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1、Chignolin蛋白的高壓變性研究（題目：小二號(hào)黑體加黑）王貞營(yíng)（姓名：小四黑體）(德州學(xué)院物理系，山東德州253023)（院系：五號(hào)黑體）摘 要 隨著計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的發(fā)展，本文利用GROMACS軟件，對(duì)Chignolin在2000bar和10000bar兩個(gè)壓強(qiáng)下進(jìn)行的獨(dú)立的分子動(dòng)力學(xué)模擬，以揭示壓強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)去折疊（變性）的影響并探討其機(jī)理。通過(guò)分析模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Chignolin蛋白在高溫下RMSD最大時(shí)去折疊程度明顯不同;小蛋白隨著壓強(qiáng)的增加其折疊與去折疊過(guò)程有一個(gè)反復(fù)階段;高壓下的蛋白質(zhì)去折疊不是完全折疊;高壓對(duì)Chignolin的構(gòu)象影響較大，變性明顯，甚至出現(xiàn)了完全去折疊的情況。

2、關(guān)鍵詞 Chignolin; 分子動(dòng)力學(xué)模擬； 去折疊； 高壓（“摘要”和“關(guān)鍵詞”字樣用五號(hào)黑體字，后空一格用五號(hào)宋體字單倍行距打印摘要內(nèi)容，“摘要”兩字中間空兩空格，關(guān)鍵詞用五號(hào)宋體，每個(gè)關(guān)鍵詞后用“；”再空兩格。摘要內(nèi)容在200-300字之間，不分段。） 緒論（一級(jí)標(biāo)題：小三號(hào)黑體，頂格寫(xiě)）（正文部分均用小四號(hào)宋體，1.5倍行距）蛋白質(zhì)是一切生命活動(dòng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)構(gòu)決定其功能。蛋白質(zhì)折疊和去折疊問(wèn)題是當(dāng)前生物信息學(xué)、生物物理學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)長(zhǎng)期而具有極其重要地位的課題。其重要任務(wù)之一便是通過(guò)施加外界驅(qū)動(dòng)力（如溫度，壓強(qiáng)，機(jī)械力等）來(lái)致使蛋白質(zhì)變性，通過(guò)研究其去折疊過(guò)程探索蛋

3、白質(zhì)的折疊和去折疊機(jī)制。近年來(lái)隨著實(shí)驗(yàn)手段和計(jì)算機(jī)水平的不斷提高，許多實(shí)驗(yàn)儀器和理論方法被用來(lái)研究蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過(guò)程。從實(shí)驗(yàn)上研究蛋白質(zhì)高壓去折疊存在著各種問(wèn)題,如時(shí)間周期長(zhǎng)，設(shè)備復(fù)雜、昂貴；且技術(shù)難度大等，無(wú)法在原子層次和飛秒分辨率下進(jìn)行研究。用計(jì)算機(jī)模擬的理論方法研究蛋白質(zhì)的高壓去折疊是實(shí)驗(yàn)研究的有利補(bǔ)充，可以在原子層次和很高的時(shí)間分辨率上研究實(shí)驗(yàn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的新現(xiàn)象，對(duì)實(shí)驗(yàn)研究有重要的指導(dǎo)作用。分子動(dòng)力學(xué)模擬可以從原子水平和飛秒分辨率上研究蛋白質(zhì)的高壓去折疊，這一點(diǎn)目前實(shí)驗(yàn)上無(wú)法實(shí)現(xiàn)。目前對(duì)蛋白質(zhì)折疊的研究采取的策略之一就是用加速去折疊過(guò)程來(lái)研究蛋白質(zhì)的折疊問(wèn)題。蛋白質(zhì)去折疊可以通過(guò)誘

4、導(dǎo)變性條件加速其進(jìn)程，這樣可以對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象膨脹的早期階段進(jìn)行觀察，而這種過(guò)程在一定程度上反映了蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程1 。蛋白質(zhì)高壓去折疊（變性）的研究是當(dāng)今蛋白質(zhì)工程中還未完全解決的一項(xiàng)重要內(nèi)容。對(duì)溫度導(dǎo)致去折疊過(guò)程已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究,而對(duì)壓強(qiáng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)去折疊（變性）的研究相對(duì)較少，僅做了少量的模擬研究1。上角標(biāo)1：表示參考文獻(xiàn)，要求與后面參考文獻(xiàn)標(biāo)號(hào)一一對(duì)應(yīng)，正文中的參考文獻(xiàn)按照先后順序從1、22蛋白質(zhì)和分子動(dòng)力學(xué)模擬原理21 蛋白質(zhì)（二級(jí)標(biāo)題：四號(hào)黑體，頂格寫(xiě)） 蛋白質(zhì)是一類(lèi)重要的生物大分子，在體內(nèi)占有特殊的地位，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是生命現(xiàn)象的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。它是由一系列-氨基酸通過(guò)縮水

5、過(guò)程而聚合成一種線性的高分子物質(zhì)。作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，自然界共有20種-氨基酸。它們具有相似的結(jié)構(gòu)特征，差別在于連接在殘基原子上的側(cè)鏈R的不同。不同的側(cè)鏈形成各種氨基酸各種不同的理化特性。根據(jù)它們?cè)谒芤褐械谋憩F(xiàn)，可分為疏水性氨基酸和親水性氨基酸。為了表達(dá)蛋白質(zhì)的不同組織層次，經(jīng)常使用一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)（二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)）等術(shù)語(yǔ)對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行闡述。 從能量的角度看，蛋白質(zhì)系統(tǒng)有很多自由度，其能量曲面可看作是高維的曲面。蛋白質(zhì)折疊的過(guò)程可看作是順著折疊漏斗發(fā)生的過(guò)程。折疊被看成一個(gè)鏈狀分子系統(tǒng)的平行流的過(guò)程，就像很多溪水從具有復(fù)雜地形結(jié)構(gòu)的山坡上流下，而不僅僅是一條溪水從單一山谷中流下。

6、圖2-1 具有高低起伏的能量面（圖標(biāo)：五號(hào)宋體）（所有圖標(biāo)的標(biāo)注以章節(jié)為基礎(chǔ)，如圖2-1、2-2、；3-1、3-2、）研究蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程，對(duì)于了解蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制，理解蛋白質(zhì)的快速折疊的來(lái)源，都是必不可少的一個(gè)方面。我們通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)化的統(tǒng)計(jì)模型中勾畫(huà)出折疊過(guò)程的簡(jiǎn)單圖像，通過(guò)引入短程相關(guān)的協(xié)作性特征，在一定程度上刻畫(huà)了蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)對(duì)折疊結(jié)構(gòu)的依賴(lài)性；并根據(jù)統(tǒng)計(jì)物理的方法討論了復(fù)溫度場(chǎng)中體系的配分函數(shù)的零點(diǎn)，并由此分析了體系相變的特征，這不僅重新檢驗(yàn)了原有理論，為其提供了理論上的可靠性，而且提供了一條途徑，對(duì)蛋白質(zhì)的折疊轉(zhuǎn)變的熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行更為細(xì)致的刻畫(huà)，為不同模型之間的比較提供了有益的參考。2

7、2 分子動(dòng)力學(xué)（MD） 生物大分子的分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，無(wú)論是在模擬算法和力場(chǎng)參數(shù)，還是在模擬體系的大小，模擬時(shí)間的長(zhǎng)短上，都取得了巨大的進(jìn)步。這些進(jìn)步使得計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)成為了除X射線晶體學(xué)方法和核磁共振波譜學(xué)方法外又一個(gè)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的重要工具。通過(guò)對(duì)生物大分子的模擬，一方面我們可以從原子水平上解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果，另一方面我們可以得到一般實(shí)驗(yàn)無(wú)法獲得的微觀信息。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，我們把每個(gè)原子看作一個(gè)粒子，對(duì)于一個(gè)含有N個(gè)粒子的體系，我們把第i個(gè)粒子的質(zhì)量記為Mi，它的空間位置計(jì)作矢量ri，而空間坐標(biāo)的一級(jí)和二級(jí)導(dǎo)數(shù)我們用和來(lái)表示。根據(jù)牛頓第二定律： （2.2）（重要公式的標(biāo)注：

8、同圖標(biāo)，以章節(jié)為基礎(chǔ)，如：2.1、2.1、等）這里的是所有其它粒子作用到粒子i 上的合力，這可以由N個(gè)粒子的位能函數(shù)V的負(fù)梯度表示，即： （2.3）在笛卡爾座標(biāo)中，可以用它的3個(gè)分量來(lái)表示。若Xi(t)是時(shí)刻t粒子i在x方向的座標(biāo)。使用泰勒（Taylor）展開(kāi)，我們可以得到：（2.4）（2.5）其中和分別表示t時(shí)刻粒子i在方向的速度和加速度。上述兩式的方程是精確的，但是含有無(wú)限項(xiàng)。在實(shí)際中我們通常用Verlet方法進(jìn)行近似求解。方法如下：將2.4和2.5兩式分別相加和相減得到：（2.6）其中：（2.7）由于在t和t-t時(shí)刻，第i個(gè)粒子位置是知道的，加速度可以從位能函數(shù)的負(fù)梯度求出。所以以后任何

9、時(shí)刻粒子的位置，速度和加速度都可迭代求解。這就是計(jì)算牛頓運(yùn)動(dòng)方程的Verlet方法3。23 經(jīng)驗(yàn)力場(chǎng)和位能函數(shù) 分子動(dòng)力學(xué)模擬方法是把分子體系看作在勢(shì)能面中質(zhì)點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)4。為了便于描述往往選用某些與原子座標(biāo)相關(guān)的函數(shù)對(duì)勢(shì)能面進(jìn)行擬合，得到勢(shì)能面的近似解析表示。這種勢(shì)均力敵能面的表示方法稱(chēng)為力場(chǎng)（force field）,而這和與坐標(biāo)相關(guān)的函數(shù)稱(chēng)為位能函數(shù)。 近10多年來(lái)已發(fā)展了多種力場(chǎng)，它們基本形式是相似的，只是在能量函數(shù)各項(xiàng)的選取和參量化上有差別。其中常用的有AMBER CHARMM GROMOS 和CVFF等力場(chǎng)。2.3.1 能量?jī)?yōu)化（三級(jí)標(biāo)題：小四黑體，前面空兩空格（一個(gè)漢字字符）分子動(dòng)力

10、學(xué)模擬與能量?jī)?yōu)化是緊密相關(guān)的，但又是存在明顯差別的兩種方法。兩者緊密的聯(lián)系是都使用相同的力場(chǎng)和位能函數(shù)，因而在程序化時(shí)，他們有大量相同的子程序。兩者最大的差別是與時(shí)間的關(guān)聯(lián)上。分子動(dòng)力學(xué)模擬考慮體系結(jié)構(gòu)與能量的時(shí)間演化，而能量?jī)?yōu)化則只是搜尋構(gòu)象空間的某個(gè)靜態(tài)點(diǎn)，在這一點(diǎn)上作用在每個(gè)原子上的力都達(dá)到平衡，因而體系是穩(wěn)定的。能量?jī)?yōu)化得到的構(gòu)象僅是體系的局域極小構(gòu)象。盡管能量?jī)?yōu)化不能給出構(gòu)象演化的信息和體系的總體能量極小構(gòu)象，但它可以用于優(yōu)化X射線晶體學(xué)，多維NMR波譜學(xué)方法所測(cè)定的實(shí)際驗(yàn)結(jié)構(gòu)；它還可以用于研究生物大分子的局域構(gòu)象（如loop區(qū)等）；可以分析配體與受體的對(duì)接（docking）過(guò)程；可

11、以為分子動(dòng)力學(xué)模擬準(zhǔn)備初始構(gòu)象，等等5,6。3 Chignolin小蛋白的去折疊研究3. 1 分子動(dòng)力學(xué)模擬的準(zhǔn)備工作本實(shí)驗(yàn)就是利用GROMACS這一軟件對(duì)Chignolin小蛋白進(jìn)行高壓去折疊研究。本實(shí)驗(yàn)的工作平臺(tái)是Linux。Linux系統(tǒng)作為GROMACS程序軟件包的工作平臺(tái)，分子動(dòng)力學(xué)模擬的前期準(zhǔn)備工作是做好本次模擬實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，其步驟如下：1、對(duì)pdb文件的轉(zhuǎn)換先將pdb文件轉(zhuǎn)化為GROMACS文件（*,gro）。Pdb文件中的原始數(shù)據(jù)經(jīng)常不完全，與碳原子相連的氫原子常常會(huì)漏掉。轉(zhuǎn)換工具pdb2gmx檢查結(jié)構(gòu)文件中每一個(gè)殘基并補(bǔ)充上所有缺失的氫原子。在轉(zhuǎn)換過(guò)程中它同時(shí)會(huì)生成

12、一個(gè)拓?fù)湮募杂涗浽娱g的相互作用。在此過(guò)程中我們使用的是gromos9643a1力場(chǎng)（標(biāo)準(zhǔn)力場(chǎng)）。2、盒子的生成在模擬過(guò)程中我們要將蛋白質(zhì)置于含水的環(huán)境中。首先我們確定盒子的大小要適中，然后在盒子中加滿水。這兩個(gè)步驟分別是由Editconf和Genbox兩個(gè)子程序來(lái)完成。3、能量極小化能量極小化是由分子動(dòng)力學(xué)程序mdrun來(lái)進(jìn)行的。它的目的是用來(lái)除去蛋白質(zhì)中的氫原子產(chǎn)生的內(nèi)力，以及結(jié)構(gòu)過(guò)于緊密而導(dǎo)致的不正確的范德華力。Mdrun只輸入一個(gè)grompp結(jié)合拓?fù)湮募?top）、結(jié)構(gòu)文件（.gro）和參量文件（minim.mdp）而生成的軌跡文件（.tpr）。3. 2 Chignolin蛋白的系

13、統(tǒng)參數(shù)設(shè)置3.2.1 Chignolin小蛋白以人工設(shè)計(jì)的最小蛋白質(zhì)Chignolin（PDB代碼為1uao）為研究對(duì)象 。Chignolin是最近人工合成的迄今為止最小的蛋白，僅有十個(gè)殘基（GYDCPETGTWG），它的晶體結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)片組成的發(fā)卡（圖1），是蛋白質(zhì)折疊/去折疊研究很好的模板，目前國(guó)內(nèi)外還尚未見(jiàn)有關(guān)chignolin高壓去折疊的有關(guān)報(bào)道。本文用充分含水模型對(duì)該蛋白在300K下，高壓影響去折疊過(guò)程進(jìn)行研究，揭示壓強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)去折疊（變性）的影響并探討其機(jī)理。3.2.2 系統(tǒng)參數(shù)的設(shè)置1、系統(tǒng)大小系統(tǒng)大小由程序editconf決定并將信息通過(guò)一個(gè).out文件輸出。本次模擬將蛋白質(zhì)與

14、盒子邊沿距離設(shè)定為1.0nm，最終系統(tǒng)大小為3.95nm,3.72nm和3.11nm，系統(tǒng)體積為45.91nm。2、系統(tǒng)的組成由editconf生成的盒子限制了系統(tǒng)的大小后，經(jīng)過(guò)genbox填充了系統(tǒng)中未被蛋白質(zhì)分子占據(jù)的空間，可以從拓?fù)湮募?.top)看出在這個(gè)過(guò)程中加入了1764個(gè)水分子。 由輸出的結(jié)果可以看出，系統(tǒng)中共有20個(gè)氨基酸殘基和1764個(gè)其它原子團(tuán)，非氨基酸殘基原子團(tuán)的數(shù)目恰好與拓?fù)湮募械乃肿訑?shù)目相等。在此之后，要對(duì)系統(tǒng)的典型進(jìn)行中和，本次模擬是在系統(tǒng)中加入2個(gè)鈉離子，同時(shí)去掉一個(gè)水分子，最終系統(tǒng)有10個(gè)氨基酸、718個(gè)水分子和2個(gè)鈉離子組成。由于水的壓縮性系數(shù)隨著壓強(qiáng)的升

15、高而改變，在模擬中我們充分考慮了各高壓下壓縮性系數(shù)的改變情況（見(jiàn)表3-1）。表3-1 不同壓強(qiáng)下的壓縮性系數(shù)值（表頭：五號(hào)宋體，居中，其標(biāo)注同圖標(biāo)，以章節(jié)為基礎(chǔ)編號(hào)）Pressure (bar)Compressibility (bar-1)145.610-620003510-61000010.510-6 3. 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析基于上述2000bar和10000bar兩個(gè)壓強(qiáng)下進(jìn)行的獨(dú)立的分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)分析模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高壓對(duì)chignolin的構(gòu)象影響較大，變性明顯，甚至出現(xiàn)了完全去折疊的情況。進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)與周?chē)肿拥淖饔们闆r發(fā)現(xiàn)，水分子對(duì)chignolin的去折疊有著重要作用。

16、圖2給出了Chignolin在高壓2000bar和10000bar時(shí)的RMSD（root mean square deviations）和Rg(radius of gyration)隨時(shí)間變化圖。由圖2a可見(jiàn)，在2000bar時(shí)，Chignolin的RMSD在前5ns急劇增加，一致到13ns相對(duì)平穩(wěn)，在13ns達(dá)到第一個(gè)極大值，然后又一直到20ns平穩(wěn)上升，20ns左右急劇增加，達(dá)到極大值，此后出現(xiàn)劇烈震動(dòng)，在30ns附近達(dá)到最大值，此時(shí)RMSD最大值為0.8（angstrom），圖3a給出了此時(shí)的構(gòu)象快照，可見(jiàn)此時(shí)Chignolin已經(jīng)完全去折疊。在10000bar時(shí)，從圖2a可以看出，RM

17、SD在前3ns一直上升，3ns后經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的回落以后又持續(xù)上升在35ns附近到達(dá)最大值，由圖3b給出的在10000bar時(shí)Chignolin的構(gòu)象快照可見(jiàn)，在35.3ns小蛋白已經(jīng)完全去折疊。4 結(jié)論圖2是高壓影響下小蛋白去折疊的RMSD和Rg隨時(shí)間變化圖，由圖中可以發(fā)現(xiàn)，chignonlin在高壓影響下產(chǎn)生了比較明顯的變性，同時(shí)由圖2-a和圖2-b也可以看出，兩個(gè)壓強(qiáng)時(shí)RMSD和Rg變化趨勢(shì)較一致。圖3的結(jié)構(gòu)圖表明，小蛋白chignonlin在高壓下達(dá)到了完全去折疊。由于技術(shù)條件和其它因素的限制，對(duì)高壓誘導(dǎo)變性的研究相對(duì)較少，本論文研究的高壓誘導(dǎo)chignolin變性首次發(fā)現(xiàn)了小蛋白出現(xiàn)完

18、全去折疊，這是原來(lái)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的，但蛋白質(zhì)折疊機(jī)制是一個(gè)長(zhǎng)期而復(fù)雜的課題，要解釋其機(jī)理還需要理論學(xué)家和實(shí)驗(yàn)學(xué)家共同努力。希望我們的工作能為相關(guān)研究提供有用的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)（“參考文獻(xiàn)”字樣要求同一級(jí)標(biāo)題，）文獻(xiàn)標(biāo)號(hào)以方括號(hào)加阿拉伯?dāng)?shù)字，后空一格，文獻(xiàn)正文部分為五號(hào)字。參考文獻(xiàn)不能少于15篇，其中至少三篇外文文獻(xiàn)，15篇文獻(xiàn)中要求有至少五篇近三年的參考文獻(xiàn)。1 閻隆飛，孫之榮主編.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu).北京: 清華大學(xué)出版社,1999:250-2562 趙南明，周海夢(mèng)主編. 生物物理學(xué).北京:高等教育出版社,2000:3-53 王駿.蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)組成復(fù)雜性簡(jiǎn)化的研究:博士論文,南京:南京大學(xué)物理

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20、amics simulation with an explicit water model. PHYSICAL REVIEW,2003:E67,316-3229 Liewei Wang, Tien V. Nguyen, Richard W. McLaughlin, Human thiopurine S-methyltransferase pharmacogenetics: Variant allozyme misfolding and aggresome formation . PNAS. originally published online Jun 20, 2005; 102;9394-9

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22、se . PNAS.1989;86;7260-7264 （英文摘要和關(guān)鍵詞（Abstract、Keywords）為12磅加粗Times New Roman字,其余為12磅Times New Roman字。）Study of High Pressure Induced Denaturation of Miniprotein Chinolin （18磅Times New Roman字加粗）Wang Zhenying(Department of Physics ,Dezhou University,Dezhou,253023)Abstract Along with the computer simu

23、lation technology development, in this paper the computer simulation of Chignolin protein unfolding is made by GROMACS in 2000bar and 10000 bar two intensities of pressure, promulgates the intensity of pressure folds (denaturation) to the protein the influence and discusses its mechanism. Discovered through the analysis analogue result that ,Chignolin protein when high temperature RMSD biggest obviously folds the de