細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法

1、實驗一 細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法一、目的要求1. 學習微生物涂片、染色的基本技術，并掌握革蘭氏染色的方法。2. 初步認識細菌的形態(tài)特征，掌握無菌操作技術。3. 了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。二、基本原理1. 簡單染色法：用單一染料進行細菌染色，操作簡便，適于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。 常用堿性染料進行簡單染色，這是因為：在中性、堿性或弱堿性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷），因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色，經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下易于識

2、別。常用作簡單染色的染料有：美藍、結晶紫、堿性復紅等。2. 革蘭氏染色法革蘭氏染色反應是細菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細菌的形態(tài)特征而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏染色陰性細菌，用G-表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是肽聚糖形成的網狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由于脫水而引起網狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫碘復合物被保留在細胞內而不

3、易著色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basic dye）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorising agent）和復染液(counterstain)。堿性染料的作用象在細菌的簡單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫(crystal violet)。媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和力或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細

4、胞上，使不易脫落，不同類型的細胞脫色反應不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95的酒精(ethanol)。復染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，從而將細胞區(qū)分成G+和G-兩大類群，常用的復染液是番紅。三、器材大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)1220h斜面培養(yǎng)物；革蘭氏染液，載玻片，顯微鏡

5、等。四、操作步驟1. 涂片 取兩塊載玻片，各滴一小滴蒸餾水于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作分別從培養(yǎng)1416h的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24h的大腸桿菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。載玻片要潔凈無油跡；滴蒸餾水和取菌不宜過多；涂片要均勻，不宜過厚。2. 干燥 室溫自然干燥。3. 固定 固定時通過火焰23次即可。此過程稱熱固定，其目的是使細胞質凝固，以固定細胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。熱固定溫度不易過高，以載玻片背面不燙手為宜，否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)。4. 染色（1）簡單染色法： 染色 滴加染液于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍染色12min；石炭酸復紅或草酸銨

6、結晶紫染色約1min。 水洗 傾去染液，用自來水沖洗，直至涂片上流下的水無色為止。水洗時，不要直接沖洗液面，而應使水從載玻片的一段流下，水流不易過急過大，以免涂片薄膜脫落。 干燥 自然干燥或用電吹風吹干，也可用吸水紙吸干。 鏡檢 涂片干燥后鏡檢。（2）革蘭氏染色法： 初染 加草酸銨結晶紫一滴，約12min，水洗。 媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min，水洗。 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)藍色時為止，約2030s，立即用水沖凈酒精。 復染 用番紅液染12min，水洗。 鏡檢 干燥后，置油鏡下觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開

7、的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。(3) 混合涂片法：按上述方法，在同一玻片上，以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌混合涂片、染色、鏡檢進行比較。革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。實驗二 細菌的芽孢和莢膜染色法一、實驗目的1. 學習并掌握芽孢和莢膜染色法2. 初步了解芽孢和莢膜的形態(tài)。二、基本原理芽孢又叫內生孢子(endosopre)，是某些細菌生長到一定階段在菌體內形成的休眠體，通常呈圓形或

8、橢圓形。細菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細菌的依據之一。芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當先用弱堿性染料，如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basic fuchsin）在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可進入菌體，而且也可進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用復染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。莢膜是包圍在細菌細胞外面的一層粘液性物質

9、，其主要成分是多糖類，不易染色，故常用襯托染色法，即將菌體和背景著色，而把不著色且透明的莢膜襯托出來。莢膜很薄，易變形，因此，制片時一般不用熱固定。三、器材枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），臘樣芽孢桿菌（B. cereus），球形芽孢桿菌(B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或膠質芽孢桿菌(B. mucilaginosus)約2d無氮培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物；孔雀綠染液，番紅水溶液，苯酚品紅溶液，黑色素溶液。莢膜染色液：繪圖墨水，1甲基紫水溶液，1結晶紫水溶液，6葡萄糖

10、水溶液，20硫酸銅水溶液，純甲醇等。四、操作步驟（一）莢膜染色技術方法一：（1）將培養(yǎng)24h左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約45min。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液染10min。（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再退色為止。（5）用番紅水溶液復染1min，水洗。（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。方法二：（1）取兩支潔凈的小試管，分別加入0.2mL無菌水，再往一管中加

11、入23接種環(huán)的臘樣芽孢桿菌的菌苔，另一管中加入23接種環(huán)的生孢梭菌的菌苔，兩管中各自充分混合成濃厚的菌懸液。（2）在菌懸液中分別加入0.2mL苯酚品紅溶液，充分混合后，于沸水浴中加熱35min。（3）用接種環(huán)分別取上述混合液23環(huán)于兩載玻片上，涂薄，風干后，將載玻片稍傾斜于燒杯上，用95乙醇沖洗至無紅色液流出。（4）再用自來水沖洗，濾紙吸干。（5）取12接種環(huán)黑色素溶液于涂片處，立即展開涂薄，自然風干后，油鏡觀察，在淡紫色背景的襯托下，菌體為白色，菌體內的芽孢為紅色。（二）莢膜染色技術1. 濕墨水法（1）制備菌和墨水混合液 加一滴水于潔凈的載玻片上，然后挑取少量菌體與其混合均勻。（2）加蓋玻片

12、 將一潔凈的蓋玻片蓋在混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，輕輕按壓以吸去多余的混合液。（3）鏡檢 用低倍鏡和高倍鏡觀察，若用相差顯微鏡觀察，效果更好。背景灰色，菌體較暗，在菌體周圍呈現(xiàn)明亮的透明圈即為莢膜。2. 干墨水法（1）在載玻片一端滴一滴6葡萄糖水溶液，取少許培養(yǎng)了72h的圓褐固氮菌在水滴中制成菌懸液，充分混勻。（2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用繪圖墨水）與菌懸液混合，另取一塊載玻片作為推片，將推片一端平整的邊緣與菌懸液以30角接觸后，順勢將菌懸液推向前方，使其成勻薄的一層，風干。（3）用純甲醇固定1min。（4）加番紅液數(shù)滴于涂片上，沖去殘余的甲醇，并染30s，以細水流適當沖洗，吸

13、干后油鏡檢查，背景黑色，莢膜無色，細胞紅色。3. Anthony法（1）涂片 按常規(guī)取菌涂片。（2）固定 空氣中自然干燥。不可加熱干燥固定。（3）染色 用1結晶紫水溶液染色2min。（4）脫色 以20硫酸銅水溶液沖洗，用吸水紙吸干殘液。（5）鏡檢 干后用油鏡觀察菌體染成深紫色，菌體周圍的莢膜呈淡紫色。實驗三 鞭毛染色法及活細菌運動性的觀察一、目的要求1. 學習并初步掌握鞭毛染色法，觀察細菌鞭毛的形態(tài)特征。2. 學習用壓滴法和懸滴法觀察細菌的運動性。二、基本原理鞭毛是細菌的運動“器官”，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛著生的位置和數(shù)目是細菌的一項這要形態(tài)特征。細菌的鞭毛很纖細，其直徑通常為0.010.

14、02m，所以，除了很少數(shù)能形成鞭毛束(由許多根鞭毛構成)的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，一般細菌的鞭毛均不能用光學顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。要用普通光學顯微鏡觀察細菌的鞭毛，必須用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。鞭毛染色方法很多，本實驗介紹硝酸銀染色法和改良的Leifson氏染色法，前一種方法更容易掌握，但染色劑配制后保存期較短。在顯微鏡下觀察細菌的運動性，也可以初步判斷細菌是否有鞭毛。細菌運動性的觀察可用壓滴法和懸滴法。觀察時，要適當減弱光強度以增強反差，若光線太強，細菌和周圍的液體難

15、以區(qū)分。三、器材蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiengsis)，假單胞菌(Pseudomonas sp.)，金黃色葡萄球菌；硝酸銀鞭毛染色液，Leifson氏染色液，0.01美藍水溶液；載玻片，蓋玻片，凹載玻片，無菌水，凡士林，顯微鏡等。四、操作步驟（一）鞭毛染色技術1. 硝酸銀染色法（1）菌種的準備 要求用活躍生長期菌種作鞭毛染色和運動性的觀察。對于冰箱保存的菌種，通常要連續(xù)移種12次，然后可選用下列方法接種培養(yǎng)作染色用菌種：a.取新配制的營養(yǎng)瓊脂斜面(表面較濕潤、基部有冷凝水)接種，2832培養(yǎng)1830h，讓菌種擴散生長，取菌落邊緣的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作染色觀察

16、的菌種材料。良好的培養(yǎng)物，是鞭毛染色成功的基本條件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培養(yǎng)物作鞭毛染色的菌種材料，因為老齡細菌鞭毛容易脫落。（2）載玻片的準備 將載玻片在含適量洗衣粉的水中煮約20min，取出用清水充分洗凈，瀝干后置95乙醇中，用時取出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。 玻片要求光滑、潔凈，尤其忌用帶油跡的玻片（將水滴在玻片上，無油跡玻片水能均勻散開）（3）菌液的制備 取斜面或平板菌種培養(yǎng)物數(shù)環(huán)于盛有12mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液用于制片。也可用培養(yǎng)物直接制片，但效果往往不如先制備菌液。 挑菌時，盡可能不帶培養(yǎng)基。（4）制片 取一滴菌液于載玻片上的一端，然后將玻片傾斜，使菌

17、液緩緩流向另一端，用吸水紙吸去玻片下端多余菌液，室溫（或37）自然干燥。 干后應盡快染色，不宜放置時間過長。（5）染色 涂片干燥后，滴加硝酸銀染色A液覆蓋3-5min，用蒸餾水充分洗去A液。用B液沖去殘水后，再加B液覆蓋涂片染色約數(shù)秒至1min，當涂面出現(xiàn)明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗。若加B液后顯色較慢，可用微火加熱，直至顯褐色時立即水洗。自然干燥。 配制合格的染色劑（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色時間均是鞭毛染色成敗的重要環(huán)節(jié)。（6）鏡檢 干后用油鏡觀察。觀察時，可從玻片的一端逐漸移至另一端，有時只在涂片的一定部位觀察到鞭毛。菌體呈深褐色，鞭毛顯褐色、通常呈波浪形。2.

18、 改良的Leifson氏染色法（1）載玻片的準備、菌種材料的準備用硝酸銀染色法。（2）制片 用記號筆在載玻片反面將玻片分成3-4個等分區(qū)，在每一小區(qū)的一端放一小滴菌液。將玻片傾斜，讓菌液流到小區(qū)的另一端，用濾紙吸去多余的菌液。室溫或37自然干燥。（3）染色 加Leifson氏染色液覆蓋第一區(qū)的涂面，隔數(shù)min后，加染液于第二涂面，如此繼續(xù)染第三、四區(qū)。間隔時間自行議定，其目的是為了確定最佳染色時間。在染色過程中仔細觀察，當整個玻片都出現(xiàn)鐵銹色沉淀、染料表面現(xiàn)出金色膜時，即直接用水輕輕沖洗（不要先傾去染料再沖洗，否則背景不清）。染色時間大約10min。自然干燥。（4）鏡檢 干后用油鏡觀察。菌體和

19、鞭毛均呈紅色。（二）運動性觀察玻片的準備、菌種材料的準備同鞭毛染色法。1. 壓滴法（1）制片 在潔凈載玻片上加一滴無菌水，挑取一環(huán)菌液與水混合，再加一環(huán)0.01的美藍水溶液與其混合均勻。用鑷子取一潔凈的蓋玻片，使其一邊與菌液邊緣接觸，然后將蓋玻片慢慢放下蓋在菌液上。觀察專性好氧菌時，可在放蓋玻片時壓入小氣泡，以防止細菌因缺氧而停止運動。（2）鏡檢 先用低倍鏡找到標本，再用高倍鏡觀察。也可用油鏡觀察，用油鏡時，蓋玻片厚度不能超過0.17nm。觀察時，要用略暗光線。 有鞭毛細菌可作直線、波浪式或翻滾運動，兩個細菌之間出現(xiàn)明顯的位移而與布朗運動或隨水流運動區(qū)別。2. 懸滴法（1）涂凡士林 取潔凈凹載

20、玻片，在其四周涂少許凡士林。（2）加菌液 在蓋玻片中央滴一小滴菌液。為便于觀察時尋找菌液位置，可用記號筆在菌液周圍畫上記號。菌液不能加得太多，為了便于觀察，也可用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液于蓋玻片中央。（3）蓋凹玻片 將凹玻片得凹槽對準蓋玻片中心得菌液，并輕輕蓋在蓋玻片上。輕輕按壓使蓋玻片與凹玻片粘合在一起，把液滴封閉在小室中。翻轉凹玻片，使菌液滴懸在蓋玻片下并位于凹槽中央。若菌液加得過多，此時菌液就會流到凹玻片上面影響觀察。（4）鏡檢 先用低倍鏡找到標本，并將液滴移至視野中央，然后用高倍鏡觀察。若用油鏡觀察，蓋玻片厚度不能超過0.17nm，并要十分細心，以免壓碎蓋玻片、損傷鏡頭。觀察過程要在略暗的光

21、線下進行。實驗四 酵母菌的形態(tài)觀察及死、活細胞的鑒別一、 實驗要求1. 觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學習區(qū)分酵母菌死、活細胞的染色方法。2. 掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細菌的區(qū)別。二、基本原理酵母菌是多形的、不運動的單細胞微生物，細胞核與細胞質已有明顯的分化，其大小通常比常見細菌大幾倍甚至幾十倍。繁殖方式也比較復雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產生子囊孢子。本實驗通過用美藍染色制成水浸片和水碘水浸片來觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。美藍是一種無毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無色的，用它來對酵母的活細胞進行染色，由于細胞中新陳代謝的

22、作用，使細胞內具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細胞無色，而對于死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，用美藍水浸片不僅可以觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細胞。但美藍的濃度、作用時間等均有影響，應加注意。三、器材釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或卡爾酵母（S. calsbergensis）；0.05%，0.1%呂氏堿性美藍染液，革蘭氏染色用的碘液；顯微鏡，載玻片，蓋玻片等。四、操作步驟1. 美藍浸片觀察（1）在載玻片中央滴加1滴0.1呂氏堿性美藍染液，液滴不可過多或過少，以免

23、蓋上蓋玻片時，溢出或留有氣泡。然后按無菌操作法取在豆芽汁瓊脂斜面上培養(yǎng)48h的釀酒酵母少許，放在呂氏堿性美藍染液中，使菌體與染液均勻混合。（2）用鑷子夾蓋玻片一塊，小心地蓋在液滴上。蓋片時應注意，不能將蓋玻片平放上去，應先將蓋玻片地一邊與液滴接觸，然后將整個蓋玻片慢慢放下，這樣可以避免產生氣泡。（3）將制好地水浸片放置3min后鏡檢。先用低倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察釀酒酵母的形態(tài)和出芽情況，同時可以根據是否染上顏色來區(qū)別死、活細胞。（4）染色0.5h后，再觀察一下死細胞數(shù)目是否增加。（5）用0.05呂氏堿性美藍染液重復上述的操作。2. 水碘浸片觀察在載玻片中央滴一滴革蘭氏染色用的碘液，然后再

24、在其上加三滴水，取釀酒酵母少許，放在水碘液滴中，使菌體與溶液混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。實驗五 細菌、放線菌、酵母及其它真菌菌落的比較及微觀形態(tài)觀察一、目的要求1. 觀察細菌、放線菌、酵母、青霉和平菇菌絲等代表種類的菌落形態(tài)特征。2. 觀察細菌、放線菌、酵母、青霉和平菇菌絲等代表種類的菌體的微觀特征。3. 學習描述菌落特征的方法。二、基本原理菌落形態(tài)是指某種微生物在一定的培養(yǎng)基上由單個菌體形成的群體形態(tài)。細菌、放線菌、酵母、霉菌和食用菌，每一種微生物在一定的培養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對的特征，利用觀察這些特征，來區(qū)分各大類微生物及初步識別、鑒定微生物，方法簡便快速，在科研和生產中常被應用。微

25、觀特征是鑒定微生物種類的主要依據，通過顯微觀察可以了解四大類微生物的主要特征。三、器材圓褐固氮菌或大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，灰色鏈霉菌，釀酒酵母，青霉或其它霉菌，平菇或其它食用菌菌絲體。載玻片，蓋玻片，無菌水滴瓶，酒精燈，接種環(huán)、接種鉤、顯微鏡等。四、操作步驟1. 菌落形態(tài)觀察觀察比較圓褐固氮菌或大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、灰色鏈霉菌、釀酒酵母、青霉或其它霉菌、平菇或其它食用菌菌絲體在平板培養(yǎng)基上形成的菌落特征，按照下列菌落描述的方法記錄結果。（1）大小：大、中、小?；蛴檬纸徊娣y量菌落直徑。（2）形態(tài)：圓形、不規(guī)則形。（3）干濕：干燥、濕潤、粘稠。（4）高度：扁平、隆起、凹下。（5）透明度：透明

26、、半透明、不透明。（6）顏色：白色、乳白色、黃色、金黃色、綠色、紅色、褐色等。中間與邊緣有無區(qū)別。（7）邊緣：整齊、不整齊。2. 菌落微觀形態(tài)觀察（1）取細菌固定玻片，用油鏡觀察細菌的形態(tài)。（2）取放線菌固定玻片，用低倍鏡和高倍鏡觀察放線菌的形態(tài)。（3）取酵母菌固定玻片，用低倍鏡和高倍鏡觀察放線菌的形態(tài)。（4）取青霉或黑曲霉固定玻片，用低倍鏡和高倍鏡觀察其菌絲和分生孢子梗的形態(tài)。（5）挑取少量平菇或其它食用菌的菌絲體，用低倍鏡和高倍鏡觀察其形態(tài)，觀察有無鎖狀聯(lián)合。邊觀察，邊用鉛筆繪圖。左眼觀察視野，右眼觀察圖紙。實驗六 細菌和放線菌培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產

27、物的營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究目的不同，所以培養(yǎng)基種類很多。培養(yǎng)基可以為微生物生長、繁殖提供充足的水分、碳源、氮源、能源、無機鹽和生長因子等，不同微生物對pH要求不同，酵母和霉菌一般的培養(yǎng)基一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養(yǎng)基一般是偏堿性的，所以配制培養(yǎng)基時需要調整pH值。根據培養(yǎng)基的成分不同，培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基；根據培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可以分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；根據培養(yǎng)基的用途可以分為基礎培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。本實驗主要學習制備培

28、養(yǎng)細菌和放線菌的2種培養(yǎng)基。一、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細菌用）（一）目的要求1. 明確培養(yǎng)基的配制原理。2. 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。（二）基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普遍的細菌基礎培養(yǎng)基，由于這種培養(yǎng)基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，培養(yǎng)基中的牛肉膏主要為微生物生長提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機鹽，瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下（1.5%2%）下96時溶化，在45時凝固，通常不被微生物分解利用。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。牛肉膏蛋白胨

29、培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g瓊脂 20g水 1000mLpH 7.47.6（三）器材1、溶液或試劑：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl。 2、儀器或其它用具：試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝裝置，天平，藥匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0），棉花，報紙或牛皮紙，記號筆，線繩或尼龍繩，紗布等。（四）操作步驟1. 稱量 按照培養(yǎng)基配方比例依次稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。注意牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或培養(yǎng)皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯；蛋白胨易吸潮，在稱取時動作要迅速；嚴防藥品混雜

30、，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈插干，再稱取另一種藥品。瓶蓋也不要蓋錯。2. 溶化 在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然好在石棉網上加熱使其溶解，或在磁力攪拌器上加熱溶解。將藥品完全溶解后，補充水到所需總體積，將稱好的瓊脂加入后，再加熱溶化。加熱時要用玻棒不斷攪拌，防止糊鍋或溢出。最后補足所損失的水分。如果是制備三角瓶盛固體培養(yǎng)基時，可以先將一定量的液體培養(yǎng)基裝入三角瓶，再按比例加入瓊脂，不必加熱溶化，而是加熱和溶化同步進行，節(jié)省時間。3. 調pH 先用精密試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙

31、測其pH，直至pH達到7.6。反之，用1mol/LHCl進行調節(jié)。 對于有些要求pH較精確的微生物或實驗，其pH的調節(jié)可以用酸度計進行。4. 過濾 趁熱用4層紗布過濾，以利某些實驗結果的觀察。一般沒有特殊要求的情況下，這一步可以省去（本實驗不需過濾）。5. 分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基裝入三角瓶或試管內。分裝試管時，分裝量為試管總長的1/51/4，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的量以不超過三角瓶容積的一半為宜。注意分裝速度要迅速，防止培養(yǎng)基凝固；不要將培養(yǎng)基濺到管（瓶）口，以免沾污棉塞而引起污染。6. 加棉塞 培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等）。棉塞要求松

32、緊適度，既能阻止外界微生物進入而引起污染，又能夠保證有良好的通氣性能。圖2.1 棉塞的制作過程示意圖正確地棉塞要求形狀、大小、松緊與試管口（或三角瓶口）完全適合，過緊則妨礙空氣流通，操作也不便；過松則達不到濾菌的目的。加塞時，大頭朝外，試管內塞入2/3，試管外留1/3。手提棉塞，試管不下落為不松，拔掉棉塞時不發(fā)出較大聲響為不緊。棉塞制作過程如圖2.1所示。三角瓶封口可以用棉塞，也可以用8層紗布重疊而成。7. 包扎 加塞后，取7支同樣規(guī)格的試管，棉塞頂端用雙層報紙或1層牛皮紙覆蓋，再用線繩或尼龍繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期等。三角瓶加塞后直接覆蓋雙層報紙或1層牛皮紙，用同樣的方法扎

33、好。8. 滅菌 將上述培養(yǎng)基在在壓力0.11MPa，溫度121條件下滅菌2030min。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。9. 擺放斜面 滅菌結束后，應使壓力自然降低至0時，打開鍋蓋，將鍋蓋錯開一條10幾cm的縫隙，利用鍋體余熱將報紙和棉塞烘干，然后去掉鍋蓋，當培養(yǎng)基溫度降至5060時取出，擺放斜面。將有棉塞的一端擱在玻棒或小木條上，斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。10. 無菌檢查 隨機抽取幾把冷卻凝固后的培養(yǎng)基，放在37的溫箱中培養(yǎng)2448h，以檢查滅菌是否徹底。二、高氏(Gause)1號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）（一）目的要求1. 明確培養(yǎng)基的配制原理。2. 掌握配制培養(yǎng)基的一

34、般方法和步驟。（二）基本原理 高氏1號培養(yǎng)基是分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是由可溶性淀粉（作為碳源），KNO3（作為氮源）、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O（作為無機鹽，提供鈉、鉀、磷、鎂、硫等離子）和FeSO4?7H2O(作為微量元素，提供鐵離子)等組成。由于磷酸鹽和鎂鹽相混合時產生沉淀，因此，在混合培養(yǎng)基成分時，一般是按配方的順序依次溶解各成分。對于象FeSO4?7H2O這樣的微量成分，則可預先配成高濃度的貯備液，在配制培養(yǎng)基時按需要加入一定的量。高氏1號培養(yǎng)基配方如下：可溶性淀粉 20 g KNO3 1 gNaCl 0.5 gK2HPO4?3H2O 0.

35、5 g MgSO4?7H2O 0.5 gFeSO4?7H2O 0.01 g瓊脂 20 g水 1000mLpH 7.47.6（三）器材可溶性淀粉，KNO3，NaCl，K2HPO4?3H2O，MgSO4?7H2O和FeSO4?7H2O，瓊脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl。 試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝裝置，天平，藥匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0），棉花，報紙或牛皮紙，記號筆，線繩或尼龍繩，紗布等。（四）操作步驟1. 稱量和溶化按配方先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。再稱取

36、其它各成分依次逐一溶化。對微量成分FeSO4?7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4?7H2O配成0.01g/mL，再在1000mL培養(yǎng)基中加入1mL的0.01g/mL的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，則先加入瓊脂溶化后再加其它物質。 2. pH 調節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同前。實驗七 真菌分離和培養(yǎng)用培養(yǎng)基的制備一、馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基（分離真菌用）（一）目的要求通過對分離真菌用的馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基配制，掌握對選擇培養(yǎng)基的配制方法，并明確選擇的原理。（二）基本原理馬丁氏培養(yǎng)基是

37、一種用來分離真菌的選擇性培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4?7H2O、孟加拉紅（玫瑰紅，Rose Bengal）和鏈霉素等組成。其中葡萄糖主要作為碳源，蛋白胨主要作為氮源，KH2PO4和MgSO4?7H2O作為無機鹽，為微生物提供鉀、磷、鎂離子。而孟加拉紅和鏈霉素主要是細菌和放線菌的抑制劑，對真菌無抑制作用，因而真菌在這種培養(yǎng)基上可以達到優(yōu)勢生長，從而達到分離真菌的目的。馬丁氏培養(yǎng)基配方如下：KH2PO4 1gMgSO4?7H2O 0.5g蛋白胨 5g葡萄糖 10g瓊脂 15-20g水 1000mLpH 自然此培養(yǎng)液1000mL加1%孟加拉紅1%水溶液3.3mL。臨用

38、時每100mL培養(yǎng)基中加入1%鏈霉素液0.3mL。（三）器材KH2PO4、MgSO4?7H2O、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、孟加拉紅、鏈霉素。試管、玻棒、鋁鍋、量筒、培養(yǎng)基分裝裝置、天平、藥匙、高壓滅菌鍋等。（四）操作步驟1、稱量和溶化 按培養(yǎng)基配方，準確稱取各成分，并將各成分依次溶化在少于所需要的水量中。待各成分完全溶化后，補足水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在1000mL培養(yǎng)液中加入1%的孟加拉紅溶液303mL，混勻后加入瓊脂加熱溶化。2、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同實驗六。3、鏈霉素加入 由于鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時將培養(yǎng)基溶化后待溫度降至45左右時才能加入。可先將鏈霉素配

39、成1%的溶液，在100mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3mL，使每mL培養(yǎng)基中含鏈霉素30微g。二、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（簡稱PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌用）（一）目的要求通過對培養(yǎng)真菌用的PDA培養(yǎng)基配制，掌握對半合成培養(yǎng)基的配制方法，并明確選擇的原理。（二）基本原理馬丁氏培養(yǎng)基是一種用來培養(yǎng)真菌的半合成培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基是由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂等組成。其中馬鈴薯煮汁可以提供碳源、氮源、無機鹽和維生素等，葡萄糖主要作為碳源，瓊脂為凝固劑。馬鈴薯的表皮中含有龍葵堿的化學成分，對菌絲生長有抑制作用，所以馬鈴薯在使用時要去皮。在PDA培養(yǎng)基上大多數(shù)真菌都可良好生長。在PDA 培養(yǎng)基基礎上，可以添加一些其它物質

40、，使培養(yǎng)基營養(yǎng)更為豐富和全面，真菌菌絲可以生長的更好。如綜合PDA培養(yǎng)基就是在PDA基礎上添加0.3%的KH2PO4和0.15%的MgSO4?7H2O以及微量的維生素B1而配制而成的。由于多數(shù)真菌喜歡偏酸性環(huán)境，而培養(yǎng)基滅菌過程中部分糖類會轉變?yōu)樗?，所以一般不需要調pH值。如果是培養(yǎng)對酸堿度有特殊要求的真菌，可以用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調節(jié)。PDA培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯（去皮） 200g葡萄糖 20g瓊脂 15-20g水 1000mLpH 自然（三）器材馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂等。小刀，試管、玻棒、鋁鍋、量筒、培養(yǎng)基分裝裝置、天平、藥匙、紗布、高壓滅菌鍋等。（四）操作步驟1. 馬鈴薯煮汁的制備將馬鈴薯

41、洗凈去皮，稱量200g，用小刀切成長、寬為2cm，厚度為35mm的土豆片，要求大小厚薄均勻。在1000mL水中煮沸1520min，煮至無白心為止。用46層紗布過濾，補充水分至1000mL。2. 葡萄糖和瓊脂的稱量與溶化稱取1520g瓊脂，加入土豆汁中，繼續(xù)加熱，并不斷攪拌，當瓊脂充分溶化后，加入葡萄糖，攪拌直至完全溶化。3. 分裝、加棉塞、捆把、滅菌及滅菌同前。 實驗八 微生物的液體培養(yǎng)一、基本要求1. 掌握微生物液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法。2. 了解常見微生物液體培養(yǎng)的原理和方法二、基本原理固體發(fā)酵生產是將原料及菌體吸附在疏松的固體支持物上，通過微生物的代謝活動，使發(fā)酵原料轉化成發(fā)酵產品。優(yōu)點

42、是設備簡單，不需要結構復雜的發(fā)酵罐；方法簡單，類似傳統(tǒng)的制曲法；能耗低，不需要大量通氣和攪拌；原料粗放，可用很多種其它發(fā)酵工藝無法利用的工農業(yè)副產品作原料；不易染菌，因霉菌能在水分較低的基質表面增殖而細菌不易生長；產物回收所消耗溶劑和所產生廢水較少。其缺點是：設備占地面積多，勞動強度大，傳質和傳熱困難，產率和收率低，副產物多，培養(yǎng)過程進行檢測困難。 液體發(fā)酵生產是將發(fā)酵原料制成液體培養(yǎng)基，接種微生物， 通過其代謝活動，使發(fā)酵原料轉化成發(fā)酵產品。液體發(fā)酵有表面發(fā)酵和深層發(fā)酵兩種方式，其中深層發(fā)酵是發(fā)酵生產的主要方式。表面發(fā)酵是在缺乏通氣裝置的情況下，對一些生長快速的微生物進行好氧靜置培養(yǎng)。這種發(fā)

43、酵通常在表面形成菌膜層。表面發(fā)酵的優(yōu)點是設備簡單，能耗低，原料粗放；其缺點是占地面積多，勞動強度大，發(fā)酵時間長。 深層發(fā)酵是微生物的菌體或菌絲均勻分散在液體培養(yǎng)基中，通過向培養(yǎng)液強制通氣或不通氣進行產物合成的發(fā)酵。深層發(fā)酵的優(yōu)點如下：占地面積小少，生產規(guī)模大；發(fā)酵速度快，生產效率高；生產機械化，易于自動控制，勞動生產率高；發(fā)酵設備密閉，傳熱傳質好，生產便于管理；有利于產品提取，所得產品質量高。其缺點是設備條件要求較高。搖瓶培養(yǎng)是一種在實驗室進行制種、菌種篩選、性能鑒定、培養(yǎng)基優(yōu)化時最常用到的一種試驗方法。特別是在菌種的生產中，液體發(fā)酵菌種有著明顯的優(yōu)點，菌齡一致，延滯期短，便于接種等優(yōu)點。三、

44、器材黑曲霉、裂褶菌、大腸桿菌 ；PDA液體培養(yǎng)基、肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基；250mL三角瓶；無菌水；搖床；超凈工作臺；紗布等。四、操作步驟 1. 菌種的活化：將斜面保存菌種活化12次，黑曲霉培養(yǎng)25d，使其產生孢子。圖2.2 液體接種操作示意圖方法一：將裂褶菌斜面菌種活化23次，取培養(yǎng)4d的斜面菌種刮取菌苔，用無菌生理鹽水進行稀釋成菌懸液，備用。方法二：將活化菌種接種子液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，再轉接到發(fā)酵液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)6d。2. 黑曲霉菌懸液的制備：用無菌水洗下黑曲霉的孢子制成菌懸液。然后吸取2mL如圖2.2所示接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。3. 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 各組實驗均取250mL錐形瓶若干，編號后，分

45、別加入上述搖瓶培養(yǎng)基80mL于0.8 kg/cm2滅菌20min，冷卻后分別接種種子液5mL；培養(yǎng)溫度24；靜置培養(yǎng)1d后，振蕩培養(yǎng)68d，搖床轉速180rpm/min.4. 觀察與測定（1）菌絲體干重的測定 收取的發(fā)酵醪以2500rpm離心或過濾獲得菌絲球，70烘干至恒重，以每100mL發(fā)酵醪中菌絲體干重（g/100mL）計。（2）菌絲和菌絲球的觀察 觀察菌絲球生長情況，大小、質地、顏色、內部情況。挑取菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲生長情況。（3）染菌檢測 觀察發(fā)酵液的色澤、氣味、固液相狀況；培養(yǎng)液涂片，Loffler堿性美藍單染色，鏡檢。同時，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)2448h檢查染菌菌落。實驗

46、九 微生物的分離與純化一、實驗目的掌握倒平板的方法和幾種分離純化微生物的基本操作技術二、基本原理 在土壤、水、空氣或人及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。 為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合倒平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到

47、純菌株。 土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物無論是數(shù)量和種類都是極其多樣的，因此，土壤是我們開發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。三、器材 高氏1號瓊脂培養(yǎng)基，肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，盛9mL無菌水的試管，盛90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，10酚，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素，土樣等。四、操作步驟1. 稀釋涂布平板法（1）倒平板 將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至5560時，向高氏1號瓊脂培養(yǎng)基中加入10酚數(shù)滴，向馬丁氏培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液，使每mL培養(yǎng)基中含鏈霉素30g。然

48、后分別倒平板，每種培養(yǎng)基制三皿，其方法是右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果試管內或三角燒瓶內的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管(瓶)口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15mL，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻后制成平板，最好是將平板放室溫23d，或23培養(yǎng)24h，檢查無菌落及皿蓋無冷凝水后再使用。（2）制備土壤稀釋液 稱取土樣10g，放入盛

49、90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1mL無菌吸管從中吸取1mL土壤菌懸液注入盛有9mL無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1mL無菌吸管從此試管中吸取1mL注入另一盛有9mL無菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。（3）涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5、10-6三種稀釋度，然后用三支1mL無菌吸管分別由10-4、10-5、10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.2mL對號放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂布棒在培養(yǎng)基表

50、面輕輕的涂布均勻，如圖2.3所示。圖2.3 從土壤中分離微生物的操作過程示意圖（4）培養(yǎng) 將高氏1號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28溫室中培養(yǎng)35d，肉膏蛋白胨平板倒置于37溫室中培養(yǎng)23d。（5）挑菌 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28 和37溫室中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。整個分離過程見圖2. 稀釋混合平板法 此法與稀釋涂布平板法基本相同，無菌操作也一樣，所不同的是先分別吸取0.5mL10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液對號放入平

51、皿，然后再倒入溶化后冷卻到45左右的培養(yǎng)基，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養(yǎng)基混合均勻，待冷凝成平板后，分別倒置于28和37溫室中培養(yǎng)后，再挑取單菌落，直至獲得純培養(yǎng)。3. 平板劃線分離法（1）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培養(yǎng)基名稱。（2）劃線 在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-1的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。常用的劃線方法有下列兩種： 用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線34條，再轉動培養(yǎng)皿約70角，并將接種環(huán)剩余物燒掉，待冷卻后通過

52、第一次劃線的部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線的部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線的部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。 將挑取有樣品的接種環(huán)再平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養(yǎng)。（3）挑菌 同稀釋涂布平板法，一直到菌分純?yōu)橹埂嶒炇?微生物大小測定及直接計數(shù)一、基本要求1. 掌握利用顯微測微尺測量微生物大小的基本方法。2. 掌握使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的基本方法。二、基本原理1. 大小測定的基本原理微生物細胞大小，是微生物的基本形態(tài)特征之一。由于菌體很小，只能在顯微鏡下測量。用來測定微生物大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺（

53、圖2.4）。圖2.4 鏡臺測微尺鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片。一般將1mm等分為100格（或2mm等分為200格），每格長度等于0.01mm（即10m）。是專用于校正目鏡測微尺每格長度的。目鏡測微尺是一塊可放在目鏡內隔板上的圓形小玻片，其中央刻有精確的刻度，有等分50小格或100小格兩種，每5小格間有1長線相隔。由于所用接目鏡放大倍數(shù)和接物鏡放大倍數(shù)的不同，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度也就不同。因此，目鏡測微尺不能直接用來測定微生物的大小，在使用前必須用靜態(tài)測微尺進行校正，以求得在一定放大倍數(shù)的接目鏡和接物鏡下該目鏡測微尺每小格的相對值，然后才可用來測定微生物的大小。2. 基

54、本原理圖2.5 血球計數(shù)板構造圖用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常見的微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點是直觀、快捷。將經過適當稀釋的菌懸液（或孢子懸浮液）放在血球計數(shù)板載玻片和蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的（0.1mm3），所以可以根據在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。血球計數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構成3個平臺。中間的平臺又被一短橫槽橫隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網cm9個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。微生物的計數(shù)就在計數(shù)室中進行。

55、血球計數(shù)板的構造見圖2.5。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格，而每個中方格又分為25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分為16個小方格，（圖2.5CD）。但無論是哪種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的，即1625=400小方格（見圖2.5D）。每一個大方格邊長為1mm，則每個大方格的面積為1 mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片和蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1 mm3。在計數(shù)時，通常數(shù)5個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上16或25，就得到一個大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1mL菌液中的總菌數(shù)。下面以一個大方格有25個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設5個中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么1個大方格中的總菌數(shù)（即0.1 mm3中的總菌數(shù)為A/525B。因 1mL=1cm3=1000mm3，故 1mL菌液中的總菌數(shù)=A/525101000B =50000A?B（個）同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，設