病毒和病毒成份的提純剖析

1、第十四章病毒和病毒成份的提純一、病毒的提純（一）沉淀法（二）層析法（三）兩相溶劑間分配系數(shù)法（四）紅細(xì)胞吸附法（五）電泳法（六）超速離心法（七）超濾法二、病毒蛋白亞單位的分離三、病毒脂質(zhì)的抽提四、病毒糖類的抽提一、病毒的提純所謂病毒提純,就是應(yīng)用各種物理、化學(xué)方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃縮的病毒樣品。病毒提純是病毒學(xué)研究的重要前提，病毒微細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究、病毒抗原蛋白的分離提純、病毒化學(xué)成分及其遺傳物質(zhì)DNA或RNA的詳細(xì)研究都需要高純度的病毒樣品。病毒純度只是一個(gè)相對的概念，很難有絕對的標(biāo)準(zhǔn)，通常以下幾點(diǎn)可以作為判定標(biāo)準(zhǔn)。1. 物理均一性測

2、定病毒樣品的物理均一性,是證明其純度的常用方法,包括電鏡檢查、病毒粒子沉降系數(shù)和擴(kuò)散常數(shù)及其在凝膠電泳、等電聚焦中的遷移率等。2. 病毒滴度與蛋白含量的比例測定病毒材料的感染力或其血清學(xué)反應(yīng)滴度與其蛋白含量的比例，也是一種通常采用的純度測定方法。病毒滴度對蛋白含量的比例越高,說明病毒的純度越高。3. 免疫學(xué)反應(yīng)免疫反應(yīng)單一而無非特異反應(yīng)，則說明病毒材料比較純凈。4. 結(jié)晶形成病毒粒子在十分純凈的情況下，經(jīng)?？梢孕纬山Y(jié)晶，但少數(shù)混有雜質(zhì)的病毒樣品亦可形成結(jié)晶，所以這也只是一個(gè)相對標(biāo)準(zhǔn)。病毒提純的主要依據(jù)和條件有:(1) 病毒只在活的細(xì)胞內(nèi)寄生、復(fù)制和增殖,要在病毒不失活的前提下，使之從細(xì)胞中釋放

3、出來，去除細(xì)胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被釋放到細(xì)胞外，可以從培養(yǎng)液或尿囊液中提純；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少數(shù)病毒釋放到細(xì)胞外，大量提純時(shí)必須首先裂解細(xì)胞，使病毒大量釋放。實(shí)驗(yàn)室常用凍融、研磨、高速搗碎、超聲波處理或高壓沖擊、中性去污劑裂解、蛋白酶解等物理和化學(xué)的方法。通過這些方法處理獲得的粗制的病毒懸液，其中常含有大量的細(xì)胞碎片，一個(gè)有效的方法是以20006000r/min離心3040分鐘，可除去90以上的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。(2) 病毒粒子實(shí)際上是大的蛋白顆粒，可以應(yīng)用提純蛋白質(zhì)的一些技術(shù)方法。(3) 對大小、形狀和

4、密度高度一致的病毒粒子,可以采用分級分離的技術(shù)。當(dāng)然不同的病毒，其生長特性及理化學(xué)性質(zhì)不同，因此提純方法也不盡一致。(一) 沉淀法主要是從稀的懸浮液中濃縮病毒，有中性鹽沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、皂土法和魚精蛋白沉淀法等。1. 中性鹽沉淀法病毒一般在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的組織培養(yǎng)液中加入等體積的飽和硫酸銨，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、雞新城疫病毒等。2. 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(PEG)為水溶性非離子型聚合物，具有各種不同的分子量，用于病毒沉的主要是分子量為20006000的PEG。將PEG配成50%左右的溶

5、液，或直接將固體PEG加于毒懸液中，使其達(dá)到所需濃度，通常在4°C攪拌過夜,然后離心使病毒沉淀°Tanncock（1985年）成功地用PEG濃縮了禽腦脊髓炎病毒。3. 有機(jī)溶劑沉淀法甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提純病毒,但乙醚、氯仿等脂溶劑對于具有脂質(zhì)囊膜的病毒具有破壞和滅活作用,故不適于這類病毒的濃縮提純。4. 等電點(diǎn)沉淀法病毒粒子在等電點(diǎn)時(shí),所攜帶的正電荷與負(fù)電荷相互中和,因而失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀。多數(shù)病毒的等電點(diǎn)在pH4.55.5之間，因此在pH36范圍內(nèi)均可沉淀，由于一部分細(xì)胞成份在等電點(diǎn)時(shí)亦發(fā)生沉淀,此法效果不太理想,但從感染的組織培養(yǎng)液中濃縮

6、病毒，可以獲得較好結(jié)果。應(yīng)用酸性范圍的等電點(diǎn)沉淀或分級沉淀病毒時(shí)，必須注意pH對病毒活性的影響及病毒粒子電荷與組織蛋白電荷的差異。5. 皂土法Girin（1989年）應(yīng)用皂土在酸性條件下（pH44.5）吸附輪狀病毒SAT1，再在堿性條件下（pH&5）,又使其洗脫下來,從而達(dá)到純化目的。6. 魚精蛋白沉淀法魚精蛋白為堿性蛋白，具有攜帶其它蛋白質(zhì)共沉淀的作用，能和直徑大于50nm的病毒共同沉淀而不影響病毒的感染力。當(dāng)向這種沉淀物加入lmol/LNaCl時(shí)，病毒又重新釋放到懸液中，而魚精蛋白仍然沉淀。直徑小于50nm的小型病毒則不與魚精蛋白共同沉淀。因此，可利用魚精蛋白去除病毒材料中直徑大于

7、50nm的異種蛋白質(zhì)。（二）層析法病毒粒子表面攜帶特定的電荷群，因此病毒對離子交換樹脂及類似的其它吸附劑具有親和性。利用吸附劑的層析法分為兩種，一種是正吸附法，即依據(jù)病毒粒子表面所攜帶的電荷進(jìn)行特異性吸附，然后用適當(dāng)濃度的離子溶液將病毒粒子解離回收；另一種是負(fù)吸附法，即只吸附組織或宿主細(xì)胞成份等非病毒蛋白，而讓病毒粒子通過。收集濾液后經(jīng)差速離心沉淀法回收病毒。由于各種病毒的大小和表面結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)不同，因此對吸附劑的親和性也有顯著的差異。1. 萄聚糖柱層析法將初步濃縮的材料，通過葡聚糖G-150或G-200柱層析，然后用0.020.15mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.6)洗脫，分部收集，測定2

8、80nm波長處的OD值，將含病毒的各部分相混合，再濃縮，透析之后，即可得到比較純凈的病毒，Nagano(1989年)用Sephacryls-1000柱層析純化了雞傳染性支氣管炎病毒。2. 凝膠層析法 磷酸鈣凝膠：這是病毒吸附層析法中較為常用的凝膠，由0.5mol/LCaCl2和0.5mol/LNa2HPO4溶液混合制備凝膠狀沉淀物。在中性條件下生成的凝膠稱為“brushite”，在堿性條件下生成的凝膠稱為羥基磷灰石(hydroxypatite)。兩者均用0.001mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，置于4°C45天，使它充分沉淀后應(yīng)用。 氫氧化鋅凝膠:是由7mol/L氨水與0.1mol/L醋

9、酸鋅溶液滴加混合(pH8.5)而制備的，在制備后數(shù)小時(shí)內(nèi)較穩(wěn)定，可作為吸附劑。Newton和Beris等將水泡性口炎病毒懸液與氫氧化鋅凝膠混合，使其形成復(fù)合體后沉淀，然后用0.08mol/LEDTA(pH8.5)解離病毒，獲得較好的回收量。 焦磷酸鎂凝膠:是由0.1mol/L焦磷酸鈉和0.1mol/Lmol/MgC，以2：10(體積)比例在室溫中緩慢滴加混合而獲得的較穩(wěn)定的焦磷酸鎂凝膠。西村等將牛痘病毒懸液同此凝膠混合，使病毒吸附于凝膠，然后用0.1mol/L鹽水洗2次，最后用0.3mol/L枸櫞酸鈉溶液解離病毒，將病毒較好地回收于水相中。3. 離子交換纖維素柱層析法離子交換層析適于分離幾乎所

10、有帶電荷的分子。通常有陰離子交換劑和陽離子交換劑兩種。某些病毒可以被離子交換劑經(jīng)離子鍵作用而吸附，通過改變平衡液的離子強(qiáng)度,使其再洗脫下來而達(dá)到純化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被DEAE纖維素吸附，可分別再用0.5mol/L和0.15mol/LNaCl溶液洗脫下來，從而得以純化。4. 親和層析法親和層析是一種特殊的吸附層析,基質(zhì)與待分離物具有特異的生物親和力。通常是將特異的抗體經(jīng)共價(jià)偶聯(lián)作用結(jié)合在配基上組成一種不溶性配基。當(dāng)相應(yīng)的抗原物質(zhì)通過固定配基裝成的層析柱時(shí)，即被吸附。隨后再改變實(shí)驗(yàn)條件，將其洗脫下來，達(dá)到純化的目的。該法是于80年代初期開始用于病毒的分離提純，不僅純度好，敏感，而且回收率N

11、jayou（1991年）應(yīng)用此法成功地提純了麻疹病毒。他們應(yīng)用猴抗麻疹病毒的IgG進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，獲得了高純度而有活性的病毒，回收率可達(dá)總回收成份的30。Rimmelzwaan（1987年）應(yīng)用犬細(xì)小病毒的中和性單克隆抗體親和層析，純化了細(xì)小病毒，經(jīng)SDSPAGE和ELISA鑒定，99%以上的雜蛋白被洗除，收獲了7090%的病毒抗原成份。（三）兩相溶劑間分配系數(shù)法該法主要原理就是高分子物質(zhì)以溶質(zhì)形式存在于兩相溶劑中，根據(jù)其分配系數(shù)的不同而選擇性地分配于其中的一方，從而達(dá)到純化的目的。所采用的溶劑主要有:葡聚糖硫酸鹽（DextranSulphate,DS）和聚乙二醇（PEG）或甲基纖維素（MC）和

12、聚乙烯醇（PVA），形成DsPEG系、DsPVA系和DsMC系。利用病毒在有機(jī)溶劑中的分配原理，在適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)和葡聚糖層之間進(jìn)行多次反復(fù)轉(zhuǎn)換，不僅能夠濃縮病毒，而且還可以純化病毒。通常是將兩相溶劑如DsPEG以適當(dāng)?shù)闹亓堪俜直然旌?，然后加入病毒液，?shù)次激烈振蕩混合，置于4°C2436小時(shí)，即可分離為兩層，病毒將特異地分布于其中一方（如Ds層中）。適當(dāng)改變?nèi)軇┑幕旌媳壤龝r(shí)，分配于Ds層中的病毒可由Ds層轉(zhuǎn)入PEG中，而得以濃縮。若調(diào)節(jié)適當(dāng)，一步就可濃縮100倍，兩步濃縮就可以達(dá)到10000倍。非病毒物質(zhì)通常以不同的方式進(jìn)行分配，從而達(dá)到濃縮純化的目的。Nammar（1991年）應(yīng)用D

13、sPVA系純化了反轉(zhuǎn)錄病毒。兩相溶劑間分配系數(shù)法簡單、溫和，并能使病毒得到較高的濃縮和純化。但是為了獲得高度純化的病毒，還需配合應(yīng)用其它方法。（四）紅細(xì)胞吸附法所謂病毒的紅細(xì)胞凝集反應(yīng)，就是指病毒被紅細(xì)胞表面粘蛋白吸附的現(xiàn)象。自Hirst發(fā)現(xiàn)流感病毒的紅細(xì)胞凝集性質(zhì)以來，隨后相繼發(fā)現(xiàn)其它一些動(dòng)物病毒也有紅細(xì)胞凝集性。Stanley證明，流感病毒在0C時(shí)被紅細(xì)胞吸附，而在37C時(shí)卻從紅細(xì)胞上脫離下來的性質(zhì)，從而將此方法應(yīng)用于病毒提純。我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用醛化雞紅細(xì)胞吸附馬流感病毒，取得較好效果。具體方法是:采取雞血，以無菌生理鹽水洗滌3次后制成壓積紅細(xì)胞。另取福爾馬林和生理鹽水等量混合，制成福爾馬林鹽

14、水。在2份福爾馬林鹽水中加入1份壓積紅細(xì)胞，充分振蕩15min,置28C冰箱內(nèi)48h,每天振蕩23次。屆時(shí)取出，再振蕩1次，后用700r/min離心510min,棄上清，再加20倍量生理鹽水，振蕩混合后置28C冰箱過夜。棄上清，加入20倍量生理鹽水，如上洗滌3次。取沉淀紅細(xì)胞，加入相當(dāng)于初次壓積紅細(xì)胞量的生理鹽水，混勻后即可應(yīng)用。將馬流感病毒感染的雞胚尿囊液，作2500r/min離心10min，吸取上清液。取保存于28C的病毒液100ml，加入28C的醛化紅細(xì)胞懸液6ml，充分振蕩15min，立即放入冰箱內(nèi)每2h振蕩1次，共23次，隨后置冰箱中過夜，待其自然沉淀。次日吸出上清，如其血凝價(jià)在1:

15、15以下，則證明已經(jīng)充分吸附，此時(shí)即可進(jìn)行釋放，否則需再補(bǔ)加醛化紅細(xì)胞懸液繼續(xù)吸附。在已充分吸附病毒的醛化紅細(xì)胞沉淀中，加入相當(dāng)于原病毒液1/10量的5mol/LNaCl溶液，充分振蕩，置37°C水浴中4h,每隔3060min振蕩1次。取出后立即以700r/min離心10min。吸取上清液，即為濃縮病毒液，必要時(shí)可對已釋放過病毒的醛化紅細(xì)胞作第二次釋放，方法同前。上述吸附-釋放方法，可將病毒濃度提高10倍左右（以血凝效價(jià)表示）。（五）電泳法先將病毒懸液對緩沖液透析。根據(jù)病毒的種類不同，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液，但離子強(qiáng)度不能超過0.3mol/L以上。病毒粒子依據(jù)其所攜帶的電荷，在電場中或向正

16、極，或向負(fù)極移動(dòng)，因此電泳結(jié)束后，分段收集病毒區(qū)帶部分，就能達(dá)到提純的目的。（六）超速離心法病毒粒子經(jīng)過初步濃縮之后，要進(jìn)一步純化，通常采用超速離心法，它是分離提純不同大小的病毒的有效方法之一。在應(yīng)用超速離心法沉淀病毒時(shí)，必須了解所用離心機(jī)的離心力。離心機(jī)由于轉(zhuǎn)頭的回轉(zhuǎn)產(chǎn)生了強(qiáng)大的離心力，這種離心力是隨轉(zhuǎn)頭的大小和離心管至轉(zhuǎn)軸中心的距離而變化的。高速和超速離心機(jī)的離心條件，有的以每分鐘速度（r/min）表示，有的則以離心力重力加速度g.（980cm/S2）為單位來表示。離心沉淀時(shí)，沉降速度與離心力有關(guān)。離心機(jī)轉(zhuǎn)速在4000r/min左右的稱為低速（普通）離心機(jī)；轉(zhuǎn)速至25000r/min左右的

17、稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速25000r/min以上的稱為超速離心機(jī)。高速和超速離心機(jī)裝有冷凍裝置和抽真空裝置，以保持離心腔中恒定的低溫，并減少轉(zhuǎn)頭運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)空氣的摩擦力。超速離心機(jī)有制備和分析用兩類，最近又生產(chǎn)出制備、分析及區(qū)帶連續(xù)離心三用裝置在一起的離心機(jī)，有的還帶掃描裝置。使用超速離心機(jī)的分離提純方法有三種:（1）差速離心法；（2）速度區(qū)帶離心法；（3）平衡密度梯度離心法（或等密度梯度離心法）。1. 差速離心法這是應(yīng)用較早的簡單方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差別的基礎(chǔ)上。具體做法是將被分離的樣品交替進(jìn)行低速離心與高速（或超速）離心。沉降速度差別在一個(gè)或幾個(gè)數(shù)量級的粒子，可用本法分離

18、提取。粒子大小、轉(zhuǎn)速與離心沉淀時(shí)間的關(guān)系，差速離心適用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細(xì)胞吸附-釋放的病毒懸液中提純病毒。在由感染細(xì)胞或組織勻漿中提取病毒時(shí)，由于與病毒大小相近的細(xì)胞亞單位及碎片的存在，提純效果不理想。差速離心法的優(yōu)點(diǎn)是能迅速處理大量樣品，故常作為病毒精制的第一個(gè)階段，或者用于病毒樣品的濃縮和粗提。以差速離心法分離提純病毒時(shí)，經(jīng)常以低速（20003000r/min,2030min）及中速（10000r/min,2030min）去除較大的宿主細(xì)胞碎片、污染的細(xì)菌及其他較大的雜質(zhì)。然后，選擇在60min內(nèi)能夠沉淀80%以上的病毒粒子的較高速度，離心12h，使病毒沉淀。對中、大型病

19、毒如流行性感冒病毒，在經(jīng)紅細(xì)胞吸附-釋放后，于25000r/min離心60min，即可達(dá)到目的。小型病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、披膜病毒，則需以3500045000r/min離心12h。高速或超速離心沉淀物，可用研磨和超聲波振蕩等方法打碎后懸浮于緩沖液中。對于非病毒雜質(zhì)較多的樣品進(jìn)行差速離心，由于病毒對沉淀物的非特異性吸附而有較多損失。2. 速度區(qū)帶離心法是根據(jù)被分離物質(zhì)在強(qiáng)大離心力中沉降速度不同而進(jìn)行的分離方法。該法使用的介質(zhì)密度應(yīng)該小于被分離物質(zhì)的密度。介質(zhì)可以為均一密度，也可以為梯度密度。當(dāng)被分離的物質(zhì)沉降到與介質(zhì)密度相等的區(qū)域時(shí)就不再沉降。不同分子形成不同的區(qū)帶，而稱為速度區(qū)帶。該法要求樣品

20、濃度為頂端濃度梯度的1/10，樣品體積為離心管體積的5%。常用的介質(zhì)有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒純化時(shí)，將病毒樣品溶液層加于密度梯度層的頂部，借助病毒粒子或其亞單位成分本身的浮密度差別，在離心力作用下降到密度相等的介質(zhì)層內(nèi)，最后排列成帶狀停留不動(dòng)。密度較小的粒子或成分停留在上面的幾層內(nèi)，密度較大的粒子或成分沉降于下面幾層內(nèi)。應(yīng)用密度梯度法，可以獲得相當(dāng)純凈的病毒樣品。病毒粒子或成分的沉降速度取決于其大小、形狀及比重，也取決于離心力及懸液介質(zhì)的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分離時(shí)最常應(yīng)用的材料，因其易溶于水，且對核酸及蛋白質(zhì)呈化學(xué)惰性。常用的梯度范圍從520%或1060%。除蔗糖濃度

21、連續(xù)梯度離心外，近來有人在兩層濃度梯度上層加病毒濃縮樣品，經(jīng)超速離心后將病毒收集于兩層界面處；也有人在單層蔗糖濃度溶液上層加病毒濃縮樣品，經(jīng)超速離心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。這兩種方法比較簡單，但濃縮提純的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如多層連續(xù)梯度法。3. 平衡密度梯度離心法平衡密度梯度離心法是根據(jù)粒子的浮密度不同而加以分離。所謂浮密度就是物質(zhì)的質(zhì)量減去在一定介質(zhì)中所受的浮力,亦稱有效密度。制備梯度的方法有兩種：一種是在飽和的CsCl溶液上面層加病毒樣品（容量比1:4）；另一種是將病毒樣品與CsCl濃溶液均勻地混合。一般用水平轉(zhuǎn)頭，經(jīng)較長時(shí)間的超速離心，在離心管中形成CsCl的濃度梯度，并由于離心力的作用，樣

22、品中的病毒粒子分布于相應(yīng)密度的區(qū)域內(nèi)。這種方法在分析離心中是最常用的。應(yīng)用本法時(shí)，離心轉(zhuǎn)頭的回轉(zhuǎn)數(shù)越高，離心時(shí)間越長，越能接近平衡狀態(tài)。平衡密度梯度離心法廣泛應(yīng)用于病毒和核酸的提純上。用平衡密度梯度離心法提純的動(dòng)物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型腦炎病毒、狂犬病病毒和馬傳貧病毒等。有的病毒在這些無機(jī)鹽類溶液中被破壞，可加入0.20.5%牛血清白蛋白，或用0.53.0%甲醛先將病毒粒子固定，然后進(jìn)行平衡密度梯度離心，常能較好地回收病毒。大多數(shù)病毒的浮密度在1.101.40范圍內(nèi)。所以制備密度范圍為1.01.7的懸浮介質(zhì)，便可滿足大多數(shù)病毒密度梯度離心的需要。4.密度梯度離心法的操作程序(1) 密

23、度梯度的制備:制備密度梯度的方法有不連續(xù)的(即人工操作)和連續(xù)的(即機(jī)械操作)密度梯度兩種。不連續(xù)的或分層的密度梯度的制備不連續(xù)的密度梯度是以人工操作法制備的，在一定溫度下(一般在20°C或在25°C)配制一系列濃度差為5%的梯度溶液，例如蔗糖可配制成5、10、15、20、25、30、35、40%(W/V)等溶液(用蒸餾水或適宜的緩沖液配制)，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取濃度最大的溶液注入離心管底，然后依次加入較低的各個(gè)濃度(40%5%),層覆蓋著一層地層加于離心管中，注意避免產(chǎn)生氣泡。假如各層界面被沖動(dòng)破壞，則應(yīng)重新制備。也可以將長針頭插入管底，依次從濃度低到高加

24、入各溶液。連續(xù)的密度梯度的制備為了產(chǎn)生一個(gè)連續(xù)的密度梯度，常用梯度混合裝置來制備梯度。梯度混合裝置由A和B管組成。兩管之間用雙通活塞聯(lián)結(jié)。在活塞關(guān)閉的狀態(tài)下，向A管中加入低濃度蔗糖溶液，向B管中加入高濃度的蔗糖溶液，兩管中容量要相等。在B管出口處用一根聚乙烯小管連接到離心管。在給B管充液時(shí)，可將聚乙烯小管的流出口向上轉(zhuǎn)動(dòng)，使之超過液體的水平面，從而阻止液體流出。充液后可將小管接到離心管中使之貼著管壁，然后開動(dòng)小攪拌器，使攪拌棒轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)打開兩管間活塞。這三個(gè)操作要同時(shí)進(jìn)行，以保證梯度的連續(xù)性。當(dāng)梯度液體自B管流出時(shí)不允許移動(dòng)離心管，待離心管中所盛的梯度溶液的體積達(dá)到需要量之后，將離心管小心地靜

25、止于4C12h，以平衡之?，F(xiàn)在不少“制備用超速離心機(jī)”攜帶有“密度梯度制備自動(dòng)裝置”。按照這個(gè)方法制備的蔗糖濃度梯度，理論上按公式計(jì)算。這些濃度梯度是根據(jù)樣品和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩鴮ｉT選用的。一般使用的濃度梯度范圍為20%-5%，40%-10%，或60%-10%等。(2) 加入樣品:用如上所述注射器或微量吸管吸取懸浮于適宜緩沖液中的病毒或核酸樣品(約梯度介質(zhì)體積的1/10容量)，從液面上方1mm處，緊貼著離心管壁輕輕層加于梯度介質(zhì)面上。(3) 高速或超速離心:將加入樣品的離心管裝入套管內(nèi)，也可將離心管置于轉(zhuǎn)頭的套管內(nèi)，以免在裝進(jìn)套管時(shí)震動(dòng)液體。擰緊套管螺帽，將套管吊在水平轉(zhuǎn)頭上，置于離心機(jī)內(nèi)。梯度離心一

26、般用高速或超速離心機(jī)。離心速度和時(shí)間，根據(jù)所分離的樣品選定。離心開始，樣品中各種粒子逐漸分離，分布于相應(yīng)的密度梯度層中成為帶狀(如為透明的聚碳酸酯離心管，則可以清楚地見到帶狀分離，并拍照)。離心時(shí)間到時(shí)，使離心機(jī)自然停止，不許制動(dòng)，以免破壞梯度。(4) 梯度的分段收集(取樣):在離心完了以后，為了把已分離物質(zhì)的各條帶分開，必須取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下幾種。 取代法：從離心管底部穿刺或?qū)чL針頭的注射器插入離心管底，使一種稠密的介質(zhì)，如6070%(W/V)蔗糖溶液，緩慢地注入于離心管底部。然后用一個(gè)注射器或移液管，從上面逐一移出各部分?；蛘咴陔x心管的頸部加上一個(gè)塞子，這個(gè)塞子附

27、著一根收集導(dǎo)管，通向一個(gè)部分收集器，收取各部分。 穿刺法：將離心管固定于特制的固定架上，在其底部裝上一個(gè)垂直向上的空心針穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小試管分段收集。超速離心機(jī)一般都帶有此裝置。此裝置的缺點(diǎn)是離心管在用一次后即廢棄。 虹吸法：此法的優(yōu)點(diǎn)是不必穿刺離心管，離心管可反復(fù)使用。經(jīng)我們多次試驗(yàn)，此法簡便易行，對梯度密度無破壞。用一根大穿刺針截兩段做虹吸管，以接上50100ml玻璃注射器進(jìn)行送氣的方法，分段收集梯度溶液。 注射器吸取法：用彎曲的針頭J狀)接在注射器上，從梯度最上層開始向下逐層小心吸取液體。5. 梯度各層液體的密度測定(1) 稱重量法：用10ul微量注射器吸取

28、樣品，加入于已知重量的毛細(xì)管中，在1/10萬分析天秤上稱重，計(jì)算重量(g/ml)，即為梯度溶液的密度。(2) 測定折射率法：用阿貝氏折光儀測定各梯度層溶液的折射率(25°C)。(3) 浮漂法：向已制備好的各種密度溶液中滴入一滴樣品，找出相應(yīng)的樣品浮密度溶液，即為該梯度層的密度。6. 各梯度分層液中病毒分布的鑒定(1) 以紫外分光光度計(jì)測定蛋白質(zhì)和核酸吸收峰。吸取各層梯度溶液，用蒸餾水或緩沖液適當(dāng)稀釋后，測定波長280和260nm的OD值。然后以各梯度層管號為橫坐標(biāo)，其OD值為縱坐標(biāo)畫曲線，即為各梯度層中蛋白質(zhì)-病毒含量圖，有些病毒260nm0D值較高。(2) 以各種血清學(xué)方法測定各梯

29、度層中病毒的抗原效價(jià)或用組織培養(yǎng)法測定病毒滴度，證實(shí)病毒分布區(qū)域。(3) 用電子顯微鏡負(fù)染法觀察病毒粒子及其純度。將各梯度層樣品裝入透析袋中，置于適宜的溶液中透析去鹽，然后取一滴樣品用蒸餾水稀釋，滴附于銅網(wǎng)膜上，用磷鎢酸負(fù)染后電鏡下觀察病毒粒子。（七）超濾法超濾法是利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮的一種方法。超濾膜的孔徑有多種，可根據(jù)被截留的分子大小而選擇。超濾法是濃縮大容量的病毒樣品的一種非常有效的方法，其優(yōu)點(diǎn)是可以在室溫或低溫下操作；對被濃縮的產(chǎn)物損害很?。粷饪s的同時(shí)可達(dá)到部分純化；如選擇合適的膜和操作參數(shù)，可達(dá)到很高的回收率；此外，超濾

30、系統(tǒng)可密封以防止外來污染。超濾系統(tǒng)目前主要有三種，即攪拌池式，淺道流動(dòng)系統(tǒng)和中空纖維系統(tǒng)。攪拌池式是一種最簡單的超濾系統(tǒng)，由超濾室及磁力攪拌器組成，通過正壓而使液體通過濾膜。此方法簡單，但濃縮樣品量有限，一般在2000ml以內(nèi)，而且濾膜孔易于堵塞。淺道流動(dòng)系統(tǒng)的特點(diǎn)是液體在膜表面的螺旋形淺道中流動(dòng)，液體與膜的接觸面積也大于攪拌池系統(tǒng)，因而濾過速度大為提高。中空纖維系統(tǒng)是由很多根空心纖維成束裝配而成，每根纖維即為一個(gè)微細(xì)管型膜，因此，其有效的膜面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前二個(gè)系統(tǒng)，濾過速度很快，適用于大體積的濃縮。二、病毒蛋白亞單位的分離病毒具有幾種以上的蛋白質(zhì),每一種蛋白質(zhì)通常都由分子量較小的許多相同的亞單

31、位組成。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白決定著病毒粒子的結(jié)構(gòu)及其與細(xì)胞受體部位結(jié)合的特異性。病毒的血清學(xué)特異性和酶活性也決定于蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)蛋白還有保護(hù)病毒核酸的作用核酸處于蛋白外殼的內(nèi)部，或與蛋白質(zhì)互相纏繞而成核蛋白。因此病毒基因組受到有關(guān)蛋白質(zhì)的保護(hù)，從而可以抵抗理化學(xué)因素的降解作用。蛋白質(zhì)構(gòu)成病毒質(zhì)量的大部分，病毒粒子內(nèi)的蛋白質(zhì)可以單獨(dú)地或與糖、脂類結(jié)合在一起，成為糖蛋白或脂蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以從提純的病毒制品中通過與核酸和其它蛋白分離,而又不打斷肽鍵的處理方法得到。分離時(shí)須用中性去污劑、極性試劑或阻止蛋白聚合的保護(hù)劑如尿素、鹽酸胍、去氧膽酸鈉和SDS等,或改變pH值等方法加以處理。三、病毒脂質(zhì)的抽提病毒

32、中有許多種脂類化合物，包括磷脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛及膽固醇等。病毒脂質(zhì)的主要成分是磷脂，它在許多病毒中具有結(jié)構(gòu)上的功能。病毒的磷脂就在囊膜中，它對病毒顆粒的結(jié)構(gòu)完整性是很重要的。這是因?yàn)楫?dāng)這類病毒用脂溶劑或某些磷脂酶處理后就顯著地喪失了感染性。病毒脂質(zhì)大部分來源于感染前就存在于宿主細(xì)胞的脂質(zhì)。病毒的有些脂質(zhì)與糖結(jié)合形成糖脂，有些脂質(zhì)與蛋白結(jié)合形成脂蛋白。抽提病毒脂類時(shí)最常用的溶劑系統(tǒng)是氯仿一甲醇。有人應(yīng)用此溶劑系統(tǒng)抽提SV5的病毒脂質(zhì),其方法是:(1) 取凍干的病毒樣品,用氯仿：甲醇：水=65：25：5的溶劑,在室溫下抽提二次,每次20min,接著在氮?dú)庀掠梅序v的溶劑抽提一次20min。(2) 合并抽提物,加入其1/6體積的水,混合后分為水相和有機(jī)相。如存在神經(jīng)節(jié)甙脂,則進(jìn)入到水相中,而其它全部脂質(zhì)仍留在有機(jī)相中。(3) 將這一部分溶劑移到旋轉(zhuǎn)器或蒸發(fā)器中,在氮?dú)庀买?qū)除有機(jī)溶劑,即獲得總的脂質(zhì)。四、病毒糖類的提取糖是所有病毒