誘導chignolin變性首次發(fā)現(xiàn)了小蛋白出現(xiàn)完

18、全去折疊，這是原來沒有發(fā)現(xiàn)的，但蛋白質(zhì)折疊機制是一個長期而復雜的課題，要解釋其機理還需要理論學家和實驗學家共同努力。希望我們的工作能為相關研究提供有用的理論依據(jù)。參考文獻（“參考文獻”字樣要求同一級標題，）文獻標號以方括號加阿拉伯數(shù)字，后空一格，文獻正文部分為五號字。參考文獻不能少于15篇，其中至少三篇外文文獻，15篇文獻中要求有至少五篇近三年的參考文獻。1 閻隆飛，孫之榮主編.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu).北京: 清華大學出版社,1999:250-2562 趙南明，周海夢主編. 生物物理學.北京:高等教育出版社,2000:3-53 王駿.蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)組成復雜性簡化的研究:博士論文,南京:南京大學物理

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20、amics simulation with an explicit water model. PHYSICAL REVIEW,2003:E67,316-3229 Liewei Wang, Tien V. Nguyen, Richard W. McLaughlin, Human thiopurine S-methyltransferase pharmacogenetics: Variant allozyme misfolding and aggresome formation . PNAS. originally published online Jun 20, 2005; 102;9394-9

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22、se . PNAS.1989;86;7260-7264 （英文摘要和關鍵詞（Abstract、Keywords）為12磅加粗Times New Roman字,其余為12磅Times New Roman字。）Study of High Pressure Induced Denaturation of Miniprotein Chinolin （18磅Times New Roman字加粗）Wang Zhenying(Department of Physics ,Dezhou University,Dezhou,253023)Abstract Along with the computer simu

23、lation technology development, in this paper the computer simulation of Chignolin protein unfolding is made by GROMACS in 2000bar and 10000 bar two intensities of pressure, promulgates the intensity of pressure folds (denaturation) to the protein the influence and discusses its mechanism. Discovered through the analysis analogue result that ,Chignolin protein when high temperature RMSD biggest obviously folds the de