基因組測(cè)序基本原理

1、基因組測(cè)序基因組測(cè)序生物信息系列講座之二大綱I. 核酸DNA的發(fā)現(xiàn)以及測(cè)序歷史簡(jiǎn)介II. 雙脫氧化(Sanger dideoxy method)測(cè)序III.大片段的DNA測(cè)序與基因組測(cè)序的大發(fā)展VI.人類基因組V. 1000美元個(gè)體化基因組測(cè)序計(jì)劃(The “$1,000 dollar genome)On WebCT- “The $1000 genome”- review of new sequencing techniques by George ChurchPart I.核酸測(cè)序原理核酸發(fā)現(xiàn)與測(cè)序簡(jiǎn)史MC chapter 12DNA測(cè)序的簡(jiǎn)史DNA測(cè)序的方法A.雙脫氧法 (Sanger d

2、ideoxy) (primer extension/chain-termination) method: 最流行也是最廣為接受的方法。B.Maxam-Gilbert化學(xué)剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tediousC.焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing): measuring chain extension by p

3、yrophosphate monitoring。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便，可以快速、準(zhǔn)確地確定DNA序列。Single stranded DNA5353Sanger 雙脫氧測(cè)序原理a) 常規(guī)的PCR，粘附(Anneal)Sanger 雙脫氧測(cè)序原理b) 在延伸的時(shí)候?qū)NA聚合酶與加入正常的dNTP，同時(shí)摻入少量的雙脫氧的ddNTP53DNA聚合酶延伸方向Sanger 雙脫氧測(cè)序原理5353TTTTddAddAddAddA以ddATP為例，可以看到在反應(yīng)中帶有T的模板被摻入的互補(bǔ)的ddATP隨機(jī)停止。因?yàn)閐dATP不能

4、夠再使其主鏈延伸。如何讀取這些DNA片段？ 同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記的引物 (如 32P)同位素標(biāo)記的dNTPs (如35S 或者 32P) 熒光標(biāo)記化學(xué)合成時(shí)帶有熒光素標(biāo)記的ddNTPs被摻入到反應(yīng)中。每一種ddNTP都帶有自身特定的熒光波長(zhǎng)以便于觀測(cè)測(cè)序結(jié)果分析目前一般采用凝膠電泳法分析-能夠比較好的將每一條dNTP產(chǎn)生的DNA條帶分離開。DNA測(cè)序膠: 老方法利用電泳或者放射自顯影的方法來分析DNA序列在反應(yīng)中加入不同的ddNTP得到結(jié)果帶有同位素標(biāo)記的引物或者ddNTP被摻入到反應(yīng)中，以便于觀測(cè)自動(dòng)測(cè)序儀輸出DNA測(cè)序的實(shí)例樣本 一個(gè)帶有28個(gè)DNA樣品的膠圖: 綠帶：堿基A，,藍(lán)帶 C,

5、 黃帶G，紅帶 T. 越小的片段跑得越快自動(dòng)測(cè)序儀/sci/techresources/Human_Genome/publicat/hgn/v10n3/images/megabaces.jpg測(cè)序的趨勢(shì)相對(duì)而言一般很少實(shí)驗(yàn)室會(huì)自己做測(cè)序，一則自身測(cè)序費(fèi)用比較高，而且熒光試劑容易粹滅，同時(shí)也比較消耗時(shí)間，另外可能出現(xiàn)一些其它問題引起結(jié)果不成功。所以大部分的測(cè)序都是送到相關(guān)的測(cè)序中心或者公司完成:-下面這個(gè)序列就是一個(gè)自動(dòng)測(cè)序儀記錄的一段DNA片段Part II.大片段DNA測(cè)序與基因組測(cè)序的大發(fā)展19蜜蜂基因組是如何獲得的？基因組文庫(kù)的建立 目前基將基因組片段

6、打碎建立文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。Page 22酵母人工染色體酵母人工染色體(YACs) 200-1000 kbBacteriophage P1 90 kbCosmids 40 kbBacteriophage l l 9-23 kb質(zhì)粒(2-6 kb)Page 23大片段載體大片段載體Lambda phage 插入大小: 2030 kbCosmids 插入大小: 3545 kbBACs and PACs (bacterial and P1 artificial chromosomes (Viral) respectively) 插入大小: 10030

7、0 kbYACs (yeast artificial chromosomes) 插入大小: 2001,000 kbPage 24大片段插入載體大片段插入載體 Lambda 噬菌體 以及 cosmids 插入穩(wěn)定 但插入片段的容量可能不足以做大規(guī)模的測(cè)序 YACs 能夠插入大片段 但不太穩(wěn)定，比較難實(shí)際操作Page 25BACs and PACs BACs and PACs 大規(guī)模測(cè)序通用質(zhì)粒 對(duì)插入片段大小比較合適，而且容易使用 與其它正常質(zhì)粒一樣能夠擴(kuò)增和分離全基因組鳥槍法測(cè)序 但是片段比較大時(shí)，如在基因組測(cè)序時(shí)，僅僅由Sanger方法并不合適，因此Shotgun測(cè)序，將基因大片段打碎后測(cè)序

8、。鳥槍法戰(zhàn)略（Shotgun Strategy）又稱隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略，是由美國(guó)塞萊拉遺傳公司創(chuàng)始人克雷格文特爾發(fā)明，主要針對(duì)大片段的全長(zhǎng)測(cè)序。因?yàn)檎麄€(gè)基因組太長(zhǎng)而每次只能測(cè)得一個(gè)500的小片斷(read)。鳥槍法測(cè)序步驟 第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫(kù)?？寺?shù)要達(dá)到一定數(shù)量，即經(jīng)末端測(cè)序的克隆片段的堿基總數(shù)應(yīng)達(dá)到基因組5倍以上。 第二，高效、大規(guī)模的末端測(cè)序。 第三，序列集合。 第四，填補(bǔ)缺口。鳥槍法測(cè)序簡(jiǎn)要SIZE SELECTSHEAR鳥槍法測(cè)序技術(shù)LIGATE & CLONESEQUENCE550bpPage 30重疊群重疊群Contigs 重疊群是指一組相

9、互重疊的染色體DNA序列 如何建立重疊群基因克??？ For sequencing one wants to create “minimum tiling path” Contig of smallest number of inserts that covers a region of the chromosome基因組genomic DNA重疊群contig最小路徑minimumtiling pathPage 31限制性酶切產(chǎn)生不同的重疊群限制性酶切產(chǎn)生不同的重疊群Contigs 通過限制性內(nèi)切酶酶切 將重疊片段序列排列 直到建立一個(gè)完整的contig兩種不同的全基因組鳥槍法測(cè)序序列拼接與組

10、裝 獨(dú)立的測(cè)序片段(read)通過逐步把它們拼接起來形成序列更長(zhǎng)的重疊群(Contig)，直至得到完整序列的過程稱為重疊群裝配(Scaffold)。目前DNA 序列拼接應(yīng)用的主要軟件是由美國(guó)華盛頓大學(xué)Phil Green實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的Phred Phrap Consed系統(tǒng)。目前36個(gè)國(guó)家900 多個(gè)實(shí)驗(yàn)室都在使用上述系統(tǒng)。非贏利研究機(jī)構(gòu)或個(gè)人可申請(qǐng)免費(fèi)利用該系統(tǒng)。此外還有一序列的商業(yè)軟件，如主流的基因組拼接軟件（GenomeAssembly），華大基因開發(fā)的SOAPdenovo都可以做基因組的拼接，然后可以用補(bǔ)漏軟件進(jìn)行補(bǔ)漏，得到完整的基因組序列?；蚪M基因組de novo測(cè)序測(cè)序 基因組de

11、 novo測(cè)序也叫做基因組從頭測(cè)序，是指不依賴于任何已知基因組序列信息對(duì)某個(gè)物種的基因組進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用生物信息學(xué)手段對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接和組裝，最終獲得該物種基因組序列圖譜。De novo基因原理淺解 假設(shè)有原始序列：I did not know what is written in this paper.那么通過de novo分段重復(fù)測(cè)序得到了3次不同的結(jié)果。 測(cè)序結(jié)果1：id idn otkn owwh ati swr itteni nthisp aper 測(cè)序結(jié)果2: idid notkn owwha tiswrrit enin th isp ap er 測(cè)序結(jié)果3: i di dno

12、 tkno ww hati swri tteni nth ispap er 將3次重疊(overlap)部分進(jìn)行拼接組成contig(重疊群) idn otkn owwhidid notkn owwha dno tkno wwididnotknowwha (Contig)De novo測(cè)序原理mapping測(cè)序 通過現(xiàn)有的已知同源主鏈序列，將同源測(cè)序片段組裝拼裝，建立新序列。該序列與的主鏈類似，但不一定相同。測(cè)序?qū)嶒?yàn)室測(cè)序?qū)嶒?yàn)室39組裝缺口測(cè)序缺口測(cè)序缺口- 我們?nèi)绻呀?jīng)知道重疊群的順序和方向，那么可以通過跨越式測(cè)序得到缺口的序列信息。物理缺口物理缺口- 沒有重疊群覆蓋，同時(shí)也沒有DNA測(cè)序結(jié)

13、果 測(cè)序缺口物理缺口重復(fù)序列干擾鳥槍法測(cè)序拼接41重復(fù)序列REPEATS重復(fù)序列 真核生物染色體基因組中重復(fù)出現(xiàn)的核苷酸序列。這些序列一般不編碼多肽，在基因組內(nèi)可成簇排布，也可散布于基因組。重復(fù)序列的屏蔽軟件重復(fù)序列的屏蔽軟件 CENSOR是一個(gè)通過參考序列篩選查詢序列中的重復(fù)序列并屏蔽同源重復(fù)序列的軟件工具，其能夠?qū)⑺姓业降闹貜?fù)生成報(bào)告以及分類CENSOR也可提供離線軟件包Repeat masker RepeatMasker通過已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的重復(fù)元素篩選FASTA格式的查詢序列，并返回一個(gè)屏蔽之后的可以用于準(zhǔn)備數(shù)據(jù)庫(kù)檢索查詢序列的DNA序列。Repeat masker的離線軟件包的離線軟件

14、包兩種屏蔽方法的差別兩種屏蔽方法的差別 Repeatmasker用法類似于CENSOR，但這兩個(gè)工具各自有自身的優(yōu)點(diǎn)，在于他們的數(shù)據(jù)庫(kù)選取中有差異，如果要確保數(shù)據(jù)更加可信。所以同時(shí)用兩個(gè)工具或者與與其他類似的工具組合使用。48一些錯(cuò)配的重復(fù)序列 a b c a c b a b c d I II III I II III a b c d b c a b d c e f I II III IV I III II IV a d b e c f a collapsed tandemexcisionrearrangement人類基因組計(jì)劃 人類基因組計(jì)劃 (英語：Human Genome Project

15、, HGP）是一項(xiàng)規(guī)模宏大，跨國(guó)跨學(xué)科的科學(xué)探索工程。其宗旨在于測(cè)定組成人類染色體（指單倍體）中所包含的30億個(gè)堿基對(duì)組成的核苷酸序列，從而繪制人類基因組圖譜，并且辨識(shí)其載有的基因及其序列，達(dá)到破譯人類遺傳信息的最終目的。人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)/projects/genome/guide/human//http:/hgpd.lifesciencedb.jp/cgi//index.html個(gè)體化基因組測(cè)序計(jì)劃 已有的研究表明，基因或基因組變異是腫瘤發(fā)生的根本原因，利

16、用單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)獲取的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行更為精確和深入的分析，了解癌細(xì)胞的基因如何突變，以及腫瘤的來源、屬于哪種基因型等，為早期檢測(cè)和診斷腫瘤和腫瘤的個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。 而基因分析是個(gè)體化醫(yī)療的前提，因此個(gè)體化的基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展能夠驅(qū)動(dòng)著個(gè)體化醫(yī)療的進(jìn)程。乳腺癌患者全基因組測(cè)序 2012年歐洲內(nèi)科腫瘤學(xué)會(huì)（ESMO）研究者首次完成了對(duì)個(gè)體的乳腺癌患者全基因組測(cè)序以期制定個(gè)體化治療的大型臨床試驗(yàn)。 截至2012年9月23日，共有 402名乳腺癌患者已經(jīng)完成了這項(xiàng)檢測(cè)，還有26名患者分析正在進(jìn)行中。276名患者得到了基因組檢測(cè)結(jié)果，其中248例進(jìn)行了完整的全基因組分析。 Andr博士說，在172例患者中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能作為抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的基因組改變。有趣的是，20%的患者表現(xiàn)出一個(gè)罕見和意料之外的基因組改變