系統(tǒng)原理應(yīng)用及發(fā)展學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1第一頁，共28頁。1 CRISPR-Cas概述概述(i sh)u1987年，日本大阪大學(xué)（年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對一種細(xì)菌編碼）在對一種細(xì)菌編碼(bin m)的堿性磷酸酶（的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個）基因進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼基因編碼(bin m)區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。特有的序列。u2013

2、以后，研究者們在包括以后，研究者們在包括science和和nature biotechnology等等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。第1頁/共27頁第二頁，共28頁。1 CRISPR-Cas概述概述(i sh)CRISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)指導(dǎo)Cas蛋白對蛋白對靶向基因靶向基因(jyn)進(jìn)行修飾的技術(shù)。進(jìn)行修飾的技術(shù)。第2頁/共27頁第三頁，共28頁。CRISPR-C

3、as主要由兩部分主要由兩部分(b fen)組成：組成：識別識別(shbi)(shbi)切割切割(qig)(qig)1 CRISPR-Cas概述概述第3頁/共27頁第四頁，共28頁。1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(jigu)CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個特殊的是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族, 廣泛分布廣泛分布(fnb)于于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR 位點通常由短的高度保守的重復(fù)位點通常由短的高度保守的重復(fù)序列序列(repeats) 組

4、成組成, 重復(fù)序列的長度通常重復(fù)序列的長度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間重復(fù)序列之間被被 2672 bp 間隔序列間隔序列(spacer)隔開。隔開。CRISPR就是通過這些間隔序就是通過這些間隔序列（列（space）與靶基因進(jìn)行識別。）與靶基因進(jìn)行識別。第4頁/共27頁第五頁，共28頁。1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(jigu)第5頁/共27頁第六頁，共28頁。1.2 Cas家族家族(jiz)Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對靶位點進(jìn)行切割。它與引導(dǎo)下

5、對靶位點進(jìn)行切割。它與folk酶功能酶功能(gngnng)類似，但類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。第6頁/共27頁第七頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(tnggu)對入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識別，利用對入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識別，利用Cas蛋白進(jìn)行蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。切割，從而達(dá)到對自身的免疫。第7頁/共27頁第八頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)的發(fā)

6、現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)第8頁/共27頁第九頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)第9頁/共27頁第十頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)的的發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對外源系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對外源DNA特異性免疫特異性免疫, 而而這種特異性是由間隔序列（這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了CRISPR 介導(dǎo)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRI

7、SPR 間隔序列的動態(tài)間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加性變化，即通過增加(zngji)或刪除間隔序列（或刪除間隔序列（spacer）來實現(xiàn)的。）來實現(xiàn)的。第10頁/共27頁第十一頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)靶向要求靶向要求最主要最主要(zhyo)的要求：的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。第11頁/共27頁第十二頁，共28頁。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)靶向靶向要求要求 在人類在人類(rnli)基因組中，平均每基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個就出現(xiàn)一個NGG PAM。第12頁/共27頁第十三頁，共28

8、頁。2 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)靶向靶向要求要求第13頁/共27頁第十四頁，共28頁。3 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)介導(dǎo)基因修介導(dǎo)基因修飾飾第14頁/共27頁第十五頁，共28頁。3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯介導(dǎo)編輯(binj)模板替換模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系統(tǒng)用設(shè)計好系統(tǒng)用設(shè)計好的的DNA模板替換的相應(yīng)

9、模板替換的相應(yīng)(xingyng)基因來達(dá)到基因的定向修飾?；騺磉_(dá)到基因的定向修飾。第15頁/共27頁第十六頁，共28頁。3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯介導(dǎo)編輯(binj)模板替換模板替換第16頁/共27頁第十七頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用一文中，作者利用(lyng)人工合成的人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)能指導(dǎo)Cas9

10、內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。第17頁/共27頁第十八頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾第18頁/共27頁第十九頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾第19頁/共27頁第二十頁，共28頁。3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾Cas9sg-RNA第20頁/共27頁第二十一頁，共28頁。 2013年年2月月15日在日在science上發(fā)表的上發(fā)表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一個一文中

11、，作者利用一個(y )包含兩個靶向不同基因的包含兩個靶向不同基因的spacers的的crRNA實現(xiàn)了同時對兩個基因?qū)崿F(xiàn)了同時對兩個基因進(jìn)行編輯。進(jìn)行編輯。3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 第21頁/共27頁第二十二頁，共28頁。3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 第22頁/共27頁第二十三頁，共28頁。4 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)前景分析前景分析 這是一項靶向基因修飾的革新這是一項靶向基因修飾的革新(gxn)技術(shù)，一項極具有可技術(shù)，一項極具有可能獲得諾貝爾獎技術(shù)。能獲得諾貝爾獎技術(shù)。第23頁/共27頁第二十四頁，共28頁。4 CRI

12、SPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)前景分析前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上發(fā)表上發(fā)表(fbio)的的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用一文中，作者利用TALENs和和CRISPRs對同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為對同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。第24頁/共27頁第二十五頁，共28頁。4 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)前景分析前景分析

13、而且從實際應(yīng)用的角度來說，而且從實際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比比TALENs更容易更容易(rngy)操作，因為每一對操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替換只需要替換20個核苷酸就行。個核苷酸就行。第25頁/共27頁第二十六頁，共28頁。4 CRISPR-Cas系統(tǒng)系統(tǒng)(xtng)前景分析前景分析u 只需合成一個只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋蛋白不具特異性。白不具特異性。u 編碼編碼sgRNA的序列不超過的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZFNs更簡單方便。更簡單方便。u 較短的較短的sgRNA序列也避免了超長、高度序列也避免了超長、高度(god)重復(fù)的重復(fù)的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥。編碼載體帶來的并發(fā)癥。技術(shù)(jsh)優(yōu)勢第26頁/共27頁第二十七頁，共28頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會